漆倩涯，贠建民*，黃玉琴，白 杰，張紊瑋，艾對元

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

超聲破碎輔助蝸牛酶提取杏鮑菇蛋白工藝優(yōu)化

漆倩涯，贠建民*，黃玉琴，白 杰，張紊瑋，艾對元

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

為顯著提高杏鮑菇子實(shí)體蛋白提取率，采用超聲波破碎輔助蝸牛酶水解充分破碎菌體細(xì)胞壁。綜合應(yīng)用響應(yīng)面、正交設(shè)計(jì)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相結(jié)合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，分別對超聲破碎處理和蝸牛酶水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)與直接熱水堿提蛋白法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，超聲處理?xiàng)l件為超聲功率300 W、超聲時(shí)間26 min、水料比1.95∶5（mL/g），在此條件下破碎效果最好，提取率達(dá)到了48.82%；最佳蝸牛酶水解條件為溫度42.8 ℃、pH 4.8、酶用量7%、時(shí)間1.5 h，在該條件下蛋白提取率為75.92%，相較熱水堿提法提高了33.35%，結(jié)果表明利用超聲輔助蝸牛酶水解杏鮑菇細(xì)胞壁能顯著提高蛋白提取率。

杏鮑菇；蛋白；超聲破碎法；蝸牛酶；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），屬真菌門，傘菌目，側(cè)耳屬，又名刺芹側(cè)耳[1]。杏鮑菇含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是一種食用價(jià)值很高的食用菌[2]，其菌體蛋白質(zhì)含量高達(dá)25.4%，并且富含人體8 種需須氨基酸，精氨酸和谷氨酸的含量甚至與α-酪蛋白、卵蛋白和大豆球蛋白中的含量相近，其中支鏈氨基酸的含量明顯高于芳香族氨基酸的含量[3-4]，已經(jīng)成為了優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的良好原材料和功能肽的制備來源。近年來，以植物性蛋白為原料制備的功能性肽成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，如何提高蛋白提取率已成為該工藝技術(shù)的關(guān)鍵[5-7]。在杏鮑菇研究方面，國內(nèi)外多

集中在杏鮑菇多糖提取及功能方面的研究，但是其蛋白質(zhì)的提取及相關(guān)功能肽的制備研究報(bào)道較少。

張夢甜等[8]利用纖維素酶破壁提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，并進(jìn)行了營養(yǎng)評價(jià)，證明所得蛋白品質(zhì)較高。馬澤青等[9]利用響應(yīng)面法超聲輔助水提取雙孢菇蛋白質(zhì)，經(jīng)過優(yōu)化處理蛋白提取率達(dá)到50.39%。杏鮑菇因其子實(shí)體細(xì)胞壁富含幾丁質(zhì)（殼聚糖）、纖維素等多糖，所以細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，胞內(nèi)蛋白溶出速率受到了很大限制，只有破碎菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，蛋白釋放水平才能得到顯著的提升。由于細(xì)胞膜彈性強(qiáng)度較差，滲透壓的改變易迫使其破碎[10]，所以菌體細(xì)胞壁的破碎程度成為了蛋白提取水平的主要制約因素。蝸牛酶是一種混合酶，源自于蝸牛的嗉囊和消化道，能降解幾丁質(zhì)內(nèi)切酶分解的幾丁質(zhì)產(chǎn)物成單糖，消化腺中發(fā)現(xiàn)有纖維素酶、半纖維素酶等，是一種具有很高生物價(jià)值的酶[11-12]。陸晨等[13]利用響應(yīng)面優(yōu)化超聲參數(shù)提取茶渣蛋白，經(jīng)過超聲輔助提取蛋白程度高于熱水堿提37.2%。張濤等[14]利用蝸牛酶降解殼聚糖，在pH 4、溫度40 ℃條件下寡糖收率為64.74%，充分說明蝸牛酶能較好地降解殼聚糖。超聲波細(xì)胞破碎的原理主要將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，聲能通過液體介質(zhì)而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，氣泡炸裂從而起到破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用，是一種物理方法的破碎效果。酶解法破壞細(xì)胞壁的特殊化學(xué)鍵，達(dá)到破壁效果，其具有高度專一性，條件溫和，一般不會破壞原料物化性質(zhì)。

本研究擬采用超聲波輔助破碎杏鮑菇子實(shí)體漿液，并應(yīng)用響應(yīng)面法對超聲破碎條件進(jìn)行優(yōu)化，隨后進(jìn)一步用蝸牛酶水解細(xì)胞壁，建立誤差反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，采用正交設(shè)計(jì)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相結(jié)合的方法優(yōu)化其酶解條件，最后通過堿提酸沉法提取蛋白，并與單純熱水堿提法進(jìn)行比較。由于每一種破壁方法都不能達(dá)到100%破壁效果，為了使細(xì)胞破壁效果達(dá)到最佳，故而本實(shí)驗(yàn)先采用機(jī)械破碎，后使用化學(xué)酶解方法。旨在為指導(dǎo)杏鮑菇提取蛋白工藝提供一定的依據(jù)和參考，并為杏鮑菇高值產(chǎn)品加工多樣化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棍棒狀菌株型杏鮑菇（Pleurotus eryngii）子實(shí)體市售；考馬斯亮藍(lán)R-250、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇溶液等（均為分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；蝸牛酶（每克細(xì)胞經(jīng)30～40 mg酶在37 ℃保溫1 h即可溶解細(xì)胞壁，破壁率90%以上） 上海源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海汗諾儀器有限公司；FA1204B型電子天平、pHS-3C型酸度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LGJ-0.2型真空凍干實(shí)驗(yàn)機(jī)蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杏鮑菇蛋白等電點(diǎn)的測定

將新鮮的杏鮑菇子實(shí)體打漿后，用1.0 mol/L NaOH溶液將漿液調(diào)節(jié)至pH 10浸提1 h后離心，取上清液用pH計(jì)調(diào)pH 2～5，用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中未沉淀的蛋白量確定等電點(diǎn)pI的大致范圍[15]。用上述同樣方法將上清液調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)范圍，用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中未沉淀的蛋白量確定等電點(diǎn)pI。

1.3.2 蛋白含量測定

杏鮑菇菌體中蛋白含量的測定采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

處理液中蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法G-250法[16]測定。以1 mL雙蒸水作為空白對照，標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式為y=6.628 6x+0.301 9，R2=0.991 7。

1.3.3 蛋白提取工藝流程

將杏鮑菇在打漿機(jī)中打漿，放入超聲破碎機(jī)中破碎。經(jīng)過超聲波破碎后，用蝸牛酶進(jìn)一步水解細(xì)胞壁，然后用0.1 mol/L NaOH溶液將漿液pH值調(diào)到10.0，浸提1 h，以6 000 r/min速率離心15 min，取上清液用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值到等電點(diǎn)，靜止1 h，沉淀析出后以6 000 r/min速率離心10 min，得到蛋白沉淀進(jìn)行冷凍干燥，制得的杏鮑菇蛋白粉以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.4 蛋白提取率的計(jì)算

1.3.5 超聲波破碎條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以蛋白提取率為測定指標(biāo)，確定超聲功率、超聲時(shí)間和水料比3 個(gè)因素對細(xì)胞破碎程度的影響。單因素試驗(yàn)基本條件為超聲功率300 W、超聲時(shí)間20 min、水料比3∶5（mL/g），在其他條件不變的情況下改變其中一個(gè)單因素，分析其因素對提取率的影響，試驗(yàn)因素和水平見表1。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇超聲功率、超聲時(shí)間和水料比3 個(gè)因素為變量，以蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表1 單因素試驗(yàn)因素和水平Table1 Factors and levels used in single factor experiments

表2 中心組合試驗(yàn)因素與水平Table2 Independent variables and their coded levels used in response surface analysis

1.3.6 蝸牛酶水解菌體細(xì)胞壁條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)過超聲破碎后的杏鮑菇漿液，用蝸牛酶進(jìn)一步溶解細(xì)胞壁，以蛋白提取率為指標(biāo)，確定蝸牛酶水解細(xì)胞壁之后的提取效果。單因素試驗(yàn)基本條件定為：酶用量5%、pH 5.0、溫度50 ℃、時(shí)間1.5 h。在其他條件不變的情況下改變其中一個(gè)單因素，分析該因素對杏鮑菇蛋白提取率的影響。各因素梯度為：酶用量：1%、3%、5%、7%、9%；pH值：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0；溫度：40、45、50、55、60 ℃；時(shí)間：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6.2 細(xì)胞壁破碎最佳工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)，以蛋白提取率為指標(biāo)，確定酶用量、pH值、時(shí)間和溫度4 個(gè)因素對細(xì)胞破碎程度的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，篩選蝸牛酶破碎細(xì)胞壁最佳條件，因素與水平設(shè)計(jì)見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平Table3 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.6.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

利用Matlab 7.0軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱，擬建立含有三層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的BP網(wǎng)絡(luò)模型，三層網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)分別由輸入層、隱含層和輸出層構(gòu)成。在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)，從正交表中隨機(jī)選取7 組因素水平組合作為輸入樣本，蛋白提取率結(jié)果作為輸出樣本，使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)專用函數(shù)net=newff建立網(wǎng)絡(luò)模型[17-20]。使用正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對BP網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練。在學(xué)習(xí)和訓(xùn)練過程中，通過調(diào)節(jié)連接權(quán)值和閾值使網(wǎng)絡(luò)達(dá)到預(yù)期的誤差范圍內(nèi)，并用另外隨機(jī)兩組數(shù)據(jù)來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆夯芰?。運(yùn)用建立好的網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真，得出蝸牛酶更精確的酶解最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 等電點(diǎn)的確定

利用考馬斯亮藍(lán)法先確定了杏鮑菇蛋白的等電點(diǎn)pI值的大致范圍在3～4左右，隨后進(jìn)一步更加精確測得等電點(diǎn)pI值為3.6。

2.2 超聲破碎條件對蛋白提取率的影響

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 超聲破碎條件超聲功率（a）、超聲時(shí)間（b）、水料比（c）對蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic cell disruption conditions on the extraction yield of protein

由圖1a可以看出，蛋白提取率隨著超聲功率的不斷增大而顯著升高，這是因?yàn)楣β首兇?，空化作用的效果增?qiáng)，超聲波對細(xì)胞壁的破碎作用也隨之增強(qiáng)[21]，蛋白釋放率逐漸增大。但隨著功率達(dá)到300 W后，蛋白溶出速率未見顯著提升，所以在做條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)宜選用200、300、400 W。由圖1b可以看出，蛋白提取率隨著超聲時(shí)

間的延長而緩慢升高，在25～30 min之間破碎效果達(dá)到最佳，說明增加破碎時(shí)間有助于細(xì)胞壁的破碎，原因是超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)大大加強(qiáng)了細(xì)胞破碎程度，顯著增大了蛋白溶出速率。經(jīng)過30 min之后，蛋白提取率反而下降，應(yīng)該是破碎時(shí)間過長，菌體細(xì)胞內(nèi)降解酶溢出，并隨著時(shí)間的延長，機(jī)器產(chǎn)生大量熱能使蛋白質(zhì)降解和變性[22]。因此選用超聲時(shí)間為20、25、30 min。圖1c中，隨著加水量的增大，在水料比為2∶5時(shí)出現(xiàn)一個(gè)波峰。這是由于杏鮑菇漿液質(zhì)量濃度過高時(shí)超聲波難以形成空化作用，機(jī)械效應(yīng)大多被轉(zhuǎn)換為了單純的熱量[23]，不利于蛋白質(zhì)的溶出。如若加水過多，導(dǎo)致漿液本身總蛋白含量下降，造成資料浪費(fèi)，超聲破碎利用不充分，考慮到成本和提取效率，優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)宜選用水料比1∶5、2∶5、3∶5。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)[24-25]

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table4 Program and experimental results of RSA

三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4所示，其中試驗(yàn)號由Design-Expert 8.0.6軟件隨機(jī)產(chǎn)生。對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到蛋白提取率（Y）對A、B、C的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=50.92-0.24A+3.94B-1.37C+2.88AB-1.95AC+2.21BC-4.1A2-5.32B2-6.14C2。

從表5可分析出，回歸模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.000 1，表明模型預(yù)測性良好。失擬項(xiàng)P＞0.05，說明回歸擬合充分，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示出較高的顯著性，即93%以上可由工藝條件來解釋，不可解釋部分不足7%。預(yù)測決定系數(shù)、變異系數(shù)、信噪比均在合理范圍內(nèi)，表明該模型預(yù)測性很好，說明該方程的擬合度良好，可以對超聲破碎法提取蛋白進(jìn)行分析和預(yù)測。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)中除了A項(xiàng)對蛋白提取率的影響不顯著，其他因素均有顯著影響，交互項(xiàng)中AB對蛋白提取率有極顯著作用，其他影響顯著。所選取的因素水平范圍內(nèi)，三因素對蛋白提取率影響的顯著性依次為：B＞C＞A。

表5 響應(yīng)面二次回歸方程方程模型方差分析結(jié)果Table5 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic model

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖2 各工藝參數(shù)交互作用對超聲破碎影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the effects of process parameters on the efficiency of cell disruption using ultrasonic treatment

由圖2a、b可知，在一定范圍內(nèi)，隨著功率的增加，杏鮑菇蛋白提取率有一個(gè)逐漸增加的階段，且增幅也同時(shí)逐漸增加，當(dāng)功率達(dá)到一定值（約310 W）時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值。由圖2a、c可知，超聲時(shí)間對蛋白提取率的影響顯著，隨時(shí)間的延長，蛋白提取率有一個(gè)迅速增加的階段，當(dāng)超聲時(shí)間超過一定值（約26 min）時(shí)，時(shí)間的繼續(xù)延長會導(dǎo)致提取率的降低。由圖2b、c可見，隨著加水量的增加，蛋白提取率呈開口向下的拋物線形式，水料比達(dá)到一定值（約1.95∶5）時(shí)，蛋白提取效果最好。

2.2.4 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證

經(jīng)回歸方程計(jì)算得到超聲破碎細(xì)胞壁提取蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲功率312.26 W、超聲時(shí)間26.95 min、水料比1.95∶5（mL/g），在此條件下，模型預(yù)測的提取率理論值為51.716 2%?？紤]到現(xiàn)實(shí)操作情況，在實(shí)驗(yàn)過程中將制備參數(shù)修正為超聲功率300 W、超聲時(shí)間26 min、水料比1.95∶5（mL/g），在該條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到杏鮑菇的蛋白提取率為48.82%，與模型預(yù)測值之間的差值僅占預(yù)測值的5.6%，證明模型擬合程度良好，模型的選擇合適。

2.3 蝸牛酶水解細(xì)胞壁對蛋白提取率的影響

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖3 蝸牛酶水解因素對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of snailase hydrolysis conditions on the extraction yield of protein

由圖3a可以看出，pH值的變化對酶活性有非常顯著的影響。張濤等[10]研究指出蝸牛酶活性最適pH值在4.5左右，當(dāng)pH值到達(dá)5時(shí)破壁效果最好，與其研究結(jié)果大致相仿。當(dāng)pH值繼續(xù)升高，酶活性迅速下降，所以選取pH值范圍4.5～5.5作為正交試驗(yàn)水平。圖3b顯示，溫度對蛋白提取率的影響是先上升后下降，隨著溫度的升高蝸牛酶活性迅速增大，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，蝸牛酶活性達(dá)到最大值，蛋白溶出速率也達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，酶活性遭到破壞，破壁率顯著下降，蛋白提取率也隨之降低。蝸牛酶的反應(yīng)溫度相對溫和，溫度的升高加速了酶促反應(yīng)速率，同時(shí)也不斷使酶蛋白變性，喪失酶活性。最適溫度是兩種對抗性的綜合效果，所以選取溫度范圍35～45 ℃作為正交試驗(yàn)水平。由圖3c可以看出，蛋白提取率隨著酶用量的增加而呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)酶用量達(dá)到5%時(shí)，蛋白提取效果最好。隨著酶用量的繼續(xù)增加，蛋白溶出速率幾乎不變，說明酶反應(yīng)質(zhì)量濃度已達(dá)到飽和狀態(tài)，再增大酶的用量會造成資源浪費(fèi)和成本的增大，因此做正交試驗(yàn)時(shí)選用酶用量為3%、5%和7%。如圖4d所示，剛開始蛋白溶出速率會隨酶解時(shí)間的延長迅速升高，當(dāng)酶解反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后，酶解效果逐漸減緩，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)，蛋白提取效果達(dá)到最佳水平，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.5 h后反而出現(xiàn)蛋白提取率下降的結(jié)果，可能是蛋白質(zhì)發(fā)生變性。所以宜選用酶解時(shí)間1.0、1.5、2.0 h作為正交試驗(yàn)水平。

2.3.2 正交試驗(yàn)分析和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了四因素三水平L9（34）篩選蝸牛酶破碎細(xì)胞壁最佳條件，其試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表6、7。根據(jù)表6隨機(jī)劃分7組數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集和2組數(shù)據(jù)為測試集，利用訓(xùn)練集檢驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)泛化能力。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table6 Orthogonal array design with experimental results for enzymatic hydrolysis

表7 方差分析Table7 Analysis of variance for enzymatic hydrolysis

因?yàn)槊附鈺r(shí)間對試驗(yàn)的影響最不顯著，所以在分析的過程中可以將其設(shè)置為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。校正模型用來判斷模型中系數(shù)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由表7可以看出，模型P＜0.05，則所用的模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。酶解的溫度P＜0.01，說明對蛋白提取率的影響極顯著，而pH值和酶用量的P值都小于0.05，說明對蛋白提取率均有較大影響。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)組合即溫度40 ℃、pH 5.0、酶用量7%、時(shí)間1.5 h，在此條件下的蛋白提取率為72.82%，但不一定反映了全局最佳提取條件，有可能在溫度40 ℃和pH 5.0左右會有更好的提取條件，因此，利用了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的仿真模擬去尋找更精確的酶解條件。

圖4 7 組訓(xùn)練集的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)誤差曲線Fig.4 Error curve of BP neural network for seven groups of training set

由圖4可以看出，利用7組訓(xùn)練數(shù)據(jù)[26]，確定輸入層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為3，輸出層神經(jīng)元數(shù)目為1，學(xué)習(xí)率net.trainParam.lr取0.01，動(dòng)量因子net.trainParam.mc取0.02，迭代次數(shù)net.trainParam.epochs取50，誤差目標(biāo)net. trainParam.goal取0.001，隱含層神經(jīng)元數(shù)確定為3～12，主要是改變神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中隱含層神經(jīng)元數(shù)目來確定誤差最小，當(dāng)確定神經(jīng)元數(shù)目為9時(shí)擬合效果較好，迭代次數(shù)達(dá)到29時(shí)，訓(xùn)練達(dá)到了誤差范圍之內(nèi)。

2.3.3 BP網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)仿真數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)

確定酶用量和酶解時(shí)間分別為7%和1.5 h，將pH值固定為5.0，運(yùn)用建立好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在酶解溫度40℃附近進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真，結(jié)果見圖5a。圖5a中，42.8 ℃為最佳溫度；仍舊在確定的酶用量和時(shí)間條件下，固定酶解溫度為42.8℃，應(yīng)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在pH 5.0附近進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真，結(jié)果見圖5b。從圖5b得出，pH 4.8時(shí)蛋白的釋放效果最好。至此，得出最佳酶解條件為：酶用量7%、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度42.8 ℃、pH 4.8。通過模型仿真得出蛋白提取率為76.43%，最佳酶解條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提取率為75.92%。

圖5 因素對提取效果影響的仿真結(jié)果Fig.5 Simulation results of the effects of hydrolysis temperature (a) and pH (b) on the extraction efficiency

2.4 超聲破碎輔助酶解提取蛋白效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了直觀驗(yàn)證超聲輔助蝸牛酶提取杏鮑菇子實(shí)體蛋白的效果，采用熱水浴堿提法提取杏鮑菇蛋白，隨之進(jìn)行提取結(jié)果的比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，結(jié)果見表8，取平均值得到提取率僅為42.57%。經(jīng)過超聲輔助蝸牛酶處理的杏鮑菇漿液，其蛋白提取率高達(dá)75.92%，相較提高了33.35%。同時(shí)，超聲破碎輔助酶解提取時(shí)間縮短了約30 min，堿液濃度也有所下降，節(jié)省了堿的用量，說明超聲輔助蝸牛酶水解是一種行之有效的提取方法。

表8 超聲輔助酶解提取與熱水浴堿提比較Table8 Comparison of ultrasound-assisted enzymatic extraction and hot alkali extraction

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)面法得出了最佳提取條件為超聲功率300 W、超聲時(shí)間26 min、水料比1.95∶5（mL/g）。使用蝸牛酶水解細(xì)胞壁，經(jīng)過正交試驗(yàn)得出最佳酶解條件為溫度40 ℃、pH 5.0、酶用量7%、時(shí)間1.5 h，此條件下杏鮑菇子實(shí)體蛋白提取率達(dá)到了72.82%；運(yùn)用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上仿真計(jì)算出更精確的酶解條件為溫度42.8 ℃、pH 4.8、酶用量7%、時(shí)間1.5 h，其提取率為76.43%，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到真實(shí)提取率為75.92%，相比正交試驗(yàn)結(jié)果提高了4%。尋找到了因素水平內(nèi)的全局最佳組合，為杏鮑菇蛋白提取找到了理想的酶解條件。經(jīng)與直接堿提法工藝比較，超聲波輔助蝸牛酶水解工藝，其提取率明顯高于直接堿提法，且省時(shí)、省料，證明該方法合理、可行，對相關(guān)企業(yè)開展杏鮑菇子實(shí)體蛋白提取生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

[1] 刁治民, 楊秀玲, 韓彥艷, 等. 蕈菌工程學(xué)[M]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社, 2011.

[2] 王鳳芳. 杏鮑菇中營養(yǎng)成分的分析測定[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(4): 132-135. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2002.04.035.

[3] 宋愛榮, 岳運(yùn)勇, 徐坤, 等. 4 個(gè)杏鮑菇品種的氨基酸分析與比較[J]. 菌物研究, 2005, 3(4): 11-14. DOI:10.3969/ j.issn.1672-3538.2005.04.003.

[4] 李昊劍, 楊良嶸, 魏雪團(tuán), 等. 功能性短肽的分類及其酶解制備方法[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(17): 373-377. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2012.17.054.

[5] 勵(lì)建榮, 封平. 功能肽的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(11): 415-419. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.11.110.

[6] 王成, 馮婷, 薛曉珍, 等. 新疆阿魏菇與杏鮑菇中氨基酸含量的分析研究[J]. 氨基酸和生物資源, 2013, 35(2): 56-58. DOI:10.14188/ j.ajsh.2013.02.011.

[7] KO S C, KANG M C, LEE J K, et al. Effect of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide purified from enzymatic hydrolysates of Styela plicata[J]. European Food Research and Technology, 2011, 233(6): 915-922. DOI:10.1007/s00217-011-1585-7.

[8] 張夢甜, 楊文建, 裴斐, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備杏鮑菇蛋白及其營養(yǎng)評價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(13): 125-130. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201513024.

[9] 馬澤青, 張寶善, 趙舒欣, 等. 響應(yīng)面法超聲波輔助提取雙孢蘑菇蛋白工藝優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(23): 229-233. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.23.044.

[10] 陳建軍. 基于MEMS技術(shù)的細(xì)胞破碎微流控芯片系統(tǒng)研究[D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2010.

[11] HJORTKJAER J. Rhodium complex catalyzed hydroformylation. The relation between effects of CO pressure and phosphine concentration[J]. Journal of Molecular Catalysis, 1979, 5(5): 377-384. DOI:10.1016/0304-5102(79)80013-9.

[12] GESTEIRA T F, COULSOM-THOMAS V J, OGATA F T, et al. A novel approach for the characterisation of proteoglycans and biosynthetic enzymes in a snail model[J]. Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2011, 1814(12): 1862-1869. DOI:10.1007/s10719-011-9334-5.

[13] 陸晨, 鄒雨虹, 張士康, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取茶渣蛋白質(zhì)的工藝條件[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 31(3): 319-325.

[14] 張濤, 吳昌英, 張永模, 等. 蝸牛酶降解殼聚糖制備殼寡糖的研究[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2010, 25(3): 313-315. DOI:10.13375/j.cnki. wcjps.2010.03.053.

[15] 席甜, 馮翠萍, 程菲兒, 等. 杏鮑菇多肽的制備[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 35(1): 102-107. DOI:10.13842/j.cnki. issn1671-8151.2015.01.019.

[16] BRADFORD M. A rapid and sensitive method for the quantitation of protein using the principle of ptotein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3.

[17] 桂現(xiàn)才. BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在MATLAB上的實(shí)現(xiàn)與應(yīng)用[J]. 湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2004, 25(3): 79-83. DOI:10.3969/j.issn.1006-4702.2004.03.021.

[18] 閔惜琳, 劉國華. 用MATLAB神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱開發(fā)BP網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用[J].計(jì)算機(jī)應(yīng)用, 2001, 21(8): 163-164.

[19] 宋勇強(qiáng), 贠建民, 安志剛, 等. 基于正交設(shè)計(jì)與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的醋酸菌A3菌株醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(5): 142-146. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.05.059.

[20] CHEN C R, RAMASWAMY H S, PRASHER S O. Dynamic modeling of retort processing using neural networks[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2002, 26(2): 91-112. DOI:10.1111/ j.1745-4549.2002.tb00855.x.

[21] 陶然, 何東平, 胡傳榮, 等. 超聲波輔助提取芝麻蛋白的工藝研究[J].中國油脂, 2014, 39(5): 23-26.

[22] 許鳳, 王長遠(yuǎn). 響應(yīng)面法優(yōu)化物理輔助堿法提取米糠蛋白工藝[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(20): 11-16. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201420003.

[23] 郭宇星. 瑞士乳桿菌蛋白酶的分離純化及其水解乳蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽研究[D]. 南京: 南京師范大學(xué), 2009.

[24] LIU C L, LIN T H, JUANG R S. Optimization of recombinant hexaoligochitin—producing chitinaseproduction with response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 62(10): 518-522.

[25] GHORBEL B O, HAJJI S, YUNES I, et al. Optimization of chitin extraction from shrimp waste with Bacillus pumilus A1 using response surface metho dology[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 61(2): 243-250. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2013.07.001.

[26] 張晶. 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)中的應(yīng)用研究[D].西寧: 青海師范大學(xué), 2014.

Optimization of Ultrasonic-Assisted Snailase Hydrolysis for Extraction of Protein from Pleurotus eryngii

QI Qianya, YUN Jianmin*, HUANG Yuqin, BAI Jie, ZHANG Wenwei, AI Duiyuan
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The aim of this work was to enhance the efficiency of protein extraction from fruit bodies of Pleurotus eryngii by cell disruption using ultrasonic irradiation followed by snailase hydrolysis. Response surface methodology, orthogonal array design and artificial neural network model were used in combination to optimize the conditions for ultrasonic irradiation and subsequent enzymatic hydrolysis, respectively. The protein extraction efficiencies of the presented method and the hot alkali method were compared. The best efficiency of cell disruption was achieved upon ultrasonic treatment for 26 min at 300 W power with a solid-to-water ratio of 1.95:5 (mL/g), which resulted in a protein yield of 48.82%. The optimum hydrolysis conditions that provided maximum protein yield of 75.92% were determined as 42.8 ℃, 4.8, 7% and 1.5 h for temperature, pH, enzyme dosage and hydrolysis time, respectively, which was increased by 33.35% compared with hot alkali extraction. These results showed that ultrasonic-assisted snailase hydrolysis could significantly increase the efficiency of protein extraction from P. eryngii fruit bodies.

Pleurotus eryngii; protein; ultrasonic-assisted extraction; snailase; artificial neural network

10.7506/spkx1002-6630-201622012

TS255.2

A

1002-6630（2016）22-0085-07

漆倩涯, 贠建民, 黃玉琴, 等. 超聲破碎輔助蝸牛酶提取杏鮑菇蛋白工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 85-91. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622012. http://www.spkx.net.cn

QI Qianya, YUN Jianmin, HUANG Yuqin, et al. Optimization of ultrasonic-assisted snailase hydrolysis for extraction of protein from Pleurotus eryngii[J]. Food Science, 2016, 37(22): 85-91. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622012. http://www.spkx.net.cn

2014-04-13

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)（GNSW-2011-18）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)青年導(dǎo)師基金項(xiàng)目（GAU-QNDS-201205）

漆倩涯（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：18394662384@163.com

*通信作者：贠建民（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c發(fā)酵工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn