唐道彬，張 凱，呂長(zhǎng)文，謝德斌，傅體華，王季春

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基于EST-SSR標(biāo)記甘薯連鎖圖譜構(gòu)建及淀粉性狀的QTL定位

唐道彬1,2，張 凱2，呂長(zhǎng)文2，謝德斌2，傅體華1，王季春2

（1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都611130；2西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/西南大學(xué)南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心/重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶400716）

【目的】利用分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建甘薯遺傳連鎖圖譜，并分析甘薯淀粉含量性狀的QTL位點(diǎn)，為高淀粉含量甘薯種質(zhì)資源利用及甘薯分子標(biāo)記輔助育種提供理論和實(shí)踐依據(jù)。【方法】以高淀粉含量品種萬薯5號(hào)為母本、低淀粉含量品種商丘52-7為父本建立雜交群體，利用EST-SSR標(biāo)記，采用“雙假測(cè)交”策略和運(yùn)用JoinMap4.0軟件，分別構(gòu)建雙親遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F1（2012、2013年）群體表型數(shù)據(jù)采用區(qū)間作圖法對(duì)淀粉含量性狀進(jìn)行QTL檢測(cè)?！窘Y(jié)果】利用1 679對(duì)EST-SSR引物篩選出的1 045對(duì)多態(tài)性引物檢測(cè)F1群體的標(biāo)記基因型，獲得了1 418個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。分別對(duì)上述獲得的父母本多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，在LOD≥5.0情況下，分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。采用642個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建母本連鎖群74個(gè)，其中，215個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)位于連鎖圖譜上，占標(biāo)記多態(tài)性位點(diǎn)總數(shù)的33.5%。每個(gè)連鎖群上有2—11個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，連鎖群長(zhǎng)度在0.6—129.4 cM,圖譜總長(zhǎng)為3 826.07 cM，標(biāo)記間平均距離為17.80 cM。屬于父本的776個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建了80個(gè)連鎖群，共有252個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標(biāo)記總數(shù)的32.5%，每個(gè)連鎖群上有2—24個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，連鎖群長(zhǎng)度在2.0—156.8 cM，圖譜總長(zhǎng)為3 955.0 cM，標(biāo)記間平均距離為15.7 cM。以F1雜交群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合2012年、2013年2個(gè)環(huán)境，利用QTL作圖軟件MapQTL5.0，采用區(qū)間作圖法進(jìn)行分析，共檢測(cè)到17個(gè)與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率在8.4%—40.5%。其中、、3個(gè)QTL位于母本萬薯5號(hào)連鎖群上，且在2年環(huán)境中均可檢測(cè)到；14個(gè)QTL位于父本商丘52-7連鎖群上，、、、、、、、是在2個(gè)環(huán)境均檢測(cè)到的QTL。、、、、、是只在1個(gè)環(huán)境檢測(cè)到的QTL。標(biāo)記GDAAS0603在雙親中和2個(gè)環(huán)境中均同時(shí)檢測(cè)到，這些環(huán)境穩(wěn)定QTL可用于分子標(biāo)記輔助選擇?！窘Y(jié)論】分別構(gòu)建了親本EST-SSR分子標(biāo)記連鎖群圖譜，豐富了構(gòu)建甘薯圖譜的標(biāo)記類型，定位了17個(gè)與淀粉含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。

甘薯；淀粉含量；EST-SSR；連鎖圖譜；數(shù)量性狀

0 引言

【研究意義】甘薯（（L.）Lam.）是世界上第七大主要作物，每年產(chǎn)量達(dá)到1.04×109t，其中95%的產(chǎn)量來自于發(fā)展中國(guó)家，是生物質(zhì)能源發(fā)展的優(yōu)勢(shì)作物[1]。因此，高淀粉含量成為甘薯育種和生物技術(shù)研究所關(guān)注的重要品質(zhì)性狀。對(duì)甘薯具有重要價(jià)值的性狀進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位，利用與目標(biāo)性狀QTL緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行跟蹤選擇，并分析這些數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律，將優(yōu)良的基因逐步累積到栽培品種中，培育具有突破性的高淀粉甘薯新品種，是今后甘薯育種研究的必然趨勢(shì)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甘薯是復(fù)雜的同源異源六倍體雜交種（2n=6x=90），染色體數(shù)目多且不穩(wěn)定，雜合性很強(qiáng)，遺傳背景復(fù)雜。自交不孕以及種內(nèi)、種間存在廣泛的雜交不親和。近緣野生種利用困難、遺傳資源匱乏、又以無性繁殖為主，遺傳分析和改良非常困難，極大地制約了甘薯生產(chǎn)的發(fā)展[2]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，“雙假測(cè)交”理論和分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，推動(dòng)了多倍體植物遺傳作圖的迅速發(fā)展。1994年Hemmat等[3]提出了“雙假測(cè)交”（double pseudo-testcross）的構(gòu)想。1994年Grattapaglia等[4]采用“雙假測(cè)交”作圖方法，利用RAPD技術(shù)，分別構(gòu)建了桉樹雙親的遺傳圖譜。1995年Lodhi等[5]采用“雙假測(cè)交”理論，分別構(gòu)建了葡萄雙親的分子遺傳圖譜。“雙假測(cè)交”作圖理論和joinMap軟件開發(fā)[6]同樣為遺傳背景復(fù)雜、自交不親和、親本高度雜合的多倍體植物甘薯遺傳圖譜的構(gòu)建提供了方法。多種分子標(biāo)記被應(yīng)用于甘薯遺傳多樣性的研究和遺傳圖譜構(gòu)建。1995年Arthur等[7]用RAPD標(biāo)記在甘薯品種“Jewel”無性系材料中，檢測(cè)出變異在7.1%—35.7%。1996年Arthur等[8]對(duì)不同來源的芽產(chǎn)生的變異進(jìn)行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)分生組織進(jìn)行無性繁殖更能保持基因型的一致。1997年Thompson等[9]采用RAPD標(biāo)記分析，構(gòu)建了具有134個(gè)標(biāo)記的甘薯遺傳圖譜。1997年Ukoskit等[10]利用196個(gè)RAPD標(biāo)記構(gòu)建了一個(gè)低密度遺傳圖譜。2003年Kriegner等[11]利用甘薯品種“Tanzania×Bikilamaliya”的雜交F1作圖群體，構(gòu)建了AFLP標(biāo)記的遺傳連鎖圖，2個(gè)親本分別產(chǎn)生90和80個(gè)連鎖群，其中632個(gè)標(biāo)記在Tanzania圖譜上，435個(gè)標(biāo)記在Bikilamaliya圖譜上，連鎖圖譜長(zhǎng)度分別為3 655.6 cM和3 011.5 cM，標(biāo)記位點(diǎn)間平均圖距為5.8 cM。2004年Lander等[12]在前者的基礎(chǔ)上將100—200個(gè)SSR共顯性標(biāo)記整合上去，這一作圖群體目前大約有500株。2008年Cervantes- Flores等[13]利用AFLP技術(shù)，以甘薯品種Tanzania×Beauregard雜交后代240個(gè)分離群體為材料，構(gòu)建了雙親分別為86個(gè)和90個(gè)連鎖群的遺傳圖譜。其中947個(gè)標(biāo)記構(gòu)建在親本Tanzania的連鎖圖譜上，總圖距為5 792 cM，平均距離4.5 cM。726個(gè)標(biāo)記構(gòu)建在親本Beauregard的連鎖圖譜上，總圖距為5 276 cM，平均距離4.8 cM。2010年Li等[14]利用Luoxushu 8×Zhengshu 20的雜交F1群體，分別構(gòu)建了含有81個(gè)（Luoxushu 8）連鎖群（包含473個(gè)SRAP標(biāo)記）的連鎖圖譜和66個(gè)（Zhengshu 20）連鎖群（包含328個(gè)SRAP標(biāo)記）的連鎖圖譜。2013年Zhao等[15]利用AFLP和SSR技術(shù)，分別構(gòu)建了雙親高密度遺傳圖譜。徐781連鎖圖譜包括90個(gè)連鎖群，總圖距為8 151.7 cM，平均距離為4.2 cM。徐薯18連鎖圖譜總圖距為8 184.5 cM，平均距離為3.9 cM。隨著國(guó)內(nèi)外關(guān)于甘薯遺傳圖譜的成功構(gòu)建，甘薯重要性狀的QTL定位也開展了大量研究。2005年吳潔等[16]利用構(gòu)建的甘薯SRAP連鎖圖。檢測(cè)到1個(gè)淀粉含量QTL，紅旗4號(hào)的加性效應(yīng)增加淀粉6.37%，解釋表型變異的20.1%。2010年蒲志剛等[17]利用AFLP構(gòu)建甘薯連鎖圖，在綿粉1號(hào)遺傳圖的第2連鎖群上檢測(cè)到E1M722可作為淀粉的臨近QTL。2010年李愛賢等[16]利用SRAP標(biāo)記構(gòu)建了2個(gè)親本的高密度分子連鎖圖譜。同時(shí)檢測(cè)到了1個(gè)主效位點(diǎn)，加性效應(yīng)為-0.73，解釋表型變異的7.70%。2010年唐茜等[18]用BB3-26和潮薯1號(hào)的SRAP遺傳連鎖圖譜，檢測(cè)到1個(gè)淀粉含量QTL，BB3-26的加性效應(yīng)增加淀粉含量2.12%，解釋表型變異的21.3%。2011年Cervantes- Flores等[19]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)，定位了13個(gè)干物質(zhì)含量、12個(gè)淀粉含量和8個(gè)胡蘿卜素含量的QTL。2014年YU等[20]定位了8個(gè)甘薯淀粉含量的QTL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)外甘薯遺傳圖譜大多以AFLP、SRAP、RAPD和少量SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建完成，尚未有完全采用EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建甘薯遺傳連鎖圖譜和淀粉含量QTL定位的研究報(bào)道。采用通用性高、易于檢測(cè)、能直接定位功能基因的EST-SSR標(biāo)記可以促進(jìn)在甘薯新性狀基因的發(fā)現(xiàn)和構(gòu)建甘薯高密度遺傳圖譜中發(fā)揮重要作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用甘薯EST-SSR標(biāo)記分別構(gòu)建甘薯親本連鎖遺傳圖譜，并在2年的環(huán)境中對(duì)甘薯淀粉含量進(jìn)行QTL定位，為重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行精確分析和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

田間試驗(yàn)于2012—2013年在重慶市北碚區(qū)歇馬基地（北緯29°45′28″、東經(jīng)106°22′56″，海拔250 m）和重慶市槽上基地（北緯29°40′18″、東經(jīng)106°20′30″，海拔750 m）進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在西南大學(xué)南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 甘薯品種 萬薯5號(hào)是重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出的高產(chǎn)高淀粉品種，該品種紅色薯皮、白色薯肉，淀粉率在24%—26%，干率為34.9%—37.2%。高產(chǎn)低淀粉品種商丘52-7系河南省商丘地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育，該品種紅色薯皮、淡黃色薯肉，淀粉率在8%—12%，干率為17%—21%。

1.2.2 群體構(gòu)建 2012年以萬薯5號(hào)為母本，商丘52-7為父本在海南陵水基地通過嚴(yán)格的人工雜交技術(shù)，共得到F1實(shí)生系189株；2012年6月將實(shí)生系材料繁殖分為兩套，分別將189株材料及親本在歇馬基地和槽上基地種植、收獲、留種并檢測(cè)薯塊淀粉含量。2013年6月將全部留種材料繁殖分為兩套，再次在歇馬基地和槽上基地種植、收獲、留種并檢測(cè)薯塊淀粉含量。在2個(gè)基地選擇全部株系建立標(biāo)記作圖群體。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2012年全部F1實(shí)生系群體及親本在歇馬和槽上基地種植，每株系種植3株。2013年每株系采用5 m×0.8 m的單行小區(qū)設(shè)計(jì)。2次重復(fù)，收獲時(shí)親本及群體株系每重復(fù)隨機(jī)取3個(gè)鮮薯，并將鮮薯去皮切丁，薯丁混勻后稱取100 g裝入培養(yǎng)皿，3次重復(fù)，之后攤開轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿并在80℃烘箱中放置48 h，等薯干重量穩(wěn)定后用天平稱量并記錄干率數(shù)據(jù)。分別以2012年、2013年歇馬、槽上兩點(diǎn)干率的平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，干率與淀粉率的換算公式為淀粉率（%）=干率（%）×0.86945-6.34587。

1.4 總DNA提取、引物選擇和SSR分析

采用改良CTAB法[21]提取親本及F1實(shí)生系幼嫩植株葉片的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的純度和完整性，-20℃保存?zhèn)溆?。EST-SSR引物來源于廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和西南大學(xué)薯類作物研究所等開發(fā)設(shè)計(jì)的有關(guān)甘薯EST-SSR標(biāo)記[22-26]。引物序列由上海英駿和上海生工公司合成。反應(yīng)體系為10 μL，包括1.2 μL 10×buffer（含Mg2+15 mmol·L-1）、0.2 μL dNTP、1 μL引物、0.1 μL Taq酶、1 μL模板DNA（約50 ng·μL-1）、5.5 μL ddH2O。在ABI9700PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min；25℃5 min，最后4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用銀染法檢測(cè)。

1.5 親本間標(biāo)記多態(tài)性與雜交群體（F1）標(biāo)記基因型檢測(cè)

利用不同的甘薯EST-SSR引物系列對(duì)親本萬薯5號(hào)、商丘52-7進(jìn)行多態(tài)性篩選，在親本中表現(xiàn)多態(tài)性的引物被用于檢測(cè)雜交群體189個(gè)單株的多態(tài)性。根據(jù)位點(diǎn)分離類型，依照J(rèn)oinmap4.0說明書中的標(biāo)準(zhǔn)基因型分析方法對(duì)雜交群體中189個(gè)單株分別記錄其基因型代碼。與親本萬薯5號(hào)具有相同帶型記為lm，沒有記為ll，與親本商丘52-7具有相同帶型記為np，沒有記為nn；在親本萬薯5號(hào)和親本商丘52-7中均有，但在雜交后代中發(fā)生分離的也按照以上標(biāo)準(zhǔn)記錄。只有清晰的帶型才被記錄，缺失和模糊帶型用“--”表示?？ǚ綑z測(cè)用于檢測(cè)位點(diǎn)的偏分離情況。

1.6 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建采用作圖軟件JoinMap4.0[27]，以LOD≥5.0，Kosambi作圖函數(shù)進(jìn)行連鎖分析。2個(gè)親本連鎖群分別命名，萬薯5號(hào)和商丘52-7連鎖圖譜分別用“W”和“S”表示，其小數(shù)點(diǎn)后的數(shù)字01—90表示所屬連鎖群的序號(hào)。

1.7 標(biāo)記位點(diǎn)命名

標(biāo)記命名為引物名后加一大寫字母，A/B/C/D表示同一EST-SSR引物擴(kuò)增出的不同位點(diǎn)。如標(biāo)記SIP272B表示標(biāo)記SIP272的第二條多態(tài)性帶；引物名后加一大寫字母再加數(shù)字，表示雙親本共顯但后代發(fā)生分離的四種標(biāo)記命名，如SIP272D3表示共顯性標(biāo)記SIP272的第四條多態(tài)性帶的第三種分離帶型。

1.8 QTL定位

采用MapQTL5.0軟件對(duì)甘薯淀粉含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[28]，確定不同水平淀粉含量在群體中的分布頻率。利用QTL分析軟件MapChart 2.2對(duì)SSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[29]，采用區(qū)間作圖法（interval mapping，IM）對(duì)全基因組進(jìn)行QTL掃描，選擇1.0 cM的步長(zhǎng)，參數(shù)為1 000次回歸，顯著水平為0.01，以LOD≥3.0作為閾值對(duì)淀粉含量可能存在的QTL進(jìn)行定位和效應(yīng)估計(jì)。加性效應(yīng)以萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)楸尘?，即正效?yīng)表示萬薯5號(hào)的等位基因增加性狀表型值，負(fù)效應(yīng)表示萬薯5號(hào)的等位基因減少性狀表型值，而商丘52-7的等位基因效應(yīng)相反。

2 結(jié)果

2.1 甘薯EST-SSR分子標(biāo)記引物多態(tài)性分析

利用1 679對(duì)EST-SSR引物篩選親本間的引物多態(tài)性，共獲得1 045對(duì)多態(tài)性引物，利用1 045對(duì)多態(tài)性引物檢測(cè)189個(gè)F1群體的標(biāo)記基因型，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到有1—5個(gè)位點(diǎn)，共獲得了1 418個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，含共顯現(xiàn)標(biāo)記位點(diǎn)166個(gè)，占11.7%。1 418個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)中屬于母本的標(biāo)記位點(diǎn)642個(gè)，屬于父本的標(biāo)記位點(diǎn)776個(gè)。

2.2 甘薯EST-SSR分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用JoinMap4.0軟件分別對(duì)上述獲得的父母本多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，在LOD≥5.0情況下，分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。其中屬于母本的642個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建了74個(gè)連鎖群，共有215個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標(biāo)記總數(shù)的33.5%，每個(gè)連鎖群上有2—11個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，連鎖群長(zhǎng)度在0.6—129.4 cM，圖譜總長(zhǎng)為3 826.07 cM，標(biāo)記間平均距離為17.80 cM。屬于父本的776個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建了80個(gè)連鎖群，共有252個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建在連鎖圖譜上，占標(biāo)記總數(shù)的32.5%，每個(gè)連鎖群上有2—24個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，連鎖群長(zhǎng)度在2.0—156.8 cM，圖譜總長(zhǎng)為3 955.0 cM，標(biāo)記間平均距離為15.7 cM（表1，圖1—圖2）。

表1 遺傳連鎖圖譜中連鎖群的圖距和分布

QTL of、、在2個(gè)環(huán)境均被檢測(cè)到,, andwere detected in two environments

圖1 萬薯5號(hào)EST-SSR分子標(biāo)記連鎖圖及淀粉含量QTL的分布

Fig. 1 The EST-SSR linkage map of Wanshu 5 and distribution of QTLs for starch content

、、、、、、、是在2個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到的QTL。、、、、、只在1個(gè)環(huán)境被檢測(cè)到的QTL

QTL of,,,,,,,andwere detected in two environments. QTL of,,,,, andwere detected in one environment

圖2 商丘52-7 EST-SSR分子標(biāo)記連鎖圖及淀粉含量QTL的分布

Fig. 2 The EST-SSR linkage map of shangqiu52-7 and distribution of QTLs for starch content

2.3 甘薯淀粉含量的表型分析

通過對(duì)親本及后代群體甘薯淀粉含量的測(cè)定（表2），結(jié)果表明，淀粉含量在后代群體中差異較明顯，親本萬薯5號(hào)的淀粉含量在2012年和2013年分別為24.52%和23.10%，商丘52-7分別為4.86%和4.35%，因此，萬薯5號(hào)的淀粉含量明顯高于商丘52-7。F1后代有超親表現(xiàn)，且呈連續(xù)分布，說明淀粉含量性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀，群體符合QTL定位的要求。通過對(duì)F1群體方差分析表明（表3）。淀粉含量不僅受基因型影響外，還受環(huán)境條件的影響。

表2 親本及F1群體淀粉含量的表型分析

表3 F1群體淀粉含量的方差分析

**顯著水平Significance levels at＜0.01

圖3 淀粉含量的頻率分布圖

由頻率分布圖（圖3）可知，2012年和2013年（兩點(diǎn)平均）甘薯的淀粉含量指標(biāo)在群體中表現(xiàn)明顯正態(tài)分布，在后代群體中分布的峰度和偏度均小于1，且均有一定數(shù)量的超親類型存在，呈現(xiàn)為連續(xù)變異，變異系數(shù)分別為19.74%和18.51%，具有數(shù)量性狀遺傳的典型特點(diǎn)，適于進(jìn)一步QTL分析。

2.4 甘薯淀粉含量的QTL分析

利用區(qū)間作圖法在2012年和2013年共檢測(cè)到17個(gè)與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL。其中，3個(gè)位于母本萬薯5號(hào)遺傳圖譜連鎖群上，14個(gè)位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上（表4，圖1—圖2）。

定位在母本的W.01連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間分別為21.70—26.77，與最近的標(biāo)記GDAAS0603A平均距離為2.5 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為31.9%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)樨?fù)的加性效應(yīng)，減少性狀表型值，2年分別為-2.93和-3.04。

定位在母本的W.10連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為3.00—8.74，與最近的標(biāo)記GDAAS0163A2平均距離為1.0 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為11.05%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值，2年分別為+3.43和+2.54。

定位在母本的W.28連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為0.00—29.00，與最近的標(biāo)記SIP010距離2年平均為5.0 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為17.2%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)樨?fù)的加性效應(yīng)，減少性狀表型值，2年分別為-2.01和-1.55。

定位在父本的S.01連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為62.07—72.35，與最近的標(biāo)記GDAAS0809A的距離2年平均為1.5 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為33.5%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+3.74和+3.17。

定位在父本的S.02連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為8.00—70.04，與最近的標(biāo)記GDAAS0519B距離2年平均為24.0 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為23.75%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.28和+1.96。

定位在父本的S.04連鎖群上，且在2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為60.89—81.6，在標(biāo)記unigene12034的位置，其2年平均貢獻(xiàn)率為10.10%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.49和+1.25。

定位在父本的S.05連鎖群上，且在,2年中均被檢測(cè)到，置信區(qū)間為14.00—26.68，在標(biāo)記GDAAS0603C的的位置，其2年平均貢獻(xiàn)率為10.15%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.46和+1.29。

定位在父本的S.07連鎖群上，只在2013年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為8.00—24.92，在標(biāo)記IBS121的位置，其2013年貢獻(xiàn)率為8.4%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+1.21。

定位在父本的S.09連鎖群上，只在2013年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為32.40—51.70，在標(biāo)記GDAAS0776B的位置，其2013年貢獻(xiàn)率為8.4%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+1.21。

定位在父本的S.10連鎖群上，只在2012年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為10.00—29.051，與最近的標(biāo)記SIP003的距離6.05 cM，其2012年貢獻(xiàn)率為14.6%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+1.77。

定位在父本的S.14連鎖群上，且在2年中均都檢測(cè)到，置信區(qū)間為60.20—75.33，在標(biāo)記IbY40的位置，其兩年平均貢獻(xiàn)率為13.10%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值,2年分別為+1.65和+1.57。

定位在父本的S.18連鎖群上，只在2012年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為97.02—105.02，與最近的標(biāo)記GDAAS0485的距離5.3 cM，其2012年貢獻(xiàn)率為24.4%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+2.35。

定位在父本的S.19連鎖群上，且在2年中均都檢測(cè)到，置信區(qū)間為52.6—68.6，與最近的標(biāo)記GDAAS0894的距離兩年平均為10.0 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為24.05%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.24和+1.17。

定位在父本的S.22連鎖群上，且在2年中均都檢測(cè)到，置信區(qū)間為0.00—38.00，與最近的標(biāo)記GDAAS0479A的距離兩年平均為18.5 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為27.5%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+2.35和+2.20。

定位在父本的S.34連鎖群上，且在2年中均都檢測(cè)到，置信區(qū)間為60.83—85.17，與最近的標(biāo)記GDAAS0102的距離兩年平均為2.1 cM，其2年平均貢獻(xiàn)率為14.15%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值2年分別為+1.74和+1.57。

定位在父本的S.35連鎖群上，只在2012年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為10.00—32.74，與最近的標(biāo)記GDAAS0035A3的距離12.74 cM，其2012年貢獻(xiàn)率為19.2%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+1.96。

定位在父本的S.54連鎖群上，只在2013年中檢測(cè)到，置信區(qū)間為68.64—70.88，與最近的標(biāo)記IbU20A4的距離1.44 cM，其2013年貢獻(xiàn)率為25.1%。母本萬薯5號(hào)的等位基因?yàn)榧有孕?yīng)，增加性狀表型值為+2.52。

表4 甘薯淀粉含量的QTL及其效應(yīng)分析

a1、a2：加性效應(yīng)，正值表示正向效應(yīng)的等位變異來自萬薯5號(hào)，負(fù)值表示負(fù)向效應(yīng)的等位變異來自商丘52-7

a1, a2: Additive effects, positive value indicates that positive effect allele is coming from Wanshu 5, negative value indicates that the negative effect allele is coming from Shangqiu52-7

3 討論

3.1 甘薯作圖標(biāo)記的選用

分子標(biāo)記是指基于生物個(gè)體之間DNA序列的差異而建立的遺傳標(biāo)記，是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選等研究的理想工具。衡量遺傳圖譜質(zhì)量的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記分布的均勻程度，而標(biāo)記類型是影響連鎖群上的標(biāo)記均勻分布與否的重要因素之一。

目前用于甘薯研究的分子標(biāo)記主要包括AFLP、RAPD、RFLP、SSR、EST-SSR，其中EST-SSR標(biāo)記成為構(gòu)建遺傳圖譜的新資源。EST-SSR標(biāo)記是采用高通量數(shù)據(jù)直接測(cè)序開發(fā)，cDNA又不含內(nèi)含子，300—400 bp的EST-SSR就能反映出基因的性質(zhì)，具有多、快、好、省的特點(diǎn)。同時(shí)EST-SSR標(biāo)記來自轉(zhuǎn)錄基因，可有效揭示基因的轉(zhuǎn)錄功能，標(biāo)記間的定位關(guān)系就是對(duì)基因組序列的定位，因而可直接用于甘薯遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因作圖，加速了甘薯新性狀基因的發(fā)現(xiàn)，所以EST-SSR標(biāo)記技術(shù)將在構(gòu)建甘薯遺傳圖譜中發(fā)揮重要的作用。

由于EST-SSR引物的特異性和開發(fā)的成本較高，目前，開發(fā)出的有關(guān)甘薯的EST-SSR引物較少，利用EST-SSR引物構(gòu)建的甘薯遺傳圖譜更少。本研究利用開發(fā)的EST-SSR引物[22-26]，首次開展了全部基于EST-SSR標(biāo)記的甘薯遺傳圖譜構(gòu)建研究，為以后甘薯圖譜構(gòu)建研究提供參考標(biāo)記，為甘薯重要品質(zhì)性狀的QTL定位提供更多的研究方法和分子標(biāo)記。

3.2 甘薯的遺傳圖譜

甘薯（2n=6x=90）是多倍體無性繁殖植物，因?yàn)橥瑫r(shí)具有其染色體數(shù)量多還不穩(wěn)定；自交不親和同一孕群內(nèi)品種間雜交不親和；材料間異交導(dǎo)致其遺傳組成高度雜合，且F1就大量分離等特點(diǎn)，是公認(rèn)的圖譜構(gòu)建、QTL定位等遺傳學(xué)研究較困難的主要農(nóng)作物[30]。Thompson等[9]采用RAPD標(biāo)記分析了引物的多態(tài)性，并構(gòu)建甘薯遺傳圖譜。Jie等[30]、Kriegner等[11]和Cervantes-Flores等[13]利用AFLP技術(shù)和“雙假測(cè)交”策略分別構(gòu)建了不同群體、連鎖群數(shù)量不等的雙親的遺傳圖譜，蒲志剛等[17]利用AFLP技術(shù)構(gòu)建了連鎖群數(shù)量較少的遺傳圖譜。吳潔等[16]和唐茜等[18]利用SRAP標(biāo)記構(gòu)建了連鎖群數(shù)量較少的遺傳圖譜，但李愛賢等[14]利用SRAP標(biāo)記構(gòu)建了2個(gè)親本的、連鎖群數(shù)量多的高密度分子連鎖圖譜。Zhao等[15]和Li等[31]利用AFLP和SSR兩種類型標(biāo)記，構(gòu)建2個(gè)親本密度高、連鎖群數(shù)量多的遺傳圖譜。以上研究只有吳潔等[14]、唐茜等[17]和蒲志剛等[15]利用雜交群體，構(gòu)建的是群體的圖譜，但均有連鎖群數(shù)量少、圖譜密度較小的不足。其他研究均采用了“雙假測(cè)交”策略，構(gòu)建的是雙親的遺傳圖譜。

本研究運(yùn)用EST-SSR標(biāo)記，采用JoinMap4.0軟件和“雙假測(cè)交”策略分別構(gòu)建父母本的連鎖遺傳圖譜。有215個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建在母本連鎖圖譜上，252個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)構(gòu)建在父本連鎖圖譜上，是目前構(gòu)建的EST-SSR標(biāo)記數(shù)量最多的甘薯遺傳圖譜。母本74個(gè)連鎖群圖譜總長(zhǎng)為3 826.07 cM，標(biāo)記間平均距離為17.80 cM，父本80個(gè)連鎖群圖譜總長(zhǎng)為3 955.0 cM，標(biāo)記間平均距離為15.7 cM，是連鎖群數(shù)量多、密度中等的遺傳圖譜。

本研究構(gòu)建的遺傳圖譜連鎖群數(shù)量母本為74個(gè)，父本為80個(gè)，與實(shí)際甘薯90個(gè)連鎖群數(shù)目有差異，主要是因?yàn)镋ST-SSR標(biāo)記在染色體上分布是隨機(jī)的，染色體上不同區(qū)域的交換值具有異質(zhì)性，出現(xiàn)大量小片段的連鎖群或連鎖上有較大的空隙。同時(shí)，甘薯為區(qū)段異源多倍體（多數(shù)同源），遺傳表現(xiàn)與正常的物種不同，在分子標(biāo)記條帶記錄上未表現(xiàn)出來，導(dǎo)致很多標(biāo)記不能與連鎖群對(duì)應(yīng)，也可能導(dǎo)致結(jié)論出現(xiàn)差異。增加群體數(shù)量、增加標(biāo)記數(shù)量、增加標(biāo)記種類有可能解決這些問題。

3.3 甘薯的QTL定位

淀粉含量是甘薯的主要品質(zhì)性狀，高淀粉含量的甘薯品種具有更高的利用價(jià)值，甘薯塊根干物質(zhì)含量又與淀粉含量顯著正相關(guān)，控制淀粉含量和干物質(zhì)含量的QTL定位是甘薯研究的重點(diǎn)。Cervantes- Flores等[19]的研究結(jié)果表明，淀粉含量受多基因控制的數(shù)量性狀，表現(xiàn)型是基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果。吳潔等[16]檢測(cè)到1個(gè)淀粉含量QTL，紅旗4號(hào)的加性效應(yīng)增加淀粉6.37%，解釋表型變異的20.1%。蒲志剛等[17]在綿粉1號(hào)遺傳圖的第2連鎖群上檢測(cè)到E1M722可作為淀粉的臨近QTL。李愛賢等[14]檢測(cè)到了1個(gè)主效位點(diǎn)，位于父本鄭薯20的Z31連鎖群上，QTL的加性效應(yīng)為-0.73，解釋表型變異的7.70%。唐茜等[18]檢測(cè)到1個(gè)淀粉含量QTL，BB3-26的加性效應(yīng)增加淀粉含量2.12%，解釋表型變異的21.3%。Zhao等[15]檢測(cè)到27個(gè)干物質(zhì)含量QTL，供獻(xiàn)率在9.0%—45%。Li等[31]定位了9個(gè)與塊根產(chǎn)量相關(guān)的主效QTL。以上研究定位的與淀粉含量相關(guān)的QTL較少，并且多數(shù)只是在1個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到，沒有考慮多個(gè)環(huán)境的影響。

本研究利用EST-SSR技術(shù)，在2012年和2013年共檢測(cè)到17個(gè)與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率在8.4%—40.5%。其中，3個(gè)位于母本萬薯5號(hào)遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中均檢測(cè)到相同的標(biāo)記。14個(gè)位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中有8個(gè)均檢測(cè)到相同的標(biāo)記。由于采用的是不同標(biāo)記類型和作圖群體，定位的QTL無法進(jìn)行相互比較和驗(yàn)證，這也是未來研究的方向。

3.4 QTL定位圖譜分布及加性效應(yīng)

采用不同的作圖群體，檢測(cè)到的QTL在親本圖譜上分布具有差異，其加性效應(yīng)也有差異。

與前人研究相比，Cervantes-Flores等[19]檢測(cè)到13個(gè)干物質(zhì)含量QTL。5個(gè)位于高干物質(zhì)親本連鎖圖譜上，其中，4個(gè)具有正加性效應(yīng)，1個(gè)具有負(fù)加性效應(yīng)；8個(gè)位于低干物質(zhì)親本連鎖圖譜上，其中4個(gè)具有正加性效應(yīng)，4個(gè)具有負(fù)加性效應(yīng)；同時(shí)還檢測(cè)到12個(gè)淀粉含量的QTL，5個(gè)位于高淀粉親本連鎖圖譜上，其中，3個(gè)具有正加性效應(yīng)，2個(gè)具有負(fù)加性效應(yīng)；7個(gè)位于低淀粉親本連鎖圖譜上，其中，3個(gè)具有正加性效應(yīng)，4個(gè)具有負(fù)加性效應(yīng)。Zhao等[15]檢測(cè)到的27個(gè)干物質(zhì)含量QTL，22個(gè)定位在高干率親本徐781的遺傳圖譜上，其中20個(gè)具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。5個(gè)定位在低干率親本徐薯18圖譜上，其中只有1個(gè)具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。Li等[31]定位的9個(gè)與塊根產(chǎn)量相關(guān)的主效QTL。4個(gè)定位在高產(chǎn)親本徐薯18的遺傳圖譜上，其中2個(gè)具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。5個(gè)定位在低產(chǎn)親本徐781的遺傳圖譜上，其中只有1個(gè)具有加性效應(yīng)，增加性狀的表型值。本研究定位的17個(gè)QTL，對(duì)于高淀粉親本萬薯5號(hào)的等位基因，15個(gè)QTL的加性效應(yīng)為正值，增加淀粉性狀的表現(xiàn)值，其中1個(gè)位于高淀粉親本萬薯5號(hào)遺傳圖譜連鎖群上，14個(gè)位于低淀粉親本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上。只有2個(gè)QTL加性效應(yīng)為負(fù)值，減少淀粉性狀的表型值，定位在高淀粉親本萬薯5號(hào)遺傳圖譜連鎖群上。出現(xiàn)這些差異可能具有2個(gè)方面的原因：一是選用的材料不同，萬薯5號(hào)是超高淀粉含量的甘薯品種（25%左右），而商丘52-7是超低淀粉含量的甘薯品種（5%左右），在一定概率范圍內(nèi)子代大多數(shù)超過低淀粉含量親本，增加表型性狀，表現(xiàn)為加性效應(yīng)；二是采用“雙假測(cè)交”的作圖方法，雙親分別作圖，控制高淀粉的等位基因在低淀粉性狀親本的遺傳圖譜上也能檢測(cè)到。這也印證了Cervantes- Flores等[19]在高淀粉育種中親本淀粉含量高有利于子代有利基因的積累的結(jié)論。

3.5 本研究需要說明的問題

由于采用的是不同分子標(biāo)記和研究群體，分子標(biāo)記間缺乏一致性，不同群體構(gòu)建的連鎖圖譜覆蓋的染色體區(qū)域存在差異，限制了遺傳圖譜和QTL間的相互比較。同時(shí)，由于公布的EST-SSR標(biāo)記數(shù)量太少，且本研究尚有大量的標(biāo)記不能構(gòu)建在連鎖遺傳圖譜上，造成2—3個(gè)標(biāo)記的連鎖群數(shù)量偏多。為了構(gòu)建高密度的甘薯分子連鎖圖譜，可增加EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量和群體的數(shù)量，或者添加更多的標(biāo)記種類，有利于甘薯QTL精細(xì)定位的后續(xù)研究。

4 結(jié)論

以高淀粉含量品種萬薯5號(hào)為母本、低淀粉含量品種商丘52-7為父本建立了189個(gè)雜交群體，分別構(gòu)建了基于EST-SSR標(biāo)記的雙親遺傳連鎖 圖譜。其中母本構(gòu)建了74個(gè)連鎖群，圖譜總長(zhǎng)為3 826.07 cM，標(biāo)記間平均距離為17.80 cM。父本構(gòu)建了80個(gè)連鎖群，圖譜總長(zhǎng)為3 955.0 cM，標(biāo)記間平均距離為15.7 cM。檢測(cè)到17個(gè)與淀粉含量性狀相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率在8.4%—40.5%。其中3個(gè)位于母本萬薯5號(hào)遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中均檢測(cè)到相同的標(biāo)記；14個(gè)位于父本商丘52-7遺傳圖譜連鎖群上，且在2年中有8個(gè)均檢測(cè)到相同的標(biāo)記，標(biāo)記GDAAS0603在雙親中和2個(gè)環(huán)境中同時(shí)檢測(cè)到，這些環(huán)境穩(wěn)定QTL可用于分子標(biāo)記輔助選擇。該研究豐富了構(gòu)建甘薯遺傳圖譜的標(biāo)記類型。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Genetic Linkage Map Construction Based on EST-SSR and Analysis of QTLs for Starch Content in Sweetpotato ((L.) lam.)

TANG Dao-bin1,2, ZHANG Kai2, LüChang-wen2, XIE De-bin2, FU Ti-hua1, WANG Ji-chun2

（1College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University/Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Southwest University/Sweetpotato Engineering and Technology Research Center, Chongqing 400716）

【Objective】To provide a theoretical and practical basis for utilization of germplasm resources of sweetpotato with high starch content and molecular marker-assisted selection in sweetpotato, a genetic linkage map was constructed by using molecular markers, and quantitative trait loci (QTLs) associated with starch content were identified. 【Method】 A F1hybrid population was developed from a cross between Wanshu 5, a sweetpotato cultivar with high starch content, as the female parent, and Shangqiu 52-7, a cultivar with low starch content, as the male parent. By using EST-SSR markers and the software of JoinMap4.0, the molecular genetic linkage maps of both parents were constructed based on the “double pseudo testcross” strategy, respectively. And QTLs for starch content trait were identified using composite interval mapping method based on the phenotypic data of F1population in two years (2012 and 2013).【Result】Among the 1 679 EST-SSR primer pairs primarily tested in F1lines, 1 045 polymorphic primer pairs were selected to screen in the population lines, and 1 418 polymorphic loci were obtained. The genetic linkage relationship of polymorphic loci were analyzed with the LOD≥5.0 as a threshold, and the genetic linkage map of female and male parents were constructed respectively. A total of 74 linkage groups for female parent were constructed based on 642 polymorphic loci, of which 215 (33.5%) loci were placed on the genetic linkage map. The number of markers in each linkage group ranged from 2 to 11. The length of linkage groups ranged from 2.0 to 156.8 cM, and the linkage map covered a total length of 3 826.07 cM, with an average distance between markers of 17.80 cM. A genetic linkage map for male Shangqiu52-7 was constructed by using 776 polymorphic loci, of which 250 (32.5%) loci distributed on 80 linkage groups. The number of markers in each linkage group ranged from 2 to 24. The length of linkage groups ranged from 2.0 to 156.8 cM, and the linkage map covered a whole length of 3 955.0 cM with an average interval of 15.7 cM between markers. Using QTL analysis software Map QTL 5.0 and Interval Mapping method, QTLs for starch content were identified based on the starch content measured in two years (2012 and 2013) and two environments. Seventeen QTLs for starch content were detected, explaining 8.4%-40.5% of the phenotypic variation. Three QTLs,, andmapped on the linkage group of female Wanshu 5 were detected under two environments. Fourteen QTLs were detected on the linkage group of male Shangqiu52-7, of which,,,,,,,were detected under two environments, and,,,,,were only detected under one environment. Mark GDAAS 0603 was detected simultaneously on the linkage groups of both parents and two environments. Those QTLs for starch content could be used in molecular marker-assisted selection of sweetpotato. 【Conclusion】Two genetic linkage map were constructed based on EST-SSR markers, and 17 QTLs for starch content of sweetpotato were identified. Results of the study has enriched the types of molecular markers used for genetic linkage map construction in sweetpotato.

sweetpotato; starch content; EST-SSR; genetic linkage map; QTL

2016-04-15；接受日期：2016-09-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31101192）、重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)重大項(xiàng)目（cstc2015shms-ztzx80002，cstc2015shms-ztzx80003，cstc2015shms-ztzx80004）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2012C102）

唐道彬，Tel：023-68250469；E-mail：tdbin741023@163.com。通信作者傅體華，E-mail：futihua@sina.com。通信作者王季春，E-mail：wchun1963@163.com