閆穎娟， 夏秀東， 李愛茹，董明盛*

(1.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

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泡菜發(fā)酵過程中菌相變化的研究

閆穎娟1,2， 夏秀東3， 李愛茹2，董明盛2*

(1.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州034000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

[目的]研究泡菜發(fā)酵過程中的菌相變化過程。[方法]以自制泡菜為研究對象，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對泡菜發(fā)酵過程中和泡菜成品的菌相進行了分析。[結(jié)果]發(fā)酵過程中的泡菜電泳圖上的條帶從發(fā)酵第1天的13條逐漸減少到第4天的11條再到第7天的9條，而泡菜成品中的條帶則只有明顯的2個條帶。[結(jié)論]隨著發(fā)酵過程的進行，泡菜最初的雜菌逐漸被優(yōu)勢菌抑制并最終取代。

發(fā)酵；泡菜；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

泡菜是一種獨特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，人們經(jīng)常食用，可攝入大量的乳酸菌及乳酸等代謝產(chǎn)物，它們能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，達到預(yù)防疾病和保健的目的[1]。通過對國內(nèi)外若干種含有乳酸菌的藥物及口服液等商品進行活菌數(shù)檢測表明，泡菜汁中活乳酸菌數(shù)遠遠高于此類商品，而且價廉物美、食用方便。家庭制作泡菜，不僅可作為傳統(tǒng)佐食，而且可成為具有我國傳統(tǒng)特色的、廉價的、高效的天然微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，這對提高我國人民身體健康水平有著積極的意義。但是，由于植物本身就帶有大量的微生物，所以在腌制過程中除乳酸菌生長繁殖以外，還會有多種微生物同時生長，對泡菜的風(fēng)味和質(zhì)量有較大的影響。因此，對泡菜發(fā)酵過程中菌相的變化進行深入研究有著重要的意義。

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是目前研究微生物遺傳多樣性和種群動態(tài)性最有力的分子生物學(xué)技術(shù)。1993年，Muyzer等[2]首次將該技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)的研究，在近10年的時間里已被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境微生物生態(tài)的研究。DGGE 的原理是在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，DNA 雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降。因此，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增得到的等長DNA 片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA 片段就會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度急劇下降，停留在與其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)分開的條帶[3]，可以直接用來分析細菌染色體基因[4]。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)測定方法可以取代傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法，克服了采用選擇培養(yǎng)基進行菌種分離時的種種困難。所以筆者選用PCR-DGGE的方法對泡菜發(fā)酵過程中菌相的變化進行分子生物學(xué)方面的鑒定，為進一步深入了解泡菜這一自然發(fā)酵過程，尋找如何減少雜菌生長的方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料：白菜，購自蘇果超市；泡菜成品發(fā)酵液，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供。主要儀器：LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海益恒實驗儀器有限公司；YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺，吳江市生化凈化設(shè)備廠；DJ300型電子天平，中國輕工業(yè)機械總公司常熟衡器工業(yè)公司；手提式高壓蒸汽消毒器，上海醫(yī)用核子儀器廠；DUG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海益恒實驗儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；WD900型微波爐，順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司；DYY-2C型電泳儀，北京市六一儀器廠；FR-980型電泳圖像分析系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；PCR儀、DGGE變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)，Bio-Rad；D-37520型離心機，Osterode德國。主要試劑:PCR試劑盒和DNA Marker均購自北京清華天為生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 泡菜的制作。將大白菜切分裝入三角瓶中壓實，倒入含3%白砂糖、2%食鹽的水溶液，封瓶放入28 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d。

1.2.2 菌種的分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2.1 基因組DNA提取[5]。取樣：每天從三角瓶中提5 mL的發(fā)酵液加入離心管中，離心12 500 r/min轉(zhuǎn)5 min，去上清后，用5 mL無菌水重懸沉淀，再離心12 500 r/min轉(zhuǎn)5 min，去上清，做2～3個重復(fù)；加入500 μL TES緩沖液(含有20 mg/mL溶菌酶)，37 ℃水浴鍋保溫0.5 h后，加入125 μL 20%的SDS提取液， 37 ℃水浴鍋中保溫15 min；加入等體積的酚-氯仿，混勻，離心7 000 r/min轉(zhuǎn)5 min，待分層后，取上層(重復(fù)3次氯仿抽提)；加入等體積的異丙醇，沉淀DNA，放入-20 ℃冰箱0.5 h；離心12 500 r/min轉(zhuǎn)30 min，取沉淀，去上清，加入1 mL 70%乙醇，重懸沉淀，離心12 500 r/min轉(zhuǎn)5 min，去上清，離心管倒置至無水珠掛壁，加入50 μL TES緩沖液，放入-18 ℃冰箱備用。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳。稱取1.0 g瓊脂糖，加100 mL電泳緩沖液(1×TAE)加熱熔化，直至完全溶解呈透明，膠液冷至60 ℃時，加入EB貯存液5 μL，混勻，緩慢澆注于制膠模板上，在膠一端插上梳子，待膠體凝固后，拔出梳子，將模具置于電泳槽中，加入1×TAE緩沖液，液面高于膠面2～3 mm，DNA樣品中以1∶5加入加樣緩沖液，上樣，接通電源100 mV，電泳1 h，切斷電源，取出凝膠，F(xiàn)R-980電泳圖像分析系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.2.3 PCR引物及反應(yīng)體系。細菌通用引物為EUB-338GC for：5′>CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG <3’；EUB-518 rev：5′> ATT ACC GCG GCT GCT GG < 3′。

PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA，2 μL EUB-338GC，2 μL EUB-518，5 μL PCR Buffer，4 μL dNTP，0.5 μLTaqDNA 聚合酶，34.5 μL ddH2O，總體積為50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：模板熱變性在94 ℃下反應(yīng)5 min，模板熱變性在94 ℃下10 s， 56 ℃下退火20 s ，68 ℃下延伸40 s，共進行35次循環(huán)，最后68 ℃下延伸7 min。產(chǎn)物檢測：同瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2.4 DGGE變性梯度凝膠電泳。將大、小2塊玻璃板，2個間隔條，1個樣品梳洗凈干燥待用，用夾子夾??；底部涂上一層薄的凡士林，移至固定架的橡皮條上固定；用不同體積的2種丙烯酰胺貯存液配制要求濃度的變性分離膠、濃縮膠；清洗梯度合成器并干燥，并關(guān)掉兩糟之間的活栓，將出口針頭置于大小玻璃之間并固定；將高低2種濃度的變性劑溶液加入10%過硫酸胺(APS)50 μL后加到梯度合成器的左右槽中；打開恒流泵開關(guān)以及兩槽的開關(guān)，分離膠灌完后，將針頭移至廢液瓶，沖洗梯度合成器的兩槽，開泵排出水分，關(guān)閉活栓并擦干；在濃縮膠中加入10% APS 50 μL，并將濃縮膠加入左槽；打開梯度合成器的泵，先用19 mL/min速度直至濃縮膠運行至距離針頭約1 cm處，再用1.1 mL/min速度，以后逐漸增大到3.0 mL/min將濃縮膠灌入2層玻璃之間；濃縮膠充滿后，在其的頂部插入樣品梳，凝固1 h以上。在電泳槽中加入新配制的電泳緩沖液(0.5×TAE)，打開電泳儀預(yù)熱以使得電泳緩沖液溫度達到60 ℃；去掉梳子，用電泳緩沖液沖洗加樣槽和膠底部的凡士林，并將其固定在電泳槽內(nèi)；點樣(PCR產(chǎn)物與加樣液緩沖液5∶1混合)；蓋上電泳儀的蓋子，電泳，先200 V，10 min，隨后85 V，16 h；將膠體從電泳槽中取出后放在塑料容器中，加入200 mL Cairns′固定液，搖3 min；將Cairns′固定液倒在容器中(備用)；添加200 mL銀染溶液在搖床上搖10 min；棄去銀染溶液，用蒸餾水清洗膠及容器；添加新鮮蒸餾水，添加顯影液，直至條帶清晰為止；棄去顯影液，加入Cairns′固定液，搖5 min；棄去固定液，加入蒸餾水，搖2 min，棄去蒸餾水，加入Cairns′保存液，搖7 min；取出膠體置于潔凈玻璃板上，干燥，掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液基因組DNA的提取 從泡菜發(fā)酵過程中的發(fā)酵液中提取DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。圖1結(jié)果表明，從發(fā)酵泡菜和成品泡菜中提取的DNA條帶清晰，說明該試驗所用DNA提取方法適用于發(fā)酵泡菜中細菌DNA的提取。DNA條帶下方亮條帶是RAN條帶，不會影響后續(xù)試驗。

注：EP.成品；1～7.從第1～7天的發(fā)酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7.圖1 泡菜發(fā)酵液DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoregrams of DNA in pickle juices

2.2 16S rDNA可變區(qū)DNA擴增 針對不同菌種的16S rDNA可變區(qū)含有不同的堿基對，以此為靶基因用PCR-DGGE進行區(qū)別。先將提取的DNA進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物。如圖2所示，試驗所提取的泡菜發(fā)酵液DNA經(jīng)PCR擴增，其產(chǎn)物的大小為200～300 bp，小于500 bp，可進行DGGE電泳。

注：EP.成品；1～7.從第1～7天的發(fā)酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7.圖2 16S rDNA可變區(qū)DNA擴增凝膠電泳Fig.2 Electrophoregrams of 16S rDNA

2.3 PCR-DGGE分析 圖3是泡菜成品以及發(fā)酵第1～7天產(chǎn)物的DGGE圖譜，圖譜上的泳帶反映了發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群，泳帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性說明了菌群的多樣性。該試驗通過對發(fā)酵過程中的不同時期發(fā)酵產(chǎn)物DGGE分析，來監(jiān)測發(fā)酵液中細菌群體變化過程。圖3顯示，發(fā)酵過程中的發(fā)酵產(chǎn)物在同一DGGE凝膠上進行圖譜分析表明，發(fā)酵產(chǎn)物第1天的一些優(yōu)勢泳帶在發(fā)酵第5天時消失。另一方面，沒有新的泳帶在第5天后出現(xiàn)。從總體看，隨時間延長，條帶的數(shù)量逐漸減少?？梢钥闯觯诎l(fā)酵前4 d內(nèi)，DGGE圖譜有變化，而在發(fā)酵第5天樣本DGGE間的相似值最高，看不出有顯著的變化，這與趙書欣等[6]的研究結(jié)果一致，發(fā)酵時間應(yīng)為5 d，第5天后其細菌群體變化速度較穩(wěn)定。這些結(jié)果說明，泡菜發(fā)酵過程中細菌群體在發(fā)酵前4 d內(nèi)有變化，而后緩慢，這可能是大多數(shù)雜菌的生長受到了抑制，逐漸被優(yōu)勢菌落所取代的結(jié)果。然而，泡菜成品僅有2條清晰的條帶，可知此產(chǎn)品中已經(jīng)沒有雜菌，只剩下了2個菌群。這可能是由于發(fā)酵泡菜在儲藏過程中優(yōu)勢菌繼續(xù)生長，雜菌被進一步抑制而造成的。

注：EP.成品；1～7.從第1～7天的發(fā)酵液中提取的DNA。Note:EP.end product; 1-7.DNA extracted from pickles juice from day 1 to day 7. 圖3 PCR-DGGE電泳Fig.3 Electrophoregrams of PCR-DGGE

3 結(jié)論與討論

國外有的學(xué)者在應(yīng)用DGGE進行研究時，對得到的DGGE單個條帶測序從而進行系統(tǒng)發(fā)育分析，其結(jié)果與直接形態(tài)觀察或純培養(yǎng)結(jié)果均呈現(xiàn)出一致性，證明了DGGE是一種快速、可靠的方法[7-8]。該試驗利用DGGE檢驗了泡菜在發(fā)酵過程中的菌相變化，但未進行DNA的測序，不能確定具體的菌種，也無法詳細分析泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌落，以及雜菌的類別。但趙書欣等[6]的研究結(jié)果證明，這些菌落為乳酸菌、芽孢桿菌、假單胞菌、腸桿菌屬歐文氏菌等。在后續(xù)試驗中應(yīng)進行DNA的測序、鑒別菌種，并尋找適合優(yōu)勢菌群快速生長的發(fā)酵條件，確定發(fā)酵過程中的動態(tài)參數(shù)，對發(fā)酵過程進行監(jiān)控。

Vallaeys等[9]發(fā)現(xiàn)，DGGE法并不能對樣品中所有的DNA片段進行分離。Muyzer等[2]指出，DGGE法只能對微生物群落中數(shù)量上大于1%的優(yōu)勢種群進行分析。因此以上分析具有一定的局限性，同時由于不同的菌落所需的溶菌酶的不同，以及PCR引物的不同，都會對圖譜產(chǎn)生影響。理論上，只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細，DGGE技術(shù)對于DNA片段的分辨率可以達到一個堿基差異水平，所以PCR-DGGE技術(shù)在菌落分析中仍大量使用。該研究結(jié)果表明，在泡菜的發(fā)酵過程中細菌群體在發(fā)酵前4 d內(nèi)有變化，而后緩慢，電泳圖上的條帶從第1天的13條到第4天的11條再到第7天的9條，說明發(fā)酵開始時的大多數(shù)菌群在發(fā)酵過程中逐漸被優(yōu)勢菌所取代。

泡菜在發(fā)酵初期含有大量的雜菌，在發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌會抑制雜菌的生長，并最終取代雜菌；在該泡菜制作條件下發(fā)酵4 d便可使發(fā)酵泡菜體系中的菌相達到穩(wěn)定狀態(tài)，但是泡菜經(jīng)儲藏后優(yōu)勢菌會進一步抑制其他細菌并最終占絕對優(yōu)勢。

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Study on Microflora Changes during Fermentation of Pickles

YAN Ying-juan1,2,XIA Xiu-dong3,LI Ai-ru2,DONG ming-sheng2*

(1.Department of Biology,Xinzhou Teachers University,Xinzhou,Shanxi 034000; 2.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing,Jiangsu 210095; 3.Institute of Agro-product Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing,Jiangsu 210014)

[Objective] In order to analyze the changes of microflora during the fermentation of pickles.[Method] With homemade pickles as research object,denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was applied.[Result] The results showed that the strips were gradually reduced from 13 strips at day 1 to 11strips at day 4 and to 9 strips at day 7.There were only 2 strips in the end product.[Conclusion] The original mixed bacteria were gradually replaced by do minant bacteria.

Fermentation; Pickles; PCR-DGGE

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(31501460)。

閆穎娟(1987- )，女，山西忻州人，講師，碩士，從事發(fā)酵工程研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事食品微生物與發(fā)酵工程研究。

2016-09-14

TS 201.3

A

0517-6611(2016)31-0037-03