張曉芬，冶貴生，文熙萍，祁秀清

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016)

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藏羊IFN-γ基因的擴(kuò)增、序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

張曉芬，冶貴生*，文熙萍，祁秀清

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016)

為了研究藏羊IFN-γ基因的功能，提取藏羊脾臟總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增藏羊IFN-γ基因并測(cè)序，應(yīng)用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析及編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，藏羊IFN-γ基因長(zhǎng)度為429 bp，其中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量較高，該基因編碼143個(gè)氨基酸，其中疏水性氨基酸和親水性氨基酸的含量較高。藏羊IFN-γ基因與參考綿羊、山羊、藏羚羊和牛IFN-γ基因的核苷酸序列同源性依次為100%、99.3%、99.1%和97.2%，氨基酸序列同源性依次為100%、99.3%、99.3%和95.8%。IFN-γ蛋白主要由α螺旋組成，親水性較高，含有5種蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)，分別為1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)、2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、2個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

藏羊；IFN-γ基因；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；序列分析；蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

藏羊(Tibetan sheep)又稱藏系綿羊，生活在青藏高原，青海境內(nèi)主要分布于黃南、玉樹、果洛、海北、海南和海西6個(gè)州，青海藏羊能夠適應(yīng)高海拔、高寒的生態(tài)環(huán)境，且抗病力很強(qiáng)[1]。干擾素(interferon,IFN)是一種由免疫細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。IFN-γ又稱為免疫干擾素，是Ⅱ型干擾素的一種，較Ⅰ型干擾素具有較強(qiáng)的免疫活性，一方面能激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，另一方面又能抑制B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，從而抑制Ⅰ型過敏反應(yīng)[2-3]，其最主要的免疫調(diào)節(jié)活性是通過提高M(jìn)HC分子的表達(dá)來促進(jìn)抗原提呈[4]。Mcinnes C J等[5]首次克隆出了綿羊IFN-γ基因，該基因編碼166個(gè)氨基酸，其中23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。IFN-γ可以用來檢測(cè)動(dòng)物的細(xì)菌性或病毒性感染，Nagata R等[6]研究表明,可以通過測(cè)定IFN-γ的水平來早期診斷牛羊是否感染分支桿菌。另外，IFN-γ是一種新型的免疫佐劑，不僅能增強(qiáng)疫苗的免疫效果，而且還能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力[7]。目前，還未見有關(guān)藏羊IFN-γ的研究報(bào)道，本研究通過RT-PCR擴(kuò)增了藏羊IFN-γ基因，并應(yīng)用DNA Star軟件進(jìn)行序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，為青海藏羊IFN-γ基因功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脾臟 青海高原型藏羊脾臟采自西寧市某屠宰場(chǎng)，液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 EASY Spin Plus組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ExTaqDNA聚合酶、瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI登錄的綿羊IFN-γ基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成，預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為429 bp。引物序列如下：IFN-γ-F：5′-GCACCCACTCGCCAACCC-3′，IFN-γ-R：5′-CTTCTGGACTGGTTCCCAGCAGTC-3′，合成的引物溶解后稀釋成20 μmol/L的工作濃度。

1.2.2 總RNA的提取 按照EASY Spin Plus組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明書提取藏羊脾臟中的總RNA。

1.2.3 RT-PCR 取藏羊脾臟總RNA 6 μL，下游引物2 μL，dNTP Mixture 2 μL，65℃預(yù)熱5 min，然后立即冰浴2 min，加入5倍的反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase-Free ddH2O 4 μL。得到cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：PCR buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，IFN-γ上游引物1 μL，IFN-γ下游引物1 μL，cDNA 3 μL，DNA聚合酶0.5 μL，加去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.4 序列測(cè)定與分析 擴(kuò)增產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，然后應(yīng)用DNA Star軟件對(duì)IFN-γ基因序列進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用DNA Star軟件預(yù)測(cè)藏羊IFN-γ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性，應(yīng)用PredictProtein和I-Tasser在線服務(wù)器分別預(yù)測(cè)IFN-γ蛋白的修飾位點(diǎn)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果

RNA所在泳道出現(xiàn)目的條帶，28 S的量為18 S的2倍，因此提取的總RNA能夠作為下一步反轉(zhuǎn)錄的模板 (圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.脾臟總RNA

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Total RNA of spleen

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 IFN-γ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)得IFN-γ基因擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期的429 bp片段大小相符，且條帶明顯。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2.IFN-γ基因

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control; 2.IFN-γ gene

圖2 IFN-γ基因瓊脂糖凝膠電泳

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of IFN-γ gene

2.3 IFN-γ基因序列分析

2.3.1 核苷酸序列分析 核苷酸序列分析結(jié)果表明(表1)，IFN-γ基因長(zhǎng)度為429 bp，其堿基中含有較多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。

2.3.2 氨基酸序列分析 氨基酸序列分析結(jié)果表明(表2)，IFN-γ基因片段編碼143個(gè)氨基酸，其中疏水性氨基酸的含量最高。

2.3.3 同源比對(duì)分析 將獲得的藏羊IFN-γ基因與NCBI登錄的綿羊(DQ410715.1)、山羊(NM-001285682.1)、藏羚羊(XM-005968140.1)和牛(FJ263670.1)IFN-γ基因的核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明(圖3～圖5)，藏羊與綿羊IFN-γ基因的核苷酸序列同源性最高，為100%；相對(duì)于山羊IFN-γ基因核苷酸序列存在3處堿基突變，同源性為99.3%；相對(duì)于藏羚羊IFN-γ基因核苷酸序列存在4處堿基突變，同源性為99.1%；相對(duì)于牛IFN-γ基因核苷酸序列存在12處堿基突變，同源性為97.2%。另外，藏羊IFN-γ基因與上述基因的氨基酸序列同源性依次為100%、99.3%、99.3%和95.8%。

表1 IFN-γ基因核苷酸序列分析

表2 IFN-γ基因氨基酸序列分析

圖3 IFN-γ基因核苷酸序列同源性比較

圖4 IFN-γ基因核苷酸序列同源性百分比

圖5 IFN-γ蛋白氨基酸序列同源性百分比

2.4 IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Garnier-Robson方法預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖6)，IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)中α螺旋占66.4%，分布區(qū)域?yàn)?-15、28-46、54-81、87-96、101-119和122-128位氨基酸；β折疊占6.29%，主要分布區(qū)為47-53位氨基酸；β轉(zhuǎn)角占11.2%，在肽段N端和C端有少量分布，主要區(qū)域?yàn)?1-24、129-133和136-139位氨基酸；無規(guī)則卷曲占16.8%，主要分布區(qū)域?yàn)?-3、18-20、25-27、82-86和140-143位氨基酸。

Chou-Fasman方法預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖6)，IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)中α螺旋占52.4%，分布區(qū)域?yàn)?-18、28-38、56-59、75-82、87-120和125-129位氨基酸；β折疊占16.8%，在肽段中只有2個(gè)分布區(qū)，在43-55和64-74位氨基酸；β轉(zhuǎn)角占25.2%，分布區(qū)域?yàn)?-5、19-26、39-42、60-63、83-86、121-124和132-139位氨基酸。

2.4.2 親水性預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖7)，IFN-γ蛋白具有很強(qiáng)的親水性，主要分布區(qū)為2-24、33-45、57-68、75-95、103-111、119-143位氨基酸。

2.4.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)IFN-γ蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)后得到5種模型，C-score值分別為：模型1：1.36，模型2：-1.99，模型3：-2.27，模型4：-2.52，模型5：-2.41，所有模型的C-score值均在[-5，2]的置信區(qū)間內(nèi)，其中模型1的C-score值最大，可信度最高。如圖所示(圖8)，IFN-γ蛋白結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.4.4 蛋白修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè) 修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，IFN-γ蛋白含有1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，為18-21位的SNPD；1個(gè)酰胺化位點(diǎn)，為137-140位的RGRR；2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，為16-19位的NASN和83-86位的NGSS；2個(gè)cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，為129-132位的RKRS和139-142位的RRAS；3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別為40-42位的SDK、86-88位的SEK和121-123位的SPK。

圖6 IFN-γ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖7 IFN-γ蛋白親水性

3 討論

藏羊是青藏高原特有的種質(zhì)資源，在高海拔和缺氧環(huán)境中，具有很強(qiáng)的抗病力。IFN-γ具有免疫調(diào)節(jié)作用，是增強(qiáng)藏羊抗病力的重要因子，其主要功能是促進(jìn)MHCⅠ類和MHCⅡ類抗原的遞呈。IFN-γ能夠誘導(dǎo)免疫蛋白酶體的形成，使其水解和加工MHCⅠ類抗原，并增加抗原肽的產(chǎn)量和多樣性[8]。它還能促進(jìn)抗原提呈相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體TAP的表達(dá)，使TAP將抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)并提呈給MHCⅠ類分子，間接提高M(jìn)HCⅠ類抗原肽的提呈效率[9-10]。此外，在所有干擾素中，只有IFN-γ能夠促進(jìn)MHCⅡ類抗原的提呈，它所生成的反式作用元件能和MHC基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件相結(jié)合而調(diào)控MHC基因轉(zhuǎn)錄，激活T淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步清除外源性抗原[7,11]。IFN-γ作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，既可以單獨(dú)用于一些疾病的預(yù)防、診斷和治療，還可以作為免疫佐劑。姜逸等[12]在雞傳染性支氣管病毒疫苗株上插入雞IFN-γ基因，構(gòu)建了重組病毒。海崗[13]將山羊IFN-γ基因插入到山羊痘病毒中，構(gòu)建了共表達(dá)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1和山羊IFN-γ的重組山羊痘病毒，為研制安全高效的重組山羊痘病毒疫苗找到可行的方法。本研究通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了藏羊IFN-γ基因，并進(jìn)行了序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，研究結(jié)果可為藏羊IFN-γ基因抗病功能的研究及相關(guān)免疫佐劑的研制提供參考。

A.模型1；B.模型2；C.模型3；D.模型4；E.模型5

經(jīng)過同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，藏羊與綿羊IFN-γ基因的核苷酸和氨基酸同源性均為100%；相對(duì)于羊的不同品種，藏羊IFN-γ基因與藏羚羊和山羊IFN-γ基因的同源性很高，達(dá)到了99%以上；與牛IFN-γ基因的核苷酸序列同源性也較高，達(dá)到了97.2%，說明IFN-γ基因具有相對(duì)種屬特異性，親緣關(guān)系越近同源性越高。此外，目前還未見有關(guān)羊Ⅱ型干擾素亞型的報(bào)道，說明羊IFN-γ基因具有高度保守性。

經(jīng)預(yù)測(cè)得知藏羊IFN-γ蛋白有5種功能位點(diǎn)，其中酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CK Ⅱ)是Ser/thr類蛋白激酶，可以磷酸化IFN-γ蛋白的Ser/thr氨基酸，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞[14]。C端氨基酸殘基酰胺化的作用可能是保護(hù)IFN-γ蛋白免受酶的降解作用從而延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期或加強(qiáng)與受體的親和力[15]。IFN-γ蛋白是一種分泌性糖蛋白，有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site,ASN)，糖基化與IFN-γ在體內(nèi)的半衰期有關(guān)[2]，也有可能用來識(shí)別細(xì)胞膜表面的受體[16]，激活宿主免疫應(yīng)答。環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosnhate,cGMP)作為第二信使，可能在IFN-γ基因表達(dá)過程中起到信號(hào)傳導(dǎo)的作用[17]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是參與T淋巴細(xì)胞活化的重要分子，可能對(duì)CD3+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ有重要作用，在PKC和胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)的共同作用下激活I(lǐng)FN-γ基因[18]，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。

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Amplification,Sequence Analysis and Protein Structure Prediction of IFN-γ Gene of Tibetan Sheep

ZHANG Xiao-fen,YE Gui-sheng,WEN Xi-ping,QI Xiu-qing

(CollegeofAgricultureandAnimalHusbandry,QinghaiUniversity,StateKeyLaboratoryofPlateauEcologyandAgriculture,Xining,Qinghai,810016,China)

In order to study the function of IFN-γ gene of Tibetan sheep,the total RNA was extracted from spleen of Tibetan sheep firstly,then the IFN-γ gene of Tibetan sheep was amplified by RT-PCR and sequenced.Finally,the DNA Star software was used to analyze the gene sequence and predict the protein structure.The result showed that the length of IFN-γ gene was 429 bp,with a higher content of adenine and thymine,and it encoded 143 amino acids,among which hydrophobic amino acids and polar amino acids were richer.The nucleotide sequence homology of IFN-γ gene with that ofOvisaries,Caprahircus,PantholopshodgsoniiandBostauruswere 100%,99.3%,99.1% and 97.2% respectively,and the amino acid sequence homology were 100%,99.3%,99.3% and 95.8% respectively.In addition,the IFN-γ protein was mainly composed of α-helix,its hydrophilicity was high ,and it contained five kinds of protein functional sites,including one casein kinase II phosphorylation site,one amidation site,two N-glycosylation sites,two cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites and three protein kinase C phosphorylation sites.These results provided some

for studying the immune function of IFN-γ gene of Tibetan sheep in Qinghai province.

Tibetan sheep; IFN-γ gene; RT-PCR; sequence analysis; protein structure prediction

2016-08-04

青海省科技廳項(xiàng)目(2016-ZJ-738);青海大學(xué)“123高層次人才培養(yǎng)工程”項(xiàng)目

張曉芬(1992-)，女，青海西寧人，碩士研究生，主要從事分子病原生物學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.4;Q343.1

A

1007-5038(2016)11-0008-06