王吉平，張 堤，張春林，趙文靜，張 晶，翟素珍

(貴州醫(yī)科大學生物學教研室，貴州貴陽 550025)

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致倦庫蚊天蠶素CecB2基因的原核表達及蛋白純化

王吉平，張 堤，張春林*，趙文靜，張 晶，翟素珍

(貴州醫(yī)科大學生物學教研室，貴州貴陽 550025)

構建致倦庫蚊(貴陽株)天蠶素B2(CecB2)基因原核表達載體，并原核表達獲得重組蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表達載體pET32a(+)上，將成功構建的pET32a-CecB2重組表達質粒轉化大腸埃希菌Rosetta中經IPTG誘導表達，對IPTG誘導濃度和誘導時間優(yōu)化后表達所得目的蛋白采用鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE和Western blot檢測鑒定表達蛋白。結果表明，成功構建原核表達載體pET32a-CecB2，IPTG濃度和時間優(yōu)化結果為IPTG濃度為0.05 mmol/L，誘導時間為3 h。SDS-PAGE檢測獲得大小約25 ku的可溶性純化蛋白，Western blot鑒定純化蛋白可與鼠抗His-tag單克隆抗體發(fā)生抗原抗體結合反應。說明所構建原核表達載體pET32a-CecB2能在大腸埃希菌中可溶表達，為進一步研究其生物學功能奠定了基礎。

致倦庫蚊；天蠶素基因；原核表達；蛋白純化

天蠶素抗菌肽是一種陽離子抗菌肽，由Boman等瑞典科學家最早于20世紀70年代至80年代從惜古比天蠶(Hyalophoracecropia)蛹中發(fā)現[1]，是一種廣譜殺菌、具有潛在開發(fā)應用價值的抗菌肽，不僅在抗細菌、真菌、寄生蟲和原蟲、病毒及腫瘤方面表現出不同程度的抗性，在天然免疫中還具有調節(jié)免疫，促進中性粒細胞、T細胞的化學趨化和促進傷口愈合等作用[2]。天蠶素抗菌肽由31～39個氨基酸組成，分子質量大小為3.5 ku～4 ku，分子結構特點為N端雙親性α-螺旋，C端疏水性α-螺旋，屬于α-螺旋類抗菌肽，該肽發(fā)揮抗菌作用與這種獨特的結構密切相關[3]。有別于傳統(tǒng)抗生素，天蠶素通過在細菌質膜上形成小孔，導致細胞內容物外流致使細菌死亡，從而不易產生耐藥性[4]；另外，天蠶素雖具有較強的抗菌活性和較廣的抑菌譜，但對真核細胞低毒性[5]。

已報道的天蠶素(Cecropins)主要有A、B、C、D、E、F等類型及類似物Factor G和Cecropin Ps。其中，Cec B是多種類型中抗菌活性最強的，已應用于多個研究領域。鄒修平等[6]將人工合成的兩個含有信號肽的Cec B基因轉化塔羅科血橙(CitrussinensisOsbeck)上胚軸，獲得轉基因植株，提高了血橙抗?jié)儾∷剑?Wu C等[7]臨床研究發(fā)現天蠶素Cec B 能夠選擇性的識別細胞毒素和抗惡性細胞增生，可抑制人肝癌細胞HepG-2增殖。目前，在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、家蠶(Bombyxmori)、家蠅(Muscadomestica)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、小菜蛾(Plutellaxyllostella)、煙草天蛾(Maducasexta)等昆蟲中已發(fā)現多種天蠶素家族抗菌肽及其類似物[8]，在多種物種中已開始功能研究。而對于致倦庫蚊天蠶素的研究僅見零星報道[9-10]。本文利用分子生物學手段，對致倦庫蚊CecB2基因進行體外表達研究，為進一步研究其生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及耗材 DNA標準DL 2 000、限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶為寶生物工程(大連)有限公司產品；2×TaqPCR Star Mix、蛋白分子質量標準、DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自北京康潤生物科技有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthjo-β-D-galactoside，IPTG)、氨芐青霉素、氯霉素為北京索萊寶科技有限公司產品；一抗抗體Anti-His Antibody小鼠抗單克隆抗體購于天根生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG(二抗)為武漢博士德公司產品；其他化學試劑為國產分析純；引物合成及質粒測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.1.2 試驗材料 致倦庫蚊(貴陽株)由貴州醫(yī)科大學生物學教研室長期飼養(yǎng)繁殖；pET32a(+)原核表達載體及大腸埃希菌(E.coli)Rosetta、宿主菌DH5α由貴州醫(yī)科大學生物學教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank上公布的致倦庫蚊天蠶素基因CecB2序列( Accession :XM-001861707.1)，用軟件SignalP4.1預測其信號肽位置并應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，擴增CecB2成熟肽的上下游引物分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(下劃線部分)，并命名為CxCec-F和CxCec-R。CxCec-F：5′-CGGGATCCGGTGGTCTCAAAAAGT-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點,CxCec-R：5′-CCCAAGCTTTTTTG GTCCAA GTGCAT-3′，下劃線部分為HindⅢ酶切位點。

1.2.2 PCR擴增CecB2成熟肽基因 以課題組前期所得pMD-CecB2陽性克隆菌液為模板PCR擴增CecB2成熟肽序列。擴增體系為20 μL，包括2×TaqPCR Star Mix 10 μL，模板菌液1 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌水補足20 μL。擴增條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.3 陽性克隆篩選及鑒定 pET32a(+)經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后進行質粒DNA切膠回收，同樣雙酶切1.2.2中所得DNA回收產物。用T4 DNA連接酶將回收質粒DNA與酶切CecB2基因片段按1∶3濃度比16℃連接過夜，轉化DH5α感受態(tài)細胞，交叉PCR驗證初步篩選陽性克隆并抽提重組質粒，重組質粒經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后將陽性克隆菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果經序列比對正確后命名為pET32a-CecB2。

1.2.4 誘導表達條件時間和濃度的優(yōu)化 將鑒定的菌液按1∶50轉接含有氨芐青霉素(Amp)和氯霉素(Cam)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。次日以同上比例將過夜培養(yǎng)的菌液轉接至新的含同上抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm為 0.5左右。取8個培養(yǎng)管加入終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃ 200 r/min誘導表達3 h，經15 g/L的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色分析，確定最佳誘導濃度。再以確定的最佳誘導濃度分別誘導重組菌液0、1、2、3、4、5、6、7 h后取樣，經15 g/L SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色分析，確定其最佳誘導濃度。

1.2.5 重組蛋白大量表達及可溶性檢測 以優(yōu)化的濃度和時間于37℃下對重組菌進行大量誘導表達。誘導結束后，離心收集菌體，菌體沉淀重懸于按His-鎳蛋白純化套裝中配方配制的結合液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.9，10 mmol/L 咪唑，0.5 mmol/L NaCl)中，反復凍融3次，在冰浴中超聲碎菌(100 W，超聲5 s，停6 s，重復80次)。4℃、12 000 r/min離心30 min，分離上清和沉淀。150 g/L SDS-PAGE電泳檢測蛋白可溶性，再按照His-鎳蛋白純化套裝說明進行上清純化或沉淀變性后純化。

1.2.6 純化蛋白Western blot鑒定 將純化后的CecB2蛋白進行2.5 mA/cm2電流半干轉40 min轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，1×PBST配制的50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗6×His-tag(一抗1∶1 000)室溫孵育2 h，1×PBST洗膜3次，每次5 min，山羊抗鼠IgG(二抗：1∶10 000)室溫孵育2 h，1×PBST洗膜3次，每次5 min，DAB顯色試劑盒顯色觀察結果。

2 結果

2.1 CecB2成熟肽基因PCR結果

以pMD-CecB2陽性克隆菌液為模板，PCR擴增CecB2成熟肽基因后核酸電泳顯示，在約120 bp位置有一條特異條帶，大小與預期擴增長度相符(圖1)。測序結果證實與GenBank上的致倦庫蚊天蠶素基因去信號肽后的成熟肽基因序列一致。

M.DNA標準DL 2 000; B2.CecB2 基因成熟肽PCR產物

M.DNA Marker DL 2 000；B2.Mature peptide PCR products of CecB2 gene

圖1 CecB2基因成熟肽基因PCR擴增結果

Fig.1 The mature peptide PCR results of CecB2 gene

2.2 pET32a-CecB2克隆菌的交叉PCR鑒定結果

用通用引物T7F/R與特異性引物CxCec-F及CxCec-R進行陽性克隆的交叉PCR驗證?？梢奀xCec-F和T7R引物對所擴增出的產物片段約為250 bp，而T7F和CxCec-R引物對所擴增出的產物片段約為750 bp，這與預期大小一致(圖2)。由此可知，所挑選克隆菌初步認定為陽性克隆，目標序列CecB2是以正確的方向插入pET32a載體中。

M.DNA標準DL 2 000；1.CxCec-R和T7F擴增產物；2.T7R和CxCec-F擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of CxCec-R and T7F; 2.PCR products of T7R and CxCec-F

圖2 陽性克隆菌PCR鑒定

Fig.2 Identification of the positive clones by PCR

2.3 pET32a-CecB2質粒雙酶切及測序鑒定結果

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pET32a-CecB2重組質粒，核酸電泳檢測結果顯示酶切后的pET32a-CecB2在約120 bp的位置出現了一條與PCR成熟肽擴增產物大小一致的條帶，而在約6 000 bp得位置有一條大小與空質粒pET32a(+)雙酶切后大小一致的條帶(圖3)，綜合結果2.2說明目的基因與載體連接成功。將測序結果與目的基因序列比對，結果完全一致，說明成功構建了重組表達載體pET32a-CecB2。

2.4 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

SDS-PAGE電泳顯示(圖4和圖5)，終濃度為0.05 mmol/L時目的蛋白的表達量較高，且濃度的增加并沒有引起目的蛋白表達量的明顯增加。以0.05 mmol/L IPTG濃度進行誘導表達時，1 h～4 h表達量較高，目的蛋白可能對宿主細胞產生了毒性作用或細胞內蛋白酶較敏感，致使5 h～7 h時蛋白出現了類似降解的現象。

2.5 重組蛋白大量表達及可溶性檢測結果

IPTG濃度為0.05 mmol/L，表達時間為3 h，37℃大量誘導表達，離心所得菌體重懸后超聲破碎并離心分離得到上清和沉淀，樣品經SDS-PAGE電泳檢測結果顯示(圖6)，重組蛋白主要以可溶形式表達。His-鎳蛋白純化柱純化獲得大小約25 ku的融合蛋白，與預期結果相符。

M1.DNA標準λ-HindⅢ；M2.DNA標準DL 2 000 ；1.質粒pET32a(+)；2.經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的空質粒pET32a(+)；3.重組質粒pET32a-CecB2；4.經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的重組質粒pET32a-CecB2；5.PCR產物

M1.DNA Marker λ-HindⅢ; M2.DNA Marker DL 2 000; 1.Products of pET32a(+) plasmid; 2.Products of pET32a(+) digested byBamHⅠ andHindⅢ; 3.The recombinant plasmid pET32a-CecB2; 4.Products of pET32a-CecB2 digested byBamHⅠ andHindⅢ; 5.PCR products

圖3 pET32a-CecB2重組質粒的酶切鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET32a-CecB2 by enzyme digestion

M.蛋白分子質量標準；1.pET32a-CecB2誘導前；2～9.0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG濃度誘導重組菌

M.Protein molecular weight Marker；1.CecB2 expression before IPTG inducted； 2-9.Products of CecB2 inducted with 0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L IPTG,respectively

圖4 不同IPTG濃度對重組蛋白表達量的影響

Fig.4 The effect of different IPTG concentrations on expression levels of recombinant proteins

2.6 Western blot鑒定純化蛋白

以鼠抗His-tag單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶山羊抗鼠IgG為二抗,Western blot免疫印記經DAB顯色(圖7)顯示，免疫印跡反應呈陽性反應，在約25 ku處出現一條特異性條帶，與預測的重組蛋白大小相符。

3 討論

致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)屬于昆蟲綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、長角亞目(Nematocera)中的蚊科(Culicidae)，是一類重要的醫(yī)學昆蟲。致倦庫蚊呈世界性分布，其滋生環(huán)境復雜，攜帶多種病原體，能夠抵御多種病原體侵襲，推測其具有強大的天然免疫防御系統(tǒng)。因此，對致倦庫蚊先天免疫分子的深入研究有助于了解其在致倦庫蚊體內的免疫防御機制。

M.蛋白分子質量標準；1.pET32a-CecB2誘導前；2～9.0、1、2、3、4、5、6、7 h誘導的重組菌

M.Protein molecular weight Marker； 1.CecB2 expression before IPTG inducted；2-9.Products of CecB2 induction for 0,1,2,3,4,5,6,7 h respectively

圖5 不同誘導時間對重組蛋白表達量的影響

Fig.5 The effect of different induction time on expression levels of recombinant proteins

M.蛋白分子質量標準；1.pET32a(+)誘導前；2.pET32a(+)誘導后；3.pET32a-CecB2誘導前；4.pET32a-CecB2誘導后；5.上清；6.沉淀；7.純化蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET32a(+) vector expression before IPTG induction；2.pET32a(+) vector expression after IPTG induction；3.CecB2 expression before IPTG induction；4.CecB2 expression after IPTG induction；5.Supernatant；6.Precipitate；7.Purified proteins

圖6 重組蛋白純化

Fig.6 Purification of the recombinant protein

M.蛋白分子質量標準；1.pET32a(+)誘導前；2.pET32a(+)誘導后；3.pET32a-CecB2誘導前；4.純化蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET32a(+) vector expression before IPTG induction；2.pET32a(+) vector expression after IPTG induction；3.CecB2 expression before IPTG induction；4.Purified proteins

圖7 Western blot鑒定純化蛋白

Fig.7 Identification of purified protein by Western blot

天蠶素抗菌肽作為昆蟲免疫系統(tǒng)重要成分，是一種小分子多肽，體外表達時對宿主易產生毒性，若直接在表達宿主中進行表達，不僅產量不高，也容易受到宿主細胞蛋白酶的降解[11]。本試驗采用融合表達的方式將CecB2基因成熟肽定向克隆到pET表達載體中實現原核表達。與真核表達系統(tǒng)和昆蟲表達系統(tǒng)相比，大腸埃希菌具有繁殖力強、生產周期短、產量高且成本低等優(yōu)點，所以常常作為基因工程表達的首選宿主[12]。pET原核表達載體是一種應用廣泛的載體，可提供多個純化標簽如His標簽，Trx標簽和S標簽，便于外源蛋白的分離純化。本試驗選用pET32a表達載體帶有的6×組氨酸(His-Tag)序列作為融合表達標簽，簡化了蛋白純化和免疫印跡鑒定[13]。

外源蛋白的表達受多種因素的影響，為得到高效表達的融合蛋白，研究者們通常會對表達條件進行優(yōu)化。海力且木·艾力等[14]對光滑鱉甲抗菌肽原核表達條件優(yōu)化發(fā)現低濃度短時間及低溫低轉速可增加可溶性蛋白表達量；Salimi A等[15]通過對血管內皮生長因子(VEGF)165在大腸埃希菌中表達時的誘導溫度、誘導濃度等表達條件的優(yōu)化，得到VEGF165可溶性最高表達的最佳條件。本試驗對IPTG濃度和誘導時間進行優(yōu)化，發(fā)現在低濃度0.05 mmol/L時重組蛋白就可高表達，且在此濃度條件下誘導1 h～4 h內重組蛋白表達量相近，而誘導5 h后目的蛋白出現了類似降解的現象，7 h時又表現出回緩的趨勢，推測該融合蛋白可能會對宿主細胞產生毒性作用或與細胞內蛋白酶的敏感性特性有關。然而本試驗這些結果只是對優(yōu)化濃度條件下的時間優(yōu)化結果，在更低濃度或低溫條件下是否會有所改善將在下一步試驗中繼續(xù)驗證。

本試驗通過分子生物學手段成功構建了致倦庫蚊CecB2基因成熟肽原核表達載體，可在原核表達系統(tǒng)中以可溶性形式表達，為下一步研究致倦庫蚊天蠶素生物活性奠定理論基礎。遇到的蛋白降解問題也暗示我們可在此基礎上更進一步從溫度、轉速等方面優(yōu)化表達條件以期獲得更佳的高效表達條件。

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Prokaryotic Expression and Protein Purification of Cecropin CecB2 Gene ofCulexquinquefasciatus

WANG Ji-ping，ZHANG Di，ZHANG Chun-lin，ZHAO Wen-jing，ZHANG Jing，ZHAI Su-zhen

(DepartmentofBiology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou,550025,China)

To construct the prokaryotic expression vector of cecropin CecB2 gene ofCulexquinquefasciatusfor prokaryotic expression recombinant protein.The mature peptide of CecB2 was inserted into the multiple cloning sites of the expression vector pET32a to construct recombinant plasmid firstly,then transformed it intoE.coliRosetta for expression by IPTG induction.The expression conditions were optimized by investigating the effects of concentration of IPTG and induction time.SDS-PAGE and Western blot were used to detect and indentify the recombinant protein respectively.The results showed that prokaryotic expression vector pET32a-CecB2 was constructed successfully and optimum induction condition of fusion protein were as follows:IPTG concentration 0.05 mmol/L,induction time 3 h.The recombinant protein was about 25 ku and identified to react with monoclonal antibody 6×His tag by Western blot.This suggested that the recombinant plasmid was constructed successfully and can be expressed as a soluble fusion protein inE.coliRosetta.It laid the necessary theoretical basic for further study of biological funtions of cecropin ofCulexquinquefasciatusin future.

Culexquinquefasciatus; cecropin gene; prokaryotic expression; protein purification

2016-04-07

貴州省科技廳項目(黔科合LH字[2015]7363號)

王吉平(1989-)，女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事醫(yī)學昆蟲分子生物學研究。*通訊作者

S859.799.9；S881.3

A

1007-5038(2016)11-0031-05