王宗成，彭延波，盤雪，宋高銀，劉燚琳，周勇，王希

（1.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199；2.湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陜西西安710075；4.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南株洲412000）

響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化苧麻葉黃酮提取工藝

王宗成1，2，彭延波1，盤雪1，宋高銀1，劉燚琳1，周勇3，王希4*

（1.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199；2.湖南科技學(xué)院湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陜西西安710075；4.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南株洲412000）

為優(yōu)化苧麻葉黃酮提取工藝，分別對(duì)料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素的基礎(chǔ)上，以提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行了經(jīng)典的Box-Benhnken三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。得到最佳工藝條件為料液比1∶43，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取溫度80℃，每次提取時(shí)間90 min，提取兩次。試驗(yàn)結(jié)論為提高苧麻葉黃酮利用率及其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論參考。

響應(yīng)面分析法；苧麻葉；黃酮提取

苧麻原產(chǎn)于我國，為蕁麻科苧麻屬多年生草本植物。苧麻是一種重要的纖維性經(jīng)濟(jì)作物，是我國重要的出口創(chuàng)匯經(jīng)濟(jì)作物，國際上稱“中國草”（賀波等，2010）。苧麻目前主要用于紡織工業(yè)原料，而苧麻葉作為工業(yè)廢棄品丟棄，資源浪費(fèi)嚴(yán)重并污染環(huán)境?，F(xiàn)代藥學(xué)研究結(jié)果表明，苧麻葉具有豐富的藥用和保健價(jià)值（肖呈祥，2014；熊維新等，2006）。苧麻葉中含有綠原酸、原兒茶酸等有機(jī)酸和野漆樹苷、蕓香苷等黃酮苷（施樹云，2004；趙立寧等，2003）。試驗(yàn)以永州野生風(fēng)干苧麻葉為原料，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化苧麻葉中黃酮的回流提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)苧麻葉資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器試驗(yàn)原材料為苧麻葉，2015年 7月下旬采摘于湖南科技學(xué)院旁西山，經(jīng)鑒定為野生苧麻品種，挑選新鮮干凈苧麻葉，采摘后，經(jīng)清洗，烘干，室溫保存于實(shí)驗(yàn)室備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)用石油醚、純度為95%的乙醇、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

T6可見分光光度計(jì)、TE124S電子天平、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、比色管、烘箱、燒杯、容量瓶、移液管、移液槍、膠頭滴管、玻璃棒、量筒、回流提取裝置等。

1.2黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0、1、2、3、4、5、6 mL的0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于7個(gè)25 mL容量瓶中，先用移液槍分別加入0.6 mL 5%的亞硝酸鈉，放置6 min，然后加0.6 mL 10%的硝酸鋁后放置6 min，最后加1.0 mol/L的NaOH 8.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置12 min得測(cè)定液，以空白溶液作參比，在λ= 510 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液濃度（C）與吸光度（A）的回歸方程A=kC+b（黃瓚，2012）。得回歸方程為：

式中，C代表蘆丁溶液的質(zhì)量濃度，A代表510 nm處的吸光度。曲線在0～0.06 mg/mL質(zhì)量濃度范圍有良好的線性關(guān)系。

1.3苧麻葉中黃酮化合物的提取及其計(jì)算按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出測(cè)定樣品溶液總黃酮濃度C。然后計(jì)算樣品中總黃酮的提取率。

式中：C為測(cè)定樣品溶液總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)，數(shù)值為100；V為最初樣品定容體積，mL，數(shù)值為50；m為樣品質(zhì)量，g，數(shù)值為5。

1.4單因素試驗(yàn)考察料液比、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間五個(gè)影響因素對(duì)苧麻葉提取率的影響。

1.5響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取3個(gè)對(duì)乙醇提取黃酮影響比較顯著的因素：料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度，在固定提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)2次的條件下采用經(jīng)典的三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)確定苧麻葉中黃酮提取的最佳工藝（王宗成，2015）。因素與水平見表1。

表1　苧麻葉黃酮提取工藝條件的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1料液比對(duì)提取率的影響取樣品5 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，恒溫80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究料液比對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。在其他條件不變的情況下，提取率隨料液比增大而增大，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)提取率接近最大值，之后逐步下降。所以最適料液比為1∶40。

圖1　料液比對(duì)提取率的影響

2.1.2提取次數(shù)對(duì)提取率的影響取樣品5 g，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，料液比1∶40，恒溫80℃，按每次90 min回流提取，研究提取次數(shù)對(duì)黃銅提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。提取次數(shù)為2次時(shí)，黃酮提取率接近最大值，提取3次較提取2次來說差別不大，考慮到生產(chǎn)成本，故應(yīng)以提取2次為宜。

圖2　提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響取樣品5 g，料液比1∶40，恒溫80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。在其他條件不變的情況下，提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而增大，但是超過70%時(shí)提取率逐漸下降，因此認(rèn)為70%乙醇為宜。

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

2.1.4提取溫度對(duì)提取率的影響取樣品5 g，70%的乙醇，1∶40的料液比，回流提取2次，每次提取90 min，考察溫度高低對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。在其他條件不變的情況下，提取溫度對(duì)提取率有一定影響，提取溫度應(yīng)以80℃為宜。

圖4　提取溫度對(duì)提取率的影響

2.1.5提取時(shí)間對(duì)提取率的影響取5 g樣品，70%的乙醇，料液比1∶40，恒溫80℃，分別在每次提取30、60、90、120 min的條件下回流提取2次，考察提取時(shí)間對(duì)苧麻葉總黃酮提取率的影響。圖5顯示提取時(shí)間對(duì)苧麻葉總黃酮提取率影響較大，隨時(shí)間延長提取率逐漸增大，提取時(shí)間達(dá)90 min以后提取率反而減少，可以看出對(duì)苧麻葉的最佳提取時(shí)間為90 min。

圖5　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化由響應(yīng)面圖6～8可以看出，響應(yīng)面圖各試驗(yàn)因素的最佳參數(shù)及各試驗(yàn)因素之間的相互作用。由苧麻葉黃酮提取率（Y）對(duì)料液比（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的響應(yīng)曲面圖可以直觀地看出交互作用對(duì)苧麻葉黃酮提取率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖6　料液比與乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的交互作用

圖7　提取溫度與乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的交互作用

圖8　料液比與提取溫度對(duì)黃酮提取率的交互作用

表2　苧麻葉總黃酮提取工藝條件的響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化及結(jié)果

2.2.2回歸模型的方差分析從表3可以看出，模型的F=116.22、P＜0.0001，說明本試驗(yàn)所采用的二次模型是很顯著的。PA、PB、PC、PAC、PBC、PA2、PB2、PC2均小于0.05，說明料液比、提取溫度、乙醇濃度、料液比和乙醇濃度的交互項(xiàng)、提取溫度與乙醇濃度的交互項(xiàng)以及3個(gè)因素的二次項(xiàng)都具有顯著影響；而其他交互項(xiàng)顯著性較差，也說明料液比與提取溫度的交互作用不大。決定因素R2= 0.9934，說明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化，擬合度好。各因素的效應(yīng)關(guān)系為：A（料液比）＞C（乙醇濃度）＞B（提取溫度）。

2.2.3提取條件的優(yōu)化用Design-expert 8.0.5.0軟件選擇逐步回歸方法對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程做進(jìn)一步優(yōu)化，最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70.47%、料液比1∶43.08、提取溫度80.41℃，預(yù)測(cè)提取率為37.69 mg/g。但考慮到實(shí)際操作的可行性與便利性，將其參數(shù)修正如下：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶43、提取溫度為80℃。

表3　苧麻葉黃酮提取工藝條件響應(yīng)曲面回歸方程的方差分析

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化乙醇回流提取苧麻葉黃酮的工藝，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案建立的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)苧麻葉黃酮的提取率。通過響應(yīng)曲面綜合分析得出了該試驗(yàn)的最優(yōu)方案為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶43，提取溫度為80℃。本試驗(yàn)所得到的工藝條件，可行性強(qiáng)，重復(fù)性好，為其工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)和苧麻葉資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

[1]賀波，李小定，彭定祥，等.苧麻葉中黃酮類化合物的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（10）：259～262.

[2]黃瓚，李振申，王宗成.楮樹葉總黃酮提取工藝優(yōu)化[J].湖南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（8）：30～34.

[3]施樹云.苧麻葉和紅豆杉中活性成分的提取、純化及測(cè)定研究[碩士學(xué)位論文][D].湖南長沙：中南大學(xué)，2004.

[4]王宗成，蔣玉仁，劉小文，等.響應(yīng)面優(yōu)化生姜莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（9）：1582～1588.

[5]肖呈祥.苧麻總黃酮的基因型差異及黃酮分離與檢測(cè)工藝優(yōu)化研究[碩士學(xué)位論文][D].湖南長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[6]熊維新，李開泉.苧麻的藥用開發(fā)價(jià)值[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：51～52.

[7]趙立寧，臧鞏固，李育君，等.苧麻（Boehmeria）綠原酸和黃酮含量測(cè)定[J].中國麻業(yè)，2003，25（2）：62～64.■

For the optimization of ramie leaves flavonoids extraction process，through the single factor experiment，the material liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction temperature，extraction time and times of extraction were analysed.Based on single-factor tests，Box-Benhnken three factors three levels experiment by response surface design was carried out.The results showed that optimum conditions for 1∶43 solid to liquid ratio，70%ethanol，temperature of 80℃，extraction time of 90 min，extraction two times.These results provided a theoretical reference for improving the utilization ratio of flavonoids from the ramie leaves and its industrial production.

response surface method；ramie leaf；flavonoids extraction

S816.7

A

1004-3314（2016）19-0012-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161903

湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助（2012-318）；湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目（15C0587）