賈文志，趙金超，武海龍，李鵬，趙鳳鳴，姚志剛，孫曉立

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊 050011；2石家莊市第五醫(yī)院)

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凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對(duì)大鼠腦出血后腦水腫的治療作用

賈文志1，趙金超2，武海龍1，李鵬1，趙鳳鳴1，姚志剛1，孫曉立1

(1石家莊市第三醫(yī)院，石家莊 050011；2石家莊市第五醫(yī)院)

目的 觀察凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對(duì)大鼠腦出血后腦水腫的治療作用。方法 將90只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組各30只。模型組、干預(yù)組尾狀核注射自體動(dòng)脈血制備腦出血大鼠模型，對(duì)照組注射等量生理鹽水；對(duì)照組、模型組術(shù)后于大腦尾狀核部位注射10 μL生理鹽水，干預(yù)組注射10 μL凝血酶抑制劑nexin-1。各組大鼠在給藥后12、24、36 h分別進(jìn)行腦組織形態(tài)學(xué)觀察、腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞檢測、腦組織含水量檢查和腦組織血腦屏障通透性檢測。結(jié)果 干預(yù)組腦神經(jīng)細(xì)胞排列有輕微紊亂，形態(tài)結(jié)構(gòu)異常程度較輕，細(xì)胞核有胞核固縮和胞質(zhì)凝集的現(xiàn)象，但程度較模型組輕。與對(duì)照組相比，模型組各時(shí)間點(diǎn)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)多、腦組織含水量高、血腦屏障通透性高(P均<0.05)。與模型組相比，干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)少、腦組織含水量低、血腦屏障通透性低(P均<0.05)。結(jié)論 凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對(duì)大鼠腦出血后腦水腫具有治療作用。

凝血酶抑制劑；腦出血；腦水腫

腦出血后易發(fā)生多種并發(fā)癥，其中腦水腫是腦出血最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1,2]。凝血酶作為一種絲氨酸蛋白酶，在腦出血后的炎癥反應(yīng)、腦細(xì)胞毒性損傷、腦水腫等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3～6]。凝血酶抑制劑nexin-1是一種內(nèi)生的絲氨酸蛋白水解酶，能迅速抑制凝血酶的表達(dá)及活性。本研究觀察了nexin-1尾狀核注射對(duì)大鼠腦出血后腦水腫的治療作用，為臨床上治療腦出血后腦水腫提供依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠90只，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(黑)：2013-002。

1.2 主要試劑及儀器 凝血酶抑制劑nexin-1(Gibco公司)，水合氯醛(山東齊魯制藥廠)，伊文思藍(lán)(Bioworlde公司)。立體定位儀(Amersham Biosciences公司)，分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)。

1.3 大鼠腦出血模型制備及nexin-1用法 將90只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組各30只。模型組、干預(yù)組采用自體動(dòng)脈血注射的方法制備腦出血大鼠模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，后置于立體定位儀，在大鼠頭皮正中行切口，左側(cè)顱骨鉆孔(中線旁開3 mm，前囟前0.2 mm)，將動(dòng)脈血(50 μL尾動(dòng)脈自體血，不加抗凝劑)迅速注入顱骨下5.5 mm的左側(cè)尾狀核，然后換另一側(cè)，盡量減少反流，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。對(duì)照組尾狀核部位注射等量生理鹽水，其余手術(shù)步驟與上述一致。對(duì)照組、模型組術(shù)后于大腦尾狀核部位注射10 μL生理鹽水，干預(yù)組注射10 μL凝血酶抑制劑nexin-1。

1.3 觀察方法

1.3.1 腦組織形態(tài)學(xué)觀察 將各組大鼠在給藥后12、24、36 h腹腔注射3.5%的水合氯醛，麻醉后迅速斷頭取出腦組織，以進(jìn)針孔(尾狀核的所在位置)為界，冠狀切開腦組織，取其前半部腦出血周圍厚度為3 mm的腦組織標(biāo)本，用10%甲醛固定、脫水、包埋，用石蠟切片機(jī)對(duì)包埋后的腦組織標(biāo)本進(jìn)行切片，切片厚度為5 μm，對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和HE染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)各組大鼠的腦組織形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.3.2 大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞檢測 取各組大鼠腦組織石蠟切片，使用TUNEL染色法檢測大鼠腦組織中的凋亡神經(jīng)細(xì)胞。用倒置顯微鏡觀察，在400倍鏡視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并記錄陽性細(xì)胞數(shù)。以腦組織神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 大鼠腦組織含水量檢測 采用干濕重法對(duì)各組大鼠腦組織含水量進(jìn)行檢測。各組大鼠在腹腔麻醉處死后迅速取出大腦，并快速稱取大腦濕重，然后將大腦放在95 ℃的烘箱中烘烤24 h，快速稱取大腦干重。大鼠腦組織含水量=(大腦濕重-大腦干重)/大腦濕重×100%。

1.3.4 大鼠血腦屏障通透性檢測 各組大鼠在各處理時(shí)間點(diǎn)處死前1 h尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)(0.3 mL/100 g)，當(dāng)大鼠的眼球結(jié)膜和四肢出現(xiàn)藍(lán)色時(shí)表明伊文思藍(lán)注射成功，停止注射。取大鼠大腦雙側(cè)的紋狀體和皮層(在取之前將大鼠左心室灌注生理鹽水，直至大鼠的右耳有清亮色的液體流出)，用分析天平進(jìn)行精密稱重。將稱重后的紋狀體和皮層放在容量為5 mL的二甲基甲酰胺溶液試管中，37 ℃水浴48 h，3 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用分光光度法檢測上清液中伊文思藍(lán)在632 nm波長處的最大吸光度，根據(jù)伊文思藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紋狀體、皮層中伊文思藍(lán)的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織病理形態(tài) 對(duì)照組大鼠大腦皮層中的腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常并且排列順序整齊，腦皮層中的細(xì)胞著色均勻，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為淡紅色。模型組大鼠大腦皮層中的腦組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常變化，神經(jīng)細(xì)胞之間的間隙增大并且排列順序紊亂，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)顯著性變異，有部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(細(xì)胞核核質(zhì)濃縮，并且細(xì)胞核固縮、溶解，細(xì)胞質(zhì)凝集，細(xì)胞體積減小)，在12 h時(shí)最為嚴(yán)重，隨后異常程度減輕。干預(yù)組腦神經(jīng)細(xì)胞排列輕微紊亂，形態(tài)結(jié)構(gòu)異常程度較輕，細(xì)胞核仍然有胞核固縮和胞質(zhì)凝集的現(xiàn)象，但程度較模型組輕；隨著干預(yù)時(shí)間的延長，腦組織病理異常恢復(fù)的程度逐漸增加。

2.2 各組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見表1。

表1 給藥后不同時(shí)間各組大鼠腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)，±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較 結(jié)果見表2。

表2 給藥后不同時(shí)間各組大鼠腦組織含水量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性比較 各組大鼠腦組織皮層、紋狀體伊文思藍(lán)含量比較見表3。

表3 給藥后不同時(shí)間各組大鼠腦組織皮層、紋狀體伊文思藍(lán)含量比較±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

腦出血是臨床中的常見疾病，常采用甘露醇脫水治療[7]。腦出血在臨床中有較高的病死率和致殘率，在發(fā)病30 d內(nèi)的病死率高達(dá)50%，未死亡的腦出血患者在6個(gè)月內(nèi)僅有20%左右的患者能有功能意義上的恢復(fù)[8]。致使腦出血患者死亡和殘疾的主要危險(xiǎn)因素是腦出血后早期對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性以及晚期腦水腫，其中腦水腫是最重要的危險(xiǎn)因素[9]。凝血酶在正常人大腦中的量極少，但腦出血后產(chǎn)生的血腫塊可以誘發(fā)產(chǎn)生大量的凝血酶[10]。少劑量的凝血酶在機(jī)體發(fā)生出血時(shí)有非常重要的保護(hù)作用[11,12]，可以保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞和腦星形細(xì)胞，避免其因?yàn)槲h(huán)境的缺血、缺氧、低血糖而死亡；可以促進(jìn)腦膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌神經(jīng)生長因子，進(jìn)而促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞軸突生長；可以降低出血范圍的增加，減輕腦水腫。但同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)，大劑量的凝血酶在腦出血后腦損傷中起著非常重要的作用，特別是與腦出血后腦水腫的發(fā)生關(guān)系密切。大劑量的凝血酶會(huì)促進(jìn)腦出血后腦神經(jīng)細(xì)胞損傷、腦血腫、炎癥、腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]表明，腦出血后并發(fā)的腦水腫主要是由于大量的凝血酶產(chǎn)生的毒性作用所引起的?？梢?，凝血酶為腦出血后并發(fā)腦水腫的啟動(dòng)點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)腦出血后凝血酶的水平及活性成為治療腦出血的一個(gè)新方法。

凝血酶抑制劑nexin-1是一種內(nèi)生的凝血酶抑制劑，是44 kD的絲氨酸蛋白水解酶，屬于連接蛋白家族和絲氨酸超家族[15]。nexin-1能迅速抑制凝血酶，通過絲氨酸蛋白酶催化劑與凝血酶形成穩(wěn)定的SDS復(fù)合物[16]。nexin-1和凝血酶在神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷早期或損傷血腦屏障的其他情況下可以調(diào)節(jié)星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的生存能力。nexin-1主要分布在腦血管內(nèi)和腦血管周圍，當(dāng)腦內(nèi)血腦屏障的通透性增加時(shí)，nexin-1可以對(duì)抗凝血原，降低凝血酶的活性，進(jìn)而降低凝血酶對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性及腦水腫[17,18]。本研究中腦出血大鼠相較于正常大鼠，腦神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、間隙增加，并有部分腦神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而用nexin-1干預(yù)大鼠腦組織異常病理變化程度降低，且干預(yù)組腦組織凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較模型組少，可見nexin-1對(duì)腦出血后大鼠大腦組織具有保護(hù)作用。同時(shí)，nexin-1可以降低腦出血后腦組織的含水量和血腦屏障的通透性，說明nexin-1可以通過改善腦出血后血腦屏障損傷，降低血腦屏障的通透性，降低腦水腫，保護(hù)腦組織。

綜上可見，凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對(duì)大鼠腦出血后腦水腫具有治療作用。

[1] 聶志紅,王德發(fā),馬衛(wèi)琴,等.醒腦靜對(duì)自發(fā)性腦出血患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9及神經(jīng)功能的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(5):75-77.

[2] 周慶博,賈青,張媛,等.黃芩苷對(duì)腦出血大鼠腦組織凝血酶受體-1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(12):1302-1305.

[3] Wagner KR, Xi G, Hua Y, et al. Ultra-early clot aspiration after lysis with tissueplasminogen activator in a porcine model of intracerebral hemorrhage :edema reduction and blood brain barrier protection[J]. J Neurosurg, 1999,90(3):491-498.

[4] Rohatgi T, Henrich-Noack P, Sedehizade F, et al. Transient focal ischemia in rat brain differentially regulates mRNA expression of protease-activated receptors 1 to 4[J]. J Neurosci Res， 2004,75(2):273-279.

[5] Martini SR, Flaherty ML, Brown WM, et al. Risk factors for intracerebral hemorrhage differ according to hemorrhage location[J]. Neurology, 2012,79(23):2275-2282.

[6] Wu B, Ma Q, Khatibi N, et al. Ac-YVAD-CMK decreases blood-brain barrier degradation by inhibiting caspase-1 activation of interleukin-1β in intracerebral hemorrhage mouse model[J]. Transl Stroke Res, 2010,1(1):57-64.

[7] 李萍,趙建軍,趙樹明.活血化瘀法治療腦出血的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志,2012,14(10):1117-1118.

[8] Dowlatshahi D, Demchuk AM, Flaherty ML, et al. Defining hematoma expansion in intracerebral hemorrhage: relationship with patient outcomes[J]. Neurology, 2011,76(14):1238-1244.

[9] Xue M, Del-Bigio MR. Comparison of brain cell death andinflammatory reaction in three models of intracerebral hemorrhage inadult rats[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2003,12(3):152-159.

[10] Vajda Z, Pedersen M, Fuchtbauer EM, et al. Delayed onsetof brain edema and mislocalization ofaquaporin-4 indystrophin-null transgenic mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(20):13131-13136.

[11] Kasuya H, Shimizu T, Takakura K. Thrombin activity in CSF afterSAH is correlated with the degree of SAH, the persistence ofsubarachnoid clot and the development of vasospasm[J]. Acta Neurochir(Wien), 1998,140(6):579-584.

[12] Sinnreich M, Meins M, Niclou SP, et al. Prothrombin overexpressed in post-natal neurons requires blood factors foractivation in the mouse brain[J]. J Neurochem, 2004,88(6):1380-1388.

[13] Striggow F, Riek M, Breder J, et al. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampalneuroprotection against ischemia at low concentrations but causesdegeneration at high concentrations[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(5):2264-2269.

[14] Riek-Burchardt M, Striggow F, Henrich-Noack P, et al. Increase of prothrombin-mRNA after global cerebral ischemia inrats, with constant expression of protease nexin-1 and proteaseactivated receptors[J]. J Neurosci Lett, 2002,329(2):181-184.

[15] Wu H, Zhao R, Qi J, et al. The expression and the role of protease nexin-1 on brain edema after intracerebral hemorrhage[J]. J Neurol Sci, 2008,270(1-2):172-183.

[16] Reinhard E, Suidan HS, Pavlik A, et al. Glia-derived nexin/protease nexin-1 is expressed by a subset of neurons in the rat brain[J]. J Neurosci Res, 1994,37(2):256-270.

[17] Richard B, Arocas V, Guillin MC, et al. Protease nexin-1: a cellular serpin down-regulated bythrombin in rat aortic smooth muscle cells[J]. J Cell Physiol, 2004,201(1):138-145.

[18] Hoffman MC, Nitsch C, Scotti AL, et al. Theprolonged presence of glia-derived nexin an endogenous proteaseinhibitor in the hippocampus after ischemia-induced delayed neuronaldeath[J]. Neuroscience, 1992,49(2):397-408.

孫曉立(E-mail： 15030182566@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.015

R743.34

A

1002-266X(2016)35-0048-03

2015-09-25)