李　巍，陳明非

（1.遼寧省大連市動物疫病預防控制中心，遼寧　大連　116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧　大連　116037）

大連地區(qū)麻雞呼吸道病多病原檢測分析

李巍1,2，陳明非1,2

（1.遼寧省大連市動物疫病預防控制中心，遼寧大連116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧大連116037）

大連地區(qū)麻雞呼吸道病流行嚴重，在流行病學調(diào)查的基礎(chǔ)上，對引起該類疾病的病原進行了實驗室檢測，排除了新城疫和禽流感的感染，ELISA檢測結(jié)果表明麻雞群敗血型支原體感染率很高，從有呼吸道癥狀的麻雞中分離到一株雞葡萄球菌，一株大腸桿菌，動物試驗表明，這株大腸桿菌能引起雛雞明顯的呼吸道癥狀，雞葡萄球菌僅引起雛雞局部損傷，但不能排除雞葡萄球菌和敗血型支原體協(xié)同作用引發(fā)麻雞呼吸道病的可能。通過對檢測結(jié)果的分析，討論了麻雞呼吸道病發(fā)生的原因，提出了防控建議。

麻雞；呼吸道?。粩⊙椭гw；雞葡萄球菌；大腸桿菌

近年來，莊河大骨雞被一種外貌酷似的外來雞搶占了市場，這種雞俗稱“麻雞”，實際上是一種人工培育的生長快速的麻羽肉雞，4月齡體重可達5 kg左右。大連地區(qū)養(yǎng)殖的麻雞基本是從河南、廣州等地引進。流行病學調(diào)查顯示，大連地區(qū)麻雞呼吸道病發(fā)病率明顯高于其他品種的雞，有的養(yǎng)殖場甚至出現(xiàn)麻雞一年四季呼吸道病不斷，而同群飼養(yǎng)的其他品種的雞卻無明顯呼吸道病出現(xiàn)。發(fā)生呼吸道病的麻雞群為25～60日齡不等，發(fā)病率30%～70%，患病雞采食量下降，增重變緩，治療易反復，遷延不愈，死淘率可達5%～20%。雞呼吸道病病因復雜，與環(huán)境因素、感染性因素，飼料營養(yǎng)、應激等有關(guān)，其中，感染性因素又包括細菌、病毒、支原體、霉菌等[1]。2015年4月，對大連普蘭店市太平、楊樹房、蓮山三個鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生呼吸道病的麻雞進行病因探究，考慮到麻雞呼吸道病發(fā)病率高、死亡率低、病程長的特點，首先通過采集咽喉/泄殖腔拭子進行新城疫、禽流感病毒核酸檢測，結(jié)果為陰性，從而排除了非典型性新城疫、溫和型禽流感的感染，通過血清學檢測查明了麻雞敗血型支原體感染情況，根據(jù)細菌分離鑒定，取得兩株致病菌。本次檢測對今后麻雞的引進檢疫和呼吸道病防治都有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本分別采自普蘭店市楊樹房鎮(zhèn)李家村某雞場、太平鎮(zhèn)太平鄉(xiāng)某雞場、蓮山鎮(zhèn)高家村某雞場，總計采25～60日齡有明顯呼吸道癥狀的麻雞38只，同群麻雞血清120份。

1.1.2試劑禽敗血型支原體（MG）抗體ELISA檢測試劑盒購自北京愛德士-元亨公司，批號：99-06729-B721；營養(yǎng)肉湯、血液瓊脂基礎(chǔ)、麥康凱培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；小牛血清購自大連市博勵生物科技有限公司；脫纖綿羊血購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3主要儀器法國梅里埃公司ATB自動化微生物鑒定系統(tǒng)（含ATB細菌鑒定試劑條），瑞士TECAN Inf inite M200全波長酶標儀，日本三洋MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱，上海森信SHP-250生化培養(yǎng)箱。

1.1.4試驗動物7日齡雛雞由旅順韓偉雞場提供，飼養(yǎng)7 d無異常后用于試驗。

1.2方法

1.2.1一般臨床檢查包括臨床癥狀觀察、剖檢病變觀察，組織抹片檢查。剖檢前先對病雞采血，用于血清分離。剖檢時無菌剪取病雞喉頭、氣管、肺、肝、脾、腎等組織，用滅菌棉棒蘸取眶下竇、鼻竇、氣囊分泌物。

1.2.2MG抗體檢測按ELISA試劑盒說明書對158份血清進行禽敗血型支原體（MG）抗體檢測。

1.2.3細菌分離鑒定無菌操作將喉頭、氣管、肺、肝、脾、腎，眶下竇、鼻竇、氣囊分泌物這些樣品先接種血清肉湯，分別置于普通大氣條件下和10%CO2條件下37℃增菌培養(yǎng)48 h。增菌培養(yǎng)物再分別轉(zhuǎn)移接種營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、巧克力瓊脂，其中，巧克力瓊脂置于10%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，其他置于普通大氣、37℃條件下培養(yǎng)，對轉(zhuǎn)移接種的培養(yǎng)物多次分離純化獲得的純培養(yǎng)菌，純培養(yǎng)菌接種綿羊血瓊脂平板檢驗溶血現(xiàn)象。對純培養(yǎng)菌革蘭氏染色鏡檢，根據(jù)鏡檢結(jié)果選擇ATB細菌鑒定試劑條進行生化鑒定。鑒定好的細菌接種斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4致病力試驗將保存的菌株復壯培養(yǎng)24 h，挑取菌苔用生理鹽水稀釋成10個麥氏單位，換算成活菌數(shù)約為3.0×109CFU/mL，每只雞滴鼻點眼接種0.2 mL，即接種活菌約6.0×108個。每日觀察發(fā)病情況，剖檢死雛，回收細菌，連續(xù)觀察10 d，10 d后全部處死，回收細菌。

2　結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀病雞有明顯的呼嚕聲，有的伴有其他癥狀：流淚；流鼻液；眼部三角區(qū)腫脹。

2.2剖檢變化病雞普遍表現(xiàn)喉氣管黏液增多，氣囊混濁，有的伴有其他病變：鼻腔內(nèi)鼻甲骨腫脹充血；眶下竇有淡黃色液體；鼻竇或氣囊有干酪樣分泌物；肝臟腫大瘀血。

2.3組織抹片檢查抹片經(jīng)吉姆薩染色鏡檢，有的樣本可見到少量散在球菌，有的樣本可見少量短桿狀菌。

2.4M M G G抗體檢測38只病雞MG抗體檢測陽性31只，陽性率為81.6%。3個雞場MG抗體檢測結(jié)果如表1。

2.5細菌分離鑒定

2.5.1分離培養(yǎng)特性血清肉湯培養(yǎng)48 h后變成均勻一致的混濁，管底有白色絮狀沉淀物，經(jīng)多次轉(zhuǎn)移接種，分離純化后得到兩株細菌，分別命名為DLM1和DLM2。DLM1在普通營養(yǎng)瓊脂上37℃培養(yǎng)18 h，形成圓形、表面光滑、邊緣整齊、隆起、不透明、乳白色，直徑1～1.5 mm小菌落，室溫下放置72 h，菌落由乳白色變成金黃色；在綿羊血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h形成細小、突起的圓形菌落，呈乳白色，菌落周圍有透明溶血環(huán)；在巧克力瓊脂上10%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h，形成細小、扁平、圓形、不透明、灰白色菌落。DLM2在麥康凱瓊脂上37℃培養(yǎng)18 h，形成表面光滑、圓形、隆起、邊緣整齊、粉紅色、直徑1.5～2.5 mm菌落，在綿羊血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h形成灰白色圓形突起的大菌落，菌落周圍有暗褐色不完全溶血環(huán)。DLM1和DLM2在綿羊血瓊脂平板上的形態(tài)及溶血現(xiàn)象見圖1。

表1　MG抗體ELISA檢測結(jié)果Table1　The ELISA detection results of antibodies to MG

圖1　分離菌在綿羊血平板上的生長特征Fig1　The grow th characteristics of iso lated strains at Sheep Blood Agar

2.5.2理化鑒定DLM 1革蘭氏染色鏡檢為G+呈葡萄狀排列的球菌，選擇ID32 STAPH（葡萄球菌）鑒定試劑條進行生化鑒定，鑒定結(jié)果為雞葡萄球菌（Staphylococcus gal linarum），生化試驗結(jié)果如表2；DLM2革蘭氏染色鏡檢為G-短粗、兩端鈍圓、散在或兩兩呈直線排列的桿菌，選擇ID32E（腸桿菌科和其它非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌）鑒定試劑條進行生化鑒定，鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌（Escherichia col i），生化試驗結(jié)果如表3。此株大腸桿菌賴氨酸脫羧酶（LDC）反應陰性，比照ID32E鑒定試劑條說明書，大腸埃希氏菌中賴氨酸脫羧酶反應陰性的菌株占29%。

2.6致病力試驗將30只14日齡雛雞分為3組，兩組為攻毒組，一組為對照組。DLM1攻毒組雞雛表現(xiàn)精神萎靡，腫眼，流鼻液，但無雞雛死亡，10 d后剖檢發(fā)現(xiàn)鼻竇、眶下竇有黃色分泌物，從分泌物中回收到DLM1細菌，從內(nèi)臟中沒有回收到細菌。DLM2攻毒組雞雛出現(xiàn)了呼吸急促的癥狀，呆立或喜臥，從攻毒后第4日開始出現(xiàn)死亡，以后每日陸續(xù)死亡，到第10日共死亡6只，存活4只，剖檢病死雛及存活處死雛，均有喉氣管黏液增多，死亡雛喉頭處有出血斑塊，肺腫脹淤血，氣囊混濁，病程長的雛雞胸腔有黃色滲出液。從發(fā)病雛的呼吸道及心臟、肝臟中均回收到DML2細菌。

3　檢測結(jié)果分析

3.1雞敗血型支原體（MG）是以咳嗽、流鼻液、氣管啰音以及呼吸道炎癥為特征的傳染病[2]，MG感染廣泛分布于世界各國，在我國感染率很高，邵國青用平板凝集試驗檢測來自全國20個省、市和21個地區(qū)的400份雞血清，陽性率高達78%[3]。經(jīng)調(diào)查，大連地區(qū)養(yǎng)殖的麻雞引進前后都沒有進行過支原體免疫。本次對有明顯呼吸道癥狀的麻雞的MG抗體檢測，陽性率達到81.6%，三個麻雞養(yǎng)殖場的MG抗體抽樣檢測平均陽性率為78.3%,兩者差異不大，表明大連引進的麻雞MG感染率很高，雖然MG不是引起麻雞呼吸道病的唯一誘因，但感染MG的雞群呼吸道病發(fā)病風險及嚴重程度大大升高。蘇麗偉等報道肉雞單獨感染支原體常呈隱性經(jīng)過，但有應激因素出現(xiàn)則誘發(fā)慢性呼吸道病，合并感染其他病原體時死亡加重[4]。潘樹德等對沈陽地區(qū)雞慢性呼吸道病的流行病學調(diào)查顯示MG感染率高的雞場都有慢性呼吸道病病史或正在發(fā)病中，而MG感染率很低的雞場未見或僅見個別雞發(fā)生呼吸道病[5]。因此，麻雞呼吸道病的高發(fā)與反復發(fā)作是敗血型支原體、細菌性因素和北方環(huán)境氣候因素共同作用的結(jié)果。敗血型支原體抗生素治療效果不好，防控措施主要是加強飼養(yǎng)管理，做好衛(wèi)生消毒工作，預防其他引起呼吸道損傷的傳染病發(fā)生。種雞群通過免疫能有效控制MG感染，阻止垂直傳播，保護下一代[6]，因此控制麻雞呼吸道病的首要措施是從做好MG免疫的種雞場引雞苗。

表2　DLM 1生化試驗結(jié)果Table2　The biochem ical test results of DLM 1

表3　DLM 2生化試驗結(jié)果Tab le3　The biochem ica l test resu lts of DLM 2

3.2雞葡萄球菌病有皮膚型、敗血型、關(guān)節(jié)炎型、肺型和眼型[2]，本次試驗分離到的雞葡萄球菌屬于金黃色葡萄球菌，采用滴鼻、點眼的方式感染雛雞，僅引起雛雞腫眼，鼻竇、眶下竇積液，無死亡出現(xiàn)，無明顯呼吸道癥狀。朱曉平報道雞葡萄球菌感染后發(fā)病情況與感染途徑有很大關(guān)系，經(jīng)呼吸道感染癥狀較輕[7]。本次試驗分離到葡萄球菌的麻雞臨床呼吸道癥狀明顯，考慮到雞葡萄球菌對免疫器官的發(fā)育和功能有一定的抑制和破壞作用[7]，而雞感染敗血型支原體后是否會發(fā)病與有無其他病原體混合感染有關(guān)[2]，因此，可以推測臨床上敗血型支原體與葡萄球菌協(xié)同作用誘發(fā)了麻雞呼吸道病。

3.3引起雞呼吸道病的細菌有沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌等[8]，陳寶利、楊國良等從患呼吸道疾病的雞群中分離到了副雞嗜血桿菌[9-10]，證實了我國雞群中存在副雞嗜血桿菌。本次試驗針對多種呼吸道致病菌進行分離，結(jié)果分離到一株禽大腸桿菌。禽大腸桿菌有多種血清型，表現(xiàn)形式復雜，引起呼吸道病的主要指氣囊炎型和肺型[2]。賀常亮報道大腸桿菌侵入機體的途徑主要是通過雞上呼吸道感染[11]，本次試驗從麻雞分離到一株賴氨酸脫羧酶反應陰性的大腸桿菌，采用滴鼻點眼的方式接種雛雞，能引發(fā)雛雞呼吸道損傷，引起呼吸道病，證明禽大腸桿菌是麻雞呼吸道病的重要病原之一。禽致病性大腸桿菌血清型眾多，致病機理復雜，定植不同組織部位并引起不同病癥的禽致病性大腸桿菌與其基因組多樣性有關(guān)[12]，對引起麻雞呼吸道病的大腸桿菌的血清型和基因進化情況還需要作進一步的探究。

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Pathogens Detection and Analysis of Dalian Ma Chicken Respiratory Disease

Li Wei1,2,Chen Mingfei1,2
(1.DaLian Center forAnimal Disease Prevention and Control,LiaoningDalian116037; 2.DaLian Animal Husbandry Station,LiaoningDalian116037)

Dal ian Ma Chicken prevalence of respiratory disease was seriously.Laboratory detection on the infective pathogens was car ried out on the base of epidemiological investigation.Infection of Newcast le Disease Vius or Avian Inf luenza Virus was el iminated.The ELISA detection resul ts showed that Dal ian Ma Chicken were highly infected by Mycoplasma pneumoniae.One Staphylococcus gal linarum and one Escherichia col i were isolated f rom Ma Chicken suf fering f rom respiratory disease.Zoopery showed that the Escherichia col i could cause chicks obvious respiratory symptoms, the Staphylococcus gal l inarum caused local damage only.However,it couldn’t be ruled out that Ma Chicken respiratory disease were caused by synergistic action of Staphylococcus gal l inarum and Mycoplasma pneumoniae.The causes of Ma Chicken respiratory disease were discussed and proposals for cont rol measures were put forward though analysing the laboratory detection resul ts.

Ma Chicken;Respiratory disease;Mycoplasma pneumoniae;Staphylococcus gal l inarum; Escherichia coli

S858.28

B

1672-9692(2016)02-0031-05

2016-01-02

李?。?981-），男，獸醫(yī)師，大學本科，學士，研究方向為動物疫病防控及實驗室檢測。