崔丁心，陳 玲，陳 慧，阮 靜，謝秀禎

（海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158）

東寨港河口牡蠣中重金屬-抗生素抗性細(xì)菌分析

崔丁心，陳 玲，陳 慧，阮 靜，謝秀禎*

（海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158）

為檢測野生牡蠣肉中是否存在抗性細(xì)菌，從東寨港河口采集牡蠣樣品，利用含有Cu2+（a）、As2+（b）、Zn2+（c）、Cd2+（d）的單一重金屬離子或抗生素（諾氟沙星（N）、磺胺二甲嘧啶（B）、紅霉素（S）、桿菌肽鋅（E））的單抗選擇培養(yǎng)基以及它們交叉組合的雙抗選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，共分離到25株抗性細(xì)菌，其中革蘭氏陰性細(xì)菌占64%，有色菌占56%.在pH6.8的選擇培養(yǎng)基上分離到的6.8Cu2菌株可在12種雙抗培養(yǎng)基（dN、cN、aN、bN、dB、bB、aB、cS、bS、aS、cE、bE）上生長，是交叉抗性最多的菌株.本研究結(jié)果為制定水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范和水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù).

重金屬抗性；抗生素抗性；交叉抗性；牡蠣

長期以來，養(yǎng)豬業(yè)濫用抗生素已經(jīng)造成了環(huán)境的抗生素污染，并導(dǎo)致超級抗生素抗性微生物的出現(xiàn).這些抗生素抗性微生物通過食物鏈轉(zhuǎn)移將給人類帶來公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn).近十年來，宋林生[1]、朱永官[2]、張干以及周啟星[3]等研究團(tuán)隊(duì)分別針對海洋養(yǎng)殖、養(yǎng)豬場土壤、典型區(qū)域環(huán)境中抗生素抗性基因污染開展了相關(guān)研究.高盼盼等[4]對抗生素抗性基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的來源、污染現(xiàn)狀、潛在的傳播途徑和相關(guān)的檢測方法進(jìn)行了分析和介紹.鄒世春等人[5]也開展了珠三角一些主要水體（河流、養(yǎng)殖基塘、污水處理廠及海灣等）中抗生素及北江河水中磺胺抗性基因污染的研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選擇的3類共9種抗生素均可普遍檢出，且含量驚人.特別值得注意的是，2013年2月PNAS上發(fā)表一篇來自中美聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)研究中國3個(gè)年出欄一萬頭以上的大型規(guī)?；B(yǎng)豬場抗生素抗性基因.共檢測到149種抗生素抗性基因，其中，有63種基因的抗藥濃度比原始森林的土壤檢出量高出上百倍，甚至有的超過近3萬倍[6].

銅、鋅和有機(jī)砷制劑的超量添加，在飼料業(yè)較為普遍.與抗生素及其他有機(jī)污染物不同，重金屬污染具有隱蔽性、長期性和不可逆性，加上其可富集性和累積性，其潛在危害不容忽視.長期施用規(guī)模養(yǎng)殖場

豬糞的土壤及蔬菜中銅、鋅、砷含量均顯著高于對照組（p＜0.05)，對照組中則未檢出[7].大量研究表明，細(xì)菌的重金屬抗性及抗生素抗性之間存在抗性關(guān)聯(lián)，環(huán)境重金屬污染對抗生素抗性的維持和擴(kuò)散可能起非常重要的作用，人為重金屬的濫用會起到保持抗生素抗性基因庫的作用[8].對環(huán)境敏感的微生物可通過環(huán)境選擇馴化形成重金屬和抗生素協(xié)同抗性.例如，從在漁業(yè)養(yǎng)殖場中分離到的假單胞菌屬和氣單胞菌屬的細(xì)菌，對多種重金屬和抗生素具有抗性[9-10]，在廣東某大型養(yǎng)豬場也篩選出多個(gè)雙抗菌株[11]，這說明了對環(huán)境選擇最為敏感的微生物能夠通過自身的進(jìn)化（包括改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝和遺傳物質(zhì)等途徑）和發(fā)展形成抗生素和重金屬離子交叉抗性，從而能夠在交叉污染的環(huán)境中生長.當(dāng)這些攜帶抗重金屬和抗抗生素基因的雙抗細(xì)菌在環(huán)境中進(jìn)行傳播，對生態(tài)環(huán)境安全將造成威脅.質(zhì)粒常常帶有抗性基因，通過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒消除和質(zhì)粒測序方法已經(jīng)證明重金屬和抗生素抗性基因常常定位于質(zhì)粒上[12-14].如果抗性基因通過可移動元件質(zhì)粒整合到“超級細(xì)菌”中，將對人類的健康造成巨大威脅.最令人擔(dān)憂的是環(huán)境中很多同時(shí)抗多種重金屬和多耐藥性菌株是常見的致病菌，如醫(yī)院分離到的傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）[15]，洋蔥伯氏菌（Burkholderia cepacia）[16]等.因此，此類微生物的大量出現(xiàn)，很可能成為危害公眾健康的因素之一，需要引起人們的高度重視.

海南東寨港國家自然保護(hù)區(qū)是我國建立的第一個(gè)以保護(hù)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)為主的國家級自然保護(hù)區(qū)，其核心區(qū)正好位于演豐東河和演豐西河的入海口.上世紀(jì)80年代之后的二十余年來，羅牛山農(nóng)場及其周邊的大型養(yǎng)豬場污水通過演豐東河持續(xù)排放，對保護(hù)區(qū)的生態(tài)安全造成了嚴(yán)重影響.經(jīng)過近幾年的積極治理及對其周邊的養(yǎng)殖場進(jìn)行整頓，污染態(tài)勢已得到有效控制，但河口海洋生物受到抗生素和重金屬的長期污染后，其體內(nèi)是否已經(jīng)出現(xiàn)抗性細(xì)菌，這些抗性細(xì)菌的交叉抗性種類多少，至今尚未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)以東寨港河口牡蠣為研究對象，通過培養(yǎng)分離其體內(nèi)的抗性細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)管理提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用海水初步清洗外殼，裝入保鮮袋后放入有冰袋的泡沫箱中.采集的樣品當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.

1.2 培養(yǎng)基配制

1）試驗(yàn)培養(yǎng)基：NaCl 50g、MgCl25.9g、Na2SO43.2g、CaCl21.9g、蛋白胨5g、酵母膏1g、瓊脂20g、復(fù)合鹽A液20 mL、復(fù)合鹽B液1 mL、蒸餾水1000 mL.上述培養(yǎng)基分別按pH6.8、7.0、7.5進(jìn)行配制.

復(fù)合鹽A液：Na2CO30.8g、檸檬酸鐵0.5g、KCl 2.75g、蒸餾水100 mL.

復(fù)合鹽B液：SrCl23.4g、KBr 8.0g、H3BO32.2g、Na2SiO30.4g、（NH4）2SO40.16g、Na2HPO40.8g、蒸餾水100 mL.

2）單抗選擇培養(yǎng)基：將試驗(yàn)培養(yǎng)基滅菌后冷卻至60℃左右，然后分別向100 mL試驗(yàn)培養(yǎng)基中加入100μL的CuCl2、NaAsO2、ZnSO4·7H2O、CdSO4·8H2O貯存液，終濃度分別為0.5 mmol/L、2 mmol/L、1 mmol/ L、25 mg/L；或加入諾氟沙星、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、桿菌肽鋅貯存液，終濃度分別為267μg/mL、280μg/mL、50μg/mL、32μg/mL.

3）雙抗選擇培養(yǎng)基：將4種抗生素和4種重金屬兩兩組合共16種分別加入到冷卻至60℃左右的試驗(yàn)培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板，交叉組合種類見表1.

表1 重金屬和抗生素的交叉組合Tab.1 Cross combination of heavy metals and antibiotics

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備

將采集的牡蠣樣品用無菌水沖洗干凈后移至超凈工作臺，用棉球蘸取75%酒精溶液對其進(jìn)行表面消毒后打開牡蠣，用無菌剪刀取出牡蠣肉并剪碎，稱取10g置于裝有90 mL 3.4%NaCl的無菌溶液和玻璃珠的三角瓶中，于15℃、150 r/min振搖30 min.牡蠣肉懸液過濾得到10-1菌液樣品；用移液管吸取10-1

樣品1 mL至滅菌后加入了9 mL無菌水的10 mL試管中，溶液混勻，該樣品視為10-2；以此類推，梯度稀釋至10-5濃度稀釋樣品.

1.3.2 抗性菌篩選

取10-4、10-5稀釋度的菌懸液200μL分別涂布在單抗選擇培養(yǎng)基和雙抗選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)抗性平板做3個(gè)平行，28℃培養(yǎng)3-7d后觀察平板上是否長出相應(yīng)抗性菌株.對長出的菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色及鏡檢，繼續(xù)進(jìn)行交叉抗性實(shí)驗(yàn).

1.3.3 交叉抗性試驗(yàn)

將篩選到的抗性菌分別通過劃線接種到16種雙抗平板上，觀察抗性菌是否能夠在其它抗性平板生長，并記錄抗性結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性菌的菌落特征及革蘭氏染色

利用選擇培養(yǎng)基共篩選出25株抗性菌，以菌株生長的培養(yǎng)基的pH值加上篩選出該菌的抗性平板的種類為該抗性菌的名稱，菌落特征見表2.菌株革蘭氏染色鏡檢圖片見圖1.由圖1可知，25株抗性菌中有16株革蘭氏陰性菌、9株革蘭氏陽性菌，G-菌占64%；6.8Cu2為四聯(lián)球菌，革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陽性細(xì)菌.另外，有色菌株14株，占56%.有研究結(jié)果顯示，細(xì)菌的抗性強(qiáng)度與菌落顏色呈正相關(guān)，菌落呈現(xiàn)出的顏色越明顯相應(yīng)細(xì)菌的抗性強(qiáng)度就越強(qiáng)[14].

表2 抗性菌菌落特征Tab.2 Colonial morphology of resistant bacteria

2.2 交叉抗性情況

由表3可見，除7.5Zn沒有交叉抗性以外，其它菌株均有不同的重金屬和抗生素交叉抗性.6.8Cu2能在12種交叉抗性板上生長，是交叉抗性最多的菌；6.8Nor-Zn、7T-Cd、7.5Cu只能在一種交叉抗性平板上生長；6.8Zn、7Sul、7Nor-Cu、7.5Nor-Cd能在3種交叉抗性平板上生長；6.8Sul-Cd、6.8Nor-Cd、7Cu、7.5T-Cd、7.5Sul-Zn能在4種抗性平板上生長；

6.8Cu1能在5種抗性平板上生長；7T-As、7.5Sul-Cu能在6種抗性平板上生長；7ETM、7As-ETM、7.5Sul能在7種抗性平板上生長；7.5ETM-Zn能在8種抗性平板上生長；6.8Nor、7Nor-Zn、7.5ETM能在9種抗性平板上生長；7.5As能在11種抗性平板上生長.李彬輝[11]等人認(rèn)為在重金屬和抗生素復(fù)合污染環(huán)境中，對環(huán)境選擇最為敏感的微生物能夠通過自身的微進(jìn)化（包括改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝和遺傳物質(zhì)等途徑）形成抗生素和重金屬離子的交叉抗性.謝麗金[17]從羅牛山農(nóng)場周邊養(yǎng)豬廢水中也篩選到重金屬-抗生素雙抗菌，并發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的重金屬能在一定程度上激發(fā)細(xì)菌的其他交叉抗性，即由于重金屬的存在，菌種在具有抗生素抗性的基礎(chǔ)上又產(chǎn)生了多種交叉抗性，推測重金屬是交叉抗性產(chǎn)生原因的重要因素之一.本實(shí)驗(yàn)的樣品來自東寨港河口，它是演豐東河的入海口，其上游的羅牛山農(nóng)場及其周邊的大型養(yǎng)豬場持續(xù)20多年的廢水排放，使得該河口成為復(fù)合污染的一個(gè)典型環(huán)境，其污染物正是養(yǎng)豬飼料中添加的抗生素和Cu、As、Zn等重金屬.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出在抗生素和重金屬微污染環(huán)境中，微生物已經(jīng)通過自身的微進(jìn)化產(chǎn)生了對抗生素和重金屬的交叉抗性.

圖1 抗性菌鏡檢圖片(×100)Fig.1 Photomicrograph of the resistant bacteria(×100)

表3 菌株的交叉抗性結(jié)果Tab.3 Cross-resistance of the bacteria

3 結(jié)論

從東寨港河口牡蠣肉中共分離到25株抗性菌，包含重金屬抗性菌7株、抗生素抗性菌5株和重金屬-抗生素抗性菌13株，G-菌占64%，除7.5Zn外，不同菌株表現(xiàn)出對不同重金屬和抗生素的交叉抗性.其中細(xì)菌6.8Cu2能在12種雙抗培養(yǎng)基上生長，該菌排列整齊，排列形態(tài)與四聯(lián)球菌相同，菌落呈黃色，是交叉抗性種類最多的菌.另外，有色菌株14株，占56%，本實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)對所有菌株的抗性強(qiáng)度進(jìn)行分析.

牡蠣只是東寨港河口生態(tài)的一部分，并不能準(zhǔn)確反映出東寨港河口水域中抗性基因的污染程度，但通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)充分意識到抗性基因可能帶來的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)及食品安全風(fēng)險(xiǎn).

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責(zé)任編輯：劉 紅

Analysis of Resistant Bacteria of Antibiotic and Heavy Metal in Oysters from Dongzhaigang Estuary

CUI Dingxin，CHEN Lin，CHEN Hui，RUAN Jing，XIE Xiuzhen*
（School of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

In order to detect whether resistant strains exist in the meat of wild oysters subsisted on Dongzhaigang estuary, we collect samples and cultivate the selective mediums containing heavy metals（Cu2+（a）、As2+（b）、Zn2+（c）、Cd2+（d））or antibiotics（Norfloxacin（N）,Sulfadimidine（S）,Erythromycin（E）,Bacitracin zinc（E））and their cross combinations.25 resistant strains are isolated,among which Gram-negative and colored bacteria account for 64%and 56%respectively,and strain 6.8Cu2 is the most resistant one,displaying 12 kinds of cross-resistance（dN、cN、aN、bN、dB、bB、aB、cS、bS、aS、cE、bE）.This result provides a scientific basis for working out good aquaculture practice and the risk assessment of aquatic products.

heavy metal resistance；antibiotic resistance；cross resistance；oysters

Q 93-3

A

1674-4942（2016）03-0263-05

2016-04-27

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（201411658039）

*通訊作者