馮大興

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧　沈陽　110003）

抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌02抑制作用的研究

馮大興

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧沈陽110003）

為了解抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2是否具有抑制作用，使抗菌脂肽作為肉雞飼養(yǎng)中抗生素替代品提供科學(xué)依據(jù)，本試驗通過測定抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2生長曲線的影響，觀測抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2細胞膜通透性的影響、對雞源大腸桿菌O2顯微特征的影響以及對雞源大腸桿菌O2新陳代謝的影響等方法研究抗菌脂肽提取物是否對雞源大腸桿菌O2具有抑制作用。結(jié)果表明，抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2具有抑制作用，作用機理可能與其對菌體細胞膜及細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞性有關(guān)。

抗菌脂肽；雞源大腸桿菌；抑制；細胞膜

中國是世界上最大的肉雞生產(chǎn)國，具有龐大的消費市場，近年來，隨著肉雞生產(chǎn)的集約化以及規(guī)模化程度不斷提高，大量的抗生素被用作抗菌促生長劑廣泛添加在肉雞飼料中，此為導(dǎo)致肉雞腸道菌群破壞和體內(nèi)藥物殘留以及耐藥性菌株產(chǎn)生的主要原因。所以，尋找適用于飼料工業(yè)生產(chǎn)的安全環(huán)保、促生長且無殘留的新型的添加劑勢在必行。對于抗菌脂肽的研究主要集中于抗菌脂肽抗菌抑菌和作為藥物添加劑在畜禽病防治當(dāng)中的作用，在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用，尤其是對肉雞生產(chǎn)性能和免疫機能作用效果方面的研究較少?？莶菅挎邨U菌可以產(chǎn)生抗菌脂肽，其抗菌脂肽分子量小、脂溶性強且抗菌譜廣，對很多種病毒和細菌以及某些寄生蟲病均有很好的抑制作用[1-3]。

雞源大腸桿菌是我國家禽養(yǎng)殖過程中主要病原菌之一，本試驗通過測定添加抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2生長曲線的影響、觀測抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2細胞膜通透性的影響等方法來研究抗菌脂肽提取物對雞源大腸桿菌O2的抑制作用，為抗菌脂肽作為抗生素替代品在肉雞飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株試驗菌株：枯草芽孢桿菌S2，由中國微生物菌株保藏中心提供；指示菌株：雞源大腸桿菌O2。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（用于種子培養(yǎng)）、Landy培養(yǎng)基（發(fā)酵用）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1種子菌液培養(yǎng)將保存的枯草芽孢桿菌S2菌株轉(zhuǎn)接至LB平板上，32℃培養(yǎng)20 h；用接種環(huán)取活化的單菌落，接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，32℃，180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，4℃冰箱保存、備用。

1.2.2發(fā)酵液的制備將雞源大腸桿菌O2轉(zhuǎn)種至LB平板上，37℃培養(yǎng)20 h；用接種環(huán)取活化的單菌落，接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，并通過平板計數(shù)方式確定每毫升培養(yǎng)液中雞源大腸桿菌O2菌數(shù)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3枯草芽孢桿菌S2菌株脂肽的制備取枯草芽孢桿菌S2菌株接種到裝有500 mL Landy培養(yǎng)液的3 000 mL三角瓶中，接種量為5%，32℃，180 r/ min條件下培養(yǎng)30 h；取發(fā)酵30 h后的S2發(fā)酵液，10 000 r/min離心，棄去菌體，加入3%的大孔吸附樹脂XAD-16，室溫置于搖床震蕩，120 r/min，24 h。吸附后的樹脂用蒸餾水清洗至樹脂表面無抗菌脂肽發(fā)酵液殘留，然后置于200 mL具塞三角瓶中，加入60 mL無水乙醇，室溫下，置于搖床（120 r/min）振蕩洗脫24 h，然后減壓干燥，即為抗菌脂肽粗提物。

1.2.4抑菌質(zhì)量濃度最小值（M IC）測定采用倍比稀釋法進行測定。用LB液體培養(yǎng)基將抗菌脂肽粗提物倍比稀釋，分成8個梯度。取培養(yǎng)液的時期很關(guān)鍵，應(yīng)當(dāng)在雞源大腸桿菌O2對數(shù)生長期。將其菌體濃度稀釋，數(shù)值應(yīng)為106CFU/mL，依次添加在不同質(zhì)量濃度的抗菌脂肽LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，轉(zhuǎn)數(shù)為150 r/min條件下培養(yǎng)，20 h后觀察雞源大腸桿菌的培育狀況，以雞源大腸桿菌O2不能培育為標準，它在最小稀釋濃度情況下，抗菌脂肽質(zhì)量濃度即抗菌脂肽粗提物MIC（最小抑菌濃度）。

1.2.5抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2生長曲線影響測定取活化狀態(tài)的雞源大腸桿菌O2液體菌種，按5%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，試驗共5組，培養(yǎng)液體積均為100 mL，在37℃，轉(zhuǎn)數(shù)為180 r/min條件下培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)時間，分別取樣和加入不同濃度的抗菌脂肽，測定OD600nm值，繪制生長曲線。分組見表1。

表1　脂肽對雞源大腸桿菌生長曲線影響分組Table1　The effects of antim icrobial peptides in Fow l Escherichia coli grow th curve treatm ents

1.2.6抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2細胞膜通透性的影響觀測將雞源大腸桿菌O2培養(yǎng)到對數(shù)生長期，可以使用LB液體培養(yǎng)基，用離心的方法收集菌體，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，時間為10 min，然后用滅菌生理鹽水洗滌3次，最后用生理鹽水稀釋，將菌體濃度調(diào)節(jié)到107CFU/mL。將菌懸液稀釋，再加入抗菌脂肽，終濃度達到1 MIC。在37℃，100 r/min的振蕩器中培養(yǎng)，依次在0、15、30、45、60、75、90、105和120 min取出菌懸液5 mL。用纖維素酯微孔膜過濾，其規(guī)格為0.22μm，然后用紫外分光光度計在260 nm處測定其吸光值，繪制吸光度變化曲線圖。

1.2.7抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2顯微特征影響的觀測培養(yǎng)雞源大腸桿菌O2種子液，在對數(shù)生長期時，按5%接種量接種至LB培養(yǎng)基中，試驗共3組，培養(yǎng)液體積均為100 mL，分為2個處理組和1個對照組，分別添加脂肽粗提物和水，處理方式見表2。37℃150 r/min條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)3 h及4 h后分別取樣，按照以下說明的操作方法，制備掃描及透射電鏡標本。

1.2.7.1制備掃描電鏡標本將處理組1和處理組2與對照組培養(yǎng)的雞源大腸桿菌O2菌液用戊二醛（2.5%）固定2 h后涂片，pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，待其自然風(fēng)干，將標本保存在高真空蒸發(fā)器中，噴金鍍膜，置掃描電子顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.7.2制備透射電鏡標本分別對3組培養(yǎng)的雞源大腸桿菌O2菌液用戊二醛（2.5%）固定2 h后離心取菌體，pH 7.2的磷酸鹽緩沖液重復(fù)洗滌3次。然后用29%、51%、76%、94%乙醇順序脫水1次，時間為10 min，再用無水乙醇脫水2次，時間為10 min，進行包埋，59℃聚合50 h，使用超薄切片機切片，切片放在無載膜銅網(wǎng)上（400目），用醋酸雙氧鈾染29 min，再用檸檬酸鉛進行復(fù)染29 min，用蒸餾水沖洗，38℃烘干，在透射電子顯微鏡下觀察和拍照。1.2.8抗菌脂肽對雞源大腸桿菌代謝活力影響確定試驗條件：確定甲瓚（INT）的最大吸收波長、氯化碘硝基四唑紫（INT）的最佳反應(yīng)濃度以及最佳反應(yīng)時間；將雞源大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在轉(zhuǎn)速為4 999 r/min，時間為10 min的條件下離心收集菌體。反復(fù)3次洗滌，使用的是滅菌生理鹽水洗滌，然后用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌體濃度到108CFU/mL，分裝于6～7個無菌試管中，依次加入抗菌脂肽，并使其終濃度達到0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL，在溫度為38℃恒溫培養(yǎng)60 min，10 000 r/min離心5 min，收集菌體，再用滅菌生理鹽水反復(fù)洗滌3次，用生理鹽水將細菌濃度調(diào)節(jié)到108CFU/mL，添加終濃度為1 mmol/L的氯化碘硝基四唑紫（INT），并于37℃下作用55 min，然后測定630 nm處吸光值，判斷不同濃度抗菌脂肽對雞源大腸桿菌在不同時間孵育下菌體細菌代謝活力的影響。

表2　抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2的分組處理Table2　The effects of antim icrobial peptides in Fowl Escherichia coli O2treatments

2　結(jié)果與分析

2.1MIC測定結(jié)果通過倍比稀釋法，觀察抗菌脂肽粗提物對雞源大腸桿菌O2的抑制效果（表3），結(jié)果顯示，其MIC（最小抑制濃度）為0.5 mg/mL。

表3　抗菌脂肽對雞源大腸桿菌的最小抑制濃度Table3　The effect of antim icrobia l peptides on Fow l Escherichia coli M IC

2.2抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2生長曲線影響觀察S2菌株產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物粗提物對雞源大腸桿菌生長曲線的影響（圖1），結(jié)果顯示，在細菌培養(yǎng)0 h及6 h時分別加入0.8 MIC抗菌脂肽，對雞源大腸桿菌O2的生長有抑制作用；6 h后，雞源大腸桿菌O2處于培育的高峰期，而且細菌濃度很高，加入抗菌脂肽，抗菌脂肽的抑制作用就會大大降低。在對數(shù)期末（12 h）加入抗菌脂肽，OD540nm不會持續(xù)變小。另外，伴隨添加的脂肽濃度由1.0 MIC增加到3.0 MIC時，OD540nm減小幅度增大；當(dāng)菌體濃度較大時，抗菌脂肽的溶菌作用隨其濃度的增加而增強。說明抗菌脂肽化合物對雞源大腸桿菌O2具有明顯的抑菌效果，其效果存在濃度依賴效應(yīng)。

2.3抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2菌體細胞膜通透性的影響通過對添加了抗菌脂肽化合物的雞源大腸桿菌O2培養(yǎng)上清液260 nm處紫外吸收值結(jié)果觀察（圖2），得知隨著抗菌脂肽粗提物作用時間不斷延長，在260 nm處菌體懸液的吸光值逐漸升高；也就是說，菌體細胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)能夠透過細胞膜泄漏到菌懸液中，導(dǎo)致培養(yǎng)上清液260 nm處紫外吸收值增大。說明抗菌脂肽化合物可以導(dǎo)致雞源大腸桿菌O2菌體細胞膜通透性增大。

2.4抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2顯微特征的影響通過掃描電鏡照片觀察（圖3），結(jié)果顯示，對照組雞源大腸桿菌菌體表面光滑、菌體邊緣整齊、輪廓清晰，呈均勻典型完整的短桿狀（圖a）；而低濃度脂肽處理組菌體表面粗糙、凹凸不平，邊緣不整齊，有的菌體細胞有一個小孔洞出現(xiàn)（圖b）；高濃度脂肽處理組菌體表面破損嚴重、輪廓模糊，菌體出現(xiàn)斷裂、殘缺，異常菌體形態(tài)增多（圖c、d）。說明抗菌脂肽能夠?qū)е码u源大腸桿菌O2的正常形態(tài)細胞壁、細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，對正常菌體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)外泄而產(chǎn)生溶菌作用。

圖1　抗菌脂肽粗提物對雞源大腸桿菌O2生長曲線的影響Fig.1　The effects of antim icrobial peptides in Fow l Escherichia coli grow th curve

圖2　添加抗菌脂肽粗提物的雞源大腸桿菌培養(yǎng)物上清液260 nm的吸光值Fig.2　260 nm absorbance values on antim icrobial peptides crude extractings of 260nm ow l Escherichia coli culture supernatant

通過透射電鏡照片觀察（圖4），可以看出，對照組菌體邊緣清晰、平整、密度高、透射度低，無缺陷和斷裂現(xiàn)象（圖a）。而試驗組則可以明顯的看到菌體表面密度不勻、粗糙不平，菌體邊緣整齊度差、密度低、透射度高（圖b、c、d、e、f），有的細胞已經(jīng)有一個小孔洞，胞壁缺陷、菌體殘缺不全。這些結(jié)果進一步說明脂肽化合物能夠?qū)е码u源大腸桿菌細胞壁破裂或者孔洞形成，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏，細胞代謝無法正常進行，最終導(dǎo)致細菌細胞的死亡。

2.5抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2新陳代謝的影響根據(jù)某種脫氫酶對雞源大腸桿菌O2的活細胞作用，并能夠生成一種活化的[H]＋，而次活化的[H]＋能夠?qū)NT（氯化碘硝基四唑紫）中的四唑還原，形成一種甲瓚的物質(zhì)，利用這種甲瓚生成的速率來推測和判斷菌體細胞的代謝活力。產(chǎn)生[H]＋（氫離子）增多說明菌體細胞活力越強，還原產(chǎn)生的甲瓚物質(zhì)越多，顏色越紅；反之，產(chǎn)生[H]＋（氫離子）越少說明菌體細胞活力越弱、還原產(chǎn)生的甲贊物質(zhì)越少，顏色越淺，則OD630nm值越小。

確定甲瓚物質(zhì)的最大吸收波長為630 nm（圖5），確定INT（氯化碘硝基四唑紫）最佳濃度為l mm，最佳反應(yīng)時間為55 min（圖6）。

雞源大腸桿菌O2菌體細胞代謝活力的觀察結(jié)果（圖7）顯示，隨著抗菌脂肽化合物質(zhì)量濃度的增加，其對雞源大腸桿菌O2菌體細胞代謝活力的抑制作用逐漸增強；當(dāng)抗菌脂肽質(zhì)量濃度達到0.5 MIC以上時，其對雞源大腸桿菌O2菌體細胞代謝活力的抑制作用非常顯著。說明隨著抗菌脂肽化合物作用于雞源大腸桿菌O2菌體細胞，造成了細胞膜通透性增大，細胞內(nèi)部一些大分子物質(zhì)發(fā)生了泄漏，使菌體細胞代謝受阻，活力下降。

圖3　雞源大腸桿菌O2掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3　The scanning electron m icroscope of Fow l Escherichia co li O2

3　討論

根據(jù)前期試驗數(shù)據(jù)顯示，枯草芽孢桿菌S2菌株在24 h和48 h的發(fā)酵的代謝產(chǎn)物對細菌（G＋、G－）抑菌圈差異明顯，而且24 h時的抑菌效果明顯好于48 h；又根據(jù)本次試驗結(jié)束，30 h之前產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物主要是以sur factins（表面活性素類），這與報道的sur factins（表面活性素類）脂肽具有較好的抗菌效果相吻合，表明S2菌株產(chǎn)生的抗菌脂肽在不同發(fā)酵階段存在類型、濃度上的差異，或者與發(fā)酵培養(yǎng)基成分有直接關(guān)系。因此，關(guān)于S2菌株的進一步優(yōu)化、發(fā)酵工藝篩選、穩(wěn)定性及抗菌效果的提升改造等的研究，對工業(yè)化生產(chǎn)及在畜牧上的應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實意義。

圖4　雞源大腸桿菌O2透射電鏡照片F(xiàn)ig.4　The transm ission electron m icroscope of Fow l Escherichia coli O2

圖5　甲瓚的全波長掃描圖Fig.5　The full wavelength scanning of INT

圖6　INT（氯化碘硝基四唑紫）最佳反應(yīng)時間Fig.6　The optimal reaction time of INT

本試驗初步探討了抗菌脂肽粗提物對雞源大腸桿菌O2的抑制機理，在確定抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2的MIC的基礎(chǔ)上，通過抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2的生長曲線、菌體細胞膜通透性、菌體顯微結(jié)構(gòu)、菌體細胞代謝活力等諸多方面干擾的試驗證實雞源大腸桿菌對抗菌脂肽有很強的敏感性，抑菌濃度最小值為0.5μg/mL。抑制細菌生長是抗菌物質(zhì)對細菌的作用之一，還有一方面就是殺滅細菌。殺菌作用方式又能分為2種，一種是殺菌不能溶菌，另一種就是殺菌且能溶菌[4]。抑制細菌的的生長曲線也分為2種，抑菌和殺菌但不能溶菌的抗菌物質(zhì)可以使細菌停止生長，生長曲線變?yōu)橥Ｖ股L曲線，但也不會下滑，維持在一個恒定的渾濁度；而殺菌且能溶菌的抗菌物質(zhì)能造成菌體懸液渾濁度下降，生長曲線下滑，抗菌脂肽屬于既能殺菌且能溶菌的抗菌物質(zhì)。

根據(jù)“桶板模型理論”，抗菌肽或抗菌脂肽插入質(zhì)膜內(nèi)并垂直于細孢膜方向，在細胞膜上相木桶樣排列，其疏水側(cè)鏈朝向外部的脂質(zhì)環(huán)境，極性側(cè)鏈面向內(nèi)構(gòu)成跨膜孔道，這些孔道足以使胞質(zhì)大分子物質(zhì)外漏而導(dǎo)致細胞死亡。通過抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2菌體細胞結(jié)構(gòu)的作用效果說明，在該抗菌脂肽的作用下，增大了雞源大腸桿菌菌體細胞膜通透性，很多離子、大分子蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)丟失，這種現(xiàn)象表明其抗菌作用是使其在菌體細胞膜上表面引起膜電荷改變，造成膜結(jié)構(gòu)紊亂，形成孔道造成細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，使細菌的滲透壓失衡，最終使細胞死亡[5-6]。

圖7　不同濃度的抗菌脂肽對雞源大腸桿菌O2代謝活力的影響Fig.7　The e ffects o f different concentrations antim icrobia l peptides on Fow l Escherichia co lim etabo lic activity

掃描、透射電鏡顯微的結(jié)構(gòu)照片顯示表明，這種抗菌脂肽能夠使雞源大腸桿菌O2細胞壁破裂、細胞膜通透性增加，主要表現(xiàn)為細胞膜形成孔洞導(dǎo)致細胞內(nèi)一些物質(zhì)泄漏，從而使細胞的正常代謝無法進行，使細胞生長受到抑制；嚴重的出現(xiàn)菌體斷裂，進而導(dǎo)致死亡，起到了抑菌、殺菌和溶菌效果[7]。這一試驗結(jié)果為如何更好的利用該脂肽、提高其殺菌效果提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

相關(guān)研究表明[8]，某些脂肽抑制部分蛋白質(zhì)的合成、可與細菌染色體DNA相互作用導(dǎo)致DNA正常結(jié)構(gòu)的改變，可能會進一步導(dǎo)致DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達功能受抑制。而S2脂肽能否抑制部分菌體蛋白質(zhì)的合成、能否進入到雞源大腸桿菌細胞核內(nèi)與細菌染色體DNA發(fā)生相互作用還有待進一步研究，從而全面評價脂肽對雞源大腸桿菌的抑殺作用。

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Research on the inhibition effects ofantim icrobial lipopeptide extracton Fow lescherichia coliO2

Feng Daxing
（Animal product safety monitoring Institute ofLiaoning Pravince，LiaoningShenyang110003）

In order to understand the inhibition ef fects of antimicrobial l ipopeptide ext ract on Fowl escherichia col i,which could provide a scienti fic basis as antibiotics al ternatives in broi ler,In this experiment,we added the antibacterial l ipopeptide extractive to measure the growth curve,the cel l membrane permeabi l ity the microscopic characteristics and the metabl ism of the Fowl escherichia col i.The resul ts showed that the antimicrobial l ipopeptide ext racts inhibits the Fowl escherichia col i which may be related to the cel l membrane and cel l wal l structural integrity of bacteria.

Antimicrobial peptides;Fowl Escherichia col i;Inhibition;Cel l membrane

S859.79

B

1672-9692(2016)02-0041-08

2016-01-03

馮大興（1985-）男，碩士，畜牧師，研究方向為獸藥、飼料、畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。