韓達(dá)斌 韓曉萍

青海省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品審評(píng)中心(西寧810007)

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明目蒺藜丸中黃酮類物質(zhì)的HPLC指紋圖譜研究

韓達(dá)斌 韓曉萍△

青海省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品審評(píng)中心(西寧810007)

目的 ：建立明目蒺藜丸中總黃酮類物質(zhì)指紋圖譜測(cè)定的高效液相色譜(HPLC)方法，并對(duì)不同企業(yè)樣品進(jìn)行相似度分析。方法:樣品處理中采用聚酰胺柱色譜對(duì)明目蒺藜丸中的黃酮類成分進(jìn)行復(fù)集和純化，HPLC條件為Waters ATLANTIS-C18(4.6 mm×250mm,5μm)色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，以含有0.2%三乙胺的0.2%乙酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；流速1.0ml/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：指紋圖譜中標(biāo)示了14個(gè)共有峰，其峰面積之和大于總峰面積的90%，全部樣品的總黃酮指紋圖譜相似度在0.699～0.955范圍內(nèi)。結(jié)論：建立的方法能較好反映明目蒺藜丸中黃酮類物質(zhì)的存在情況。

明目蒺藜方最早收載于《飼鶴亭集方》、《同壽錄》卷二、《眼科臨癥筆記》，所載組藥味較少，后在此基礎(chǔ)上衍生出了由23味藥材組成的明目蒺藜方，見于《北京市中藥成方選集》, 用于上焦火盛引起的暴發(fā)火眼，云蒙障翳、羞明多眵、眼邊赤爛，紅腫痛癢，迎風(fēng)流淚。方中含有大量的含黃酮類物質(zhì)的藥材，如菊花、黃芩、蒺藜、密蒙花等，它具有清熱散風(fēng)，明目退翳之功效。為了更好地考察此組藥味中黃酮類物質(zhì)在明目蒺藜丸中的整體存在情況，比較不同生產(chǎn)企業(yè)之間樣品的差異性，較為全面地反映中藥復(fù)方的整體協(xié)同作用，全面確保其質(zhì)量安全有效[1-2]。本研究對(duì)明目蒺藜丸進(jìn)行了黃酮類組分的指紋圖譜[3]研究，結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定精密、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便、譜圖信息豐富，能全面地反映黃酮類物質(zhì)在明目蒺藜丸中的存在情況及不同企業(yè)用品之間的相似度差異。

1 材 料

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，色譜柱Waters ATLANTIS (4.6 mm×250mm,5μm)；HH-6溫控水浴鍋，超聲清洗器，數(shù)據(jù)分析軟件為國(guó)家藥典委員會(huì)2012年版中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)；菊花對(duì)照藥材(批號(hào)121384-201103)、黃芩對(duì)照藥材(批號(hào)120955-200607)、密蒙花對(duì)照藥材(批號(hào)121509-200501)、甘草等對(duì)照藥材(批號(hào)120904-2010015)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)110713-200911)、漢黃芩素對(duì)照品(批號(hào)111514-200403)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-200512)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-200111)、蒙花苷對(duì)照品(批號(hào)111528-200606)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；處方中23味藥材均購(gòu)自青海省西寧市八一路藥材市場(chǎng)(經(jīng)青海省食品藥品檢驗(yàn)所中藥室王慧春主任藥師檢定)；乙腈為色譜純，95%乙醇、無(wú)水乙醇、36%乙酸、三乙胺為分析純。

明目蒺藜丸樣品(2013年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，12個(gè)企業(yè))共計(jì)26批，來(lái)源及編號(hào)詳見表1。

表1 明目蒺藜丸取樣匯總

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters ATLANTIS十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(0.46cm×2.50cm,5μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以含有0.2%三乙胺的0.2%乙酸溶液為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為紫外210nm；色譜柱溫度35℃；進(jìn)樣量為10μL。以漢黃芩素峰計(jì)算理論板數(shù)不低于3000[4]。

表2 HPLC洗脫梯度

2.2 參照物的制備 精密稱定，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，混勻，每1ml分別含50μg的混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減輕的重量，搖勻，離心，精密吸取上清液20ml置于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，置于聚酰胺柱(30～60目，1.25g，內(nèi)徑為1.5cm，柱長(zhǎng)為15cm，干法裝柱)上，用水15ml洗脫，水液棄去，繼用95%乙醇20ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖既芙猓D(zhuǎn)移并定容至10ml量瓶中，濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)：精密稱取明目蒺藜丸，按“2.3項(xiàng)”制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，在“2.1項(xiàng)”的條件下進(jìn)行分析，比較各共有指紋的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明各批樣品中共有峰的保留時(shí)間和峰面積基本穩(wěn)定，其RSD<2%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求[5]。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一明目蒺藜丸的供試品溶液，在“2.1項(xiàng)”的色條件下分別在0、4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣分析，比較各共有指紋峰的保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果各共有峰的保留時(shí)間和峰面積基本一致，RSD<2%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取同一批明目蒺藜丸樣品5份，分別按“2.3項(xiàng)”制備成供試品溶液，在“2.1項(xiàng)”的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，比較各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD<2%，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求[6]。

2.5 共有峰的確認(rèn) 采用上述擬定的方法對(duì)25批樣品進(jìn)行HPLC指紋圖譜測(cè)定，并用鹽酸小檗堿和漢黃芩素進(jìn)行峰位確認(rèn)，同時(shí)用菊花、甘草、黃芩、旋復(fù)花、黃連等幾味對(duì)照藥材對(duì)HPLC圖譜中的峰進(jìn)行藥材歸屬和確認(rèn)，確定出黃酮類成分的指紋圖譜中較為明顯的14個(gè)共有峰，共有峰面積之和大于總峰面積的90%，其中峰9、峰11分別為鹽酸小檗堿和漢黃芩素的峰[7]。結(jié)果顯示峰3～峰5信息主要來(lái)自黃芩和甘草；峰6～峰7信息來(lái)自黃芩，包括黃芩苷；峰8～峰9信息來(lái)自菊花和黃柏-黃連，包括木犀草苷、鹽酸小檗堿；峰10～峰14信息主要來(lái)自黃芩，包括漢黃芩素。但黃芩苷、木犀草苷在制劑圖譜中的峰相對(duì)其他組分太小，故未作為參照峰。

2.6 相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012年版)分別對(duì)26批樣品進(jìn)行圖譜分析，選擇自動(dòng)匹配法評(píng)價(jià)，生成對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行相似度計(jì)算，11家企業(yè)生產(chǎn)的相似度分別為0.699、0.801、0.808、0.818、0.888、0.896、0.905、0.912、0.928、0.939、0.954、0.955，范圍為0.801～0.955，另一家企業(yè)生產(chǎn)的3批樣品由于特征峰缺失，相似度較低，為0.699。

3 討 論

用上述建立好的指紋圖譜測(cè)定方法對(duì)全部收集樣品進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于樣品收集量大于3批次的5家生產(chǎn)企業(yè)而言，同一企業(yè)不同批次的樣品其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均呈現(xiàn)較好的一致性，相似度均大于0.98，說(shuō)明同一企業(yè)藥材來(lái)源和工藝相對(duì)穩(wěn)定，成品均一性較好。但如上所述，不同生產(chǎn)企業(yè)間樣品的樣品相似度差異較大，分析認(rèn)為與各企業(yè)間生產(chǎn)工藝具體參數(shù)、原藥材品質(zhì)及炮制加工等環(huán)節(jié)的不同有關(guān)；同時(shí)還存在有個(gè)別企業(yè)的樣品的相似度較低，偏于正常值，測(cè)定的指紋圖譜中有共有峰缺失及相對(duì)峰面積差異較大，表明組分缺失或含量偏低，這種圖譜的差異不排除廠家存在減量投料或次品投料的情況。本研究不同于明目蒺藜丸中簡(jiǎn)單的HPLC含量測(cè)定和特征圖譜定性分析，采用半定量的指紋圖譜技術(shù)比較了本品的市售代表性企業(yè)間樣品中黃酮類物質(zhì)的差異。

比較了不同的方法(27%鹽酸甲醇水解、聚酰胺柱、D101大孔樹脂柱)，不同的洗脫劑(2倍柱體積的水洗脫、3倍柱體積的乙醇洗脫、1倍柱體積的乙醇洗脫)，結(jié)果采用聚酰胺柱純化，選用2倍柱體積水洗脫雜質(zhì)干擾，3倍柱體積乙醇洗脫待測(cè)組分，所測(cè)定的色譜峰譜圖信息豐富，效果理想。

[1] 柴 軍，汪佳萍，謝浙裕.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定明目蒺藜丸中黃芩苷、鹽酸小檗堿、升麻素苷和甘草苷的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013,23(3):652-654.

[2] 張 磊，劉 佳，于 靜,等.豨薟草指紋圖譜研究和3種活性成分的含量測(cè)定[J].陜西中醫(yī), 2015,36(12):1674-1676.

[3] 李 驊，高 雅，楊 倩,等.雙丹口服液的HPLC指紋圖譜研究[J].陜西中醫(yī),2016,37(7):734-738.

[4] 陳莉雯，李毅民，謝瑞芳,等.黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立[J].陜西中醫(yī)，2015,36(6):238-242.

[5] 白云娥，漆小梅，趙 華，等.聚酰胺分離金蓮花總黃酮[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006,26(5):512-514.

[6] 馬鴻雁，周婉珊，褚夫江，等.苦參中黃酮類成分的高效液相指紋圖譜及5種成分的含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，2013,38(16)：2690-2695.

[7] 周 欣，李章萬(wàn)，張雪琴，等.銀杏葉片劑中銀杏黃酮的HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005,40(2)：93-95.

(收稿2016-09-19；修回2016-10-20)

△青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院(西寧 810016)

@明目蒺藜丸 黃酮類 色譜法，液相

R289

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.048