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（1.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站　北京　100021；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院）

鯉魚浮腫病流行情況的初步研究

徐立蒲1王靜波1張文1潘勇1曹歡1王姝1王小亮1王澎1那立海1江育林2*

（1.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站北京100021；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院）

為了明確北京順義某錦鯉養(yǎng)殖場患病錦鯉的發(fā)病死亡原因，根據(jù)鯉魚浮腫病毒基因的保守序列設(shè)計引物進行套式PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳后可見548 bp片段和180 bp片段的DNA條帶，空白對照無擴增條帶；套式PCR的產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果和Genbank公布的鯉魚浮腫病毒H504株序列完全一致。結(jié)果顯示這是由鯉魚浮腫病毒引起的鯉魚浮腫病，并通過進一步分析，提示鯉魚浮腫病在北京地區(qū)已經(jīng)有所擴散，應(yīng)引起養(yǎng)殖者以及魚病工作者的關(guān)注。

鯉魚浮腫?。货庺~浮腫病毒；錦鯉皰疹病毒??；錦鯉；鯉

1　前言

錦鯉皰疹病毒?。↘oi herpes virus disease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，KHV）引起、危害鯉和錦鯉的常見和最重要的病毒病之一。KHV主要感染各規(guī)格鯉和錦鯉，臨床癥狀主要是爛鰓、眼凹陷、皮膚損害等[1]，感染后死亡率在90%以上。近年來，在北京養(yǎng)殖的鯉和錦鯉中出現(xiàn)了一種具有爛鰓、眼凹陷等類似KHVD臨床特征的疾病，用檢測KHV的PCR方法多次檢測，結(jié)果均為KHV陰性，引起猜測。2016年5月下旬，北京市順義區(qū)某錦鯉養(yǎng)殖場發(fā)病，病魚出現(xiàn)爛鰓、凹眼瞪，但KHV檢測結(jié)果依然為陰性。但用鯉魚浮腫病毒（Carp Edema Virus，CEV）進行PCR擴增，并且測序結(jié)果和Genbank公布的結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示發(fā)病錦鯉是由CEV感染引起。

鯉魚浮腫病（Koi sleepy disease，KSD）是在國際上流行的外來病，其病原是CEV，在我國尚未見報道。本研究結(jié)果提示CEV已經(jīng)進入我國，并對鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了威脅。現(xiàn)將研究報告如下，以為開展進一步的監(jiān)測、防控工作提供基礎(chǔ)資料。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1病料來源

北京市順義區(qū)某錦鯉養(yǎng)殖場的患病錦鯉。

2.1.2試劑

DNA抽提試劑盒：德國QIAGEN公司；引物合成及測序：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；PCR擴增試劑：北京百泰克公司。

2.1.3儀器

臺式冷凍離心機：德國艾本德公司，Centrifuge 5418R；梯度PCR儀：美國AB公司，ABI veriti；電泳儀：北京六一儀器公司，DYY-6C；凝膠成像系統(tǒng)：北京賽智公司，ChampGel-5000；顯微鏡：奧林帕斯，CX-41。

2.2方法

2.2.1鰓絲顯微鏡觀察

制作病魚鰓絲水浸片，在1000倍顯微鏡下觀察鰓絲。

2.2.2分子生物學(xué)檢測

取病魚鰓、腎、肝、腦、脾，混合后研磨勻漿，制成樣1、樣2，4℃過夜；用DNA抽提試劑盒抽提核酸，做套式PCR擴增，引物根據(jù)已知CEV基因的保守序列設(shè)計[2]；第一次PCR擴增的正向引物F1：5'-GCTGTTGCAACCATTTGAGA-3'，反向引物R1：5'-TGCAGGTTGCTCCTAATCCT-3'，擴增該基因中的548片段；第二次擴增的正向引物F2：5'-GCTGCTGCACTTTTAGGAGG-3'，反向引物R2：5'-TGCAAGTTATTTCGATGCCA-3'，再從中擴增180片段。反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃2 min，60℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將嵌套PCR后的產(chǎn)物純化后，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，測序結(jié)果通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析。

另外還使用擴增KHV的TK和SPH基因的引物對該樣品做PCR擴增[3]。

3　結(jié)果

3.1發(fā)病魚池情況

5月20日，該養(yǎng)殖場有2個魚池發(fā)??；到6月1日，魚死亡情況基本停止。1號池有魚2000 kg，死亡約1000 kg，10 d累計死亡率為50%；2號池有魚5000 kg，死亡約500 kg，10 d累計死亡率為10%。據(jù)調(diào)查，1號池在發(fā)病前水顏色異常，呈土色；2號魚池水色正常。該場在發(fā)病前2天對1、2號池均采用了投放芽孢桿菌、富藻素等產(chǎn)品，并將其他魚池水加注到這2個魚池，結(jié)果2日后2個魚池均出現(xiàn)發(fā)病死亡情況。發(fā)病后，該場還向池中潑灑氟苯尼考以及大黃，結(jié)果出現(xiàn)更多魚死亡。

3.2臨床癥狀

發(fā)病水溫23℃，患病錦鯉全長10-15 cm，體重約100 g，有爛鰓、凹眼癥狀（圖1），解剖可見各內(nèi)臟形態(tài)基本正常。其臨床癥狀類似KHV感染。

圖1　發(fā)病錦鯉

3.3鰓絲顯微鏡觀察

在1000倍顯微鏡下可見鰓絲上有大量桿狀細菌，類似柱狀黃桿菌（圖2）。

圖2　顯微鏡下可見細長桿菌（×1000）

3.4病毒的分子生物學(xué)特性

病魚的鰓、腎、肝、腦、脾組織抽提核酸后，根據(jù)CEV基因的保守序列設(shè)計引物進行套式PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳后可見548 bp片段和180 bp片段的DNA條帶，空白對照無擴增條帶（圖3）。套式PCR的產(chǎn)物進行測序，其測序結(jié)果在NCBI上進行比對，與已報道的CEV序列（GeneBank ID：KM283182，分離株：H504）同源性達到100%（圖4）。

圖3　CEV經(jīng)PCR（a）和套式PCR（b）后的產(chǎn)物

圖4　該病毒和CEV H504株的部分基因片段的序列比較結(jié)果

同時用特異性擴增KHV的TK和SPH基因的引物，對該樣品進行PCR擴增，沒有見到有相應(yīng)的DNA擴增片段。

以上結(jié)果表明，此養(yǎng)殖場的患病錦鯉是被CEV感染而非KHV；鰓絲上的細長桿菌推測是繼發(fā)感染柱狀黃桿菌。

4　討論

KSD最早發(fā)生于日本新瀉[4]，近年在德國、法國、英國、荷蘭、捷克、奧地利、土耳其等國發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖鯉和錦鯉因CEV感染引起爆發(fā)性死亡的情況[5，6]，成魚和幼魚均會發(fā)病，具昏睡、鰓損害、凹眼、皮膚損害等癥狀，這些臨床癥狀與KHVD類似。由于KSD僅在國外報道，暫時還未能引起國內(nèi)同行的足夠重視。

KHVD在國內(nèi)已經(jīng)被多次檢出，并對漁業(yè)生產(chǎn)造成嚴重危害。過去，每當(dāng)鯉和錦鯉在水溫20℃-30℃發(fā)生大量死亡時，如果出現(xiàn)爛鰓、眼凹陷、皮膚損害等臨床癥狀，通常就初步判斷由KHV引起，用PCR也很容易確診。然而，近年來在北京以及全國各地養(yǎng)殖的鯉和錦鯉中多次出現(xiàn)一種高死亡率的魚病，發(fā)病魚也有爛鰓、凹眼等類似KHVD的臨床特征，但實驗室多次用PCR檢測結(jié)果顯示為KHV陰性。2014年7月和8月，北京房山區(qū)2個養(yǎng)殖場各種規(guī)格錦鯉發(fā)病死亡，發(fā)病魚呈爛鰓、凹眼，死亡率高達80%以上，后經(jīng)檢測確定是CEV感染引起。而這次在北京順義的養(yǎng)殖場又一次檢測到CEV，提示該病毒已經(jīng)在北京地區(qū)擴散。

KHVD和KSD這兩種病癥狀很類似，但發(fā)病溫度略有差別。前者在20℃-30℃之間[1]；而后者發(fā)病水溫范圍較廣，據(jù)報道在7℃-28℃都有發(fā)病[2，4-6]，本次發(fā)病水溫23℃。因此當(dāng)水溫在20℃以上，鯉或錦鯉出現(xiàn)爛鰓、凹眼等癥狀，并導(dǎo)致高死亡率時，難以再依靠臨床特征區(qū)分兩種病，而需要通過PCR檢測來確證。此外本次在發(fā)病魚鰓絲上還可見大量細長桿菌，推測是柱狀黃桿菌，該菌也可引起爛鰓癥狀。這給現(xiàn)場單純依靠臨床癥狀初步診斷KHVD或KSD帶來較大困難，需要進一步研究上述疾病在臨床上表現(xiàn)出的不同癥狀特點。

此次發(fā)生KSD是在魚池進行水質(zhì)調(diào)節(jié)后，并且死亡率較高的1號池水色呈土色，明顯水質(zhì)惡化；死亡率較低的2號池水質(zhì)明顯好于1號池。推測KSD的發(fā)生及造成的死亡率與養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)。

進一步回顧本實驗室近年的魚病監(jiān)測工作，2014年7月，北京市懷柔區(qū)某水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大規(guī)格鯉發(fā)病，死亡率90%，病魚出現(xiàn)爛鰓、凹眼等癥狀，未能檢測到KHV；同年9月，河北省唐山市曹妃甸2個養(yǎng)殖場的鯉大面積死亡，出現(xiàn)爛鰓、凹眼等癥狀，均未能檢測到KHV?？梢娫?年前就出現(xiàn)過類似KHVD的臨床癥狀但檢測又是PCR陰性的情況，提示CEV可能2年前就已經(jīng)進入我國并在各地流行。

5　結(jié)論

CEV可感染錦鯉并導(dǎo)致發(fā)病死亡，經(jīng)分析該病已經(jīng)在北京地區(qū)擴散，并可能已經(jīng)擴散到我國各鯉和錦鯉養(yǎng)殖區(qū)。由于CEV和KHV感染引起的癥狀類似，都能夠引起養(yǎng)殖鯉和錦鯉的高死亡率，臨床上難以區(qū)分。因此有必要引起養(yǎng)殖者以及魚病工作者重視，對KSD進行普查和流行病學(xué)監(jiān)測。

[1]陳愛平，江育林，錢冬，等.錦鯉皰疹病毒病[J].中國水產(chǎn)，2010，10：58-59.

[2]親松剛，的山央人，山本健也，等。PCR法にょゐコィ浮腫癥ゥィルズ検出の試み[J].水產(chǎn)增殖，1997，45（2）：247-251.

[3]SC/T7212.1-2011，鯉皰疹病毒檢測方法第1部分：錦鯉皰疹病毒[S].

[4]Shin-ichi Ono，Akira NAGAI，Noriaki SUGAI.A Histopathological Study on Juvenile Colorcarp，Cyprinus carpio，Showing Edema[J].Fish Pathology，1986，21（3）：167-175.

[5]Verena Jung-Schroers，Mikolaj Ademek，F(xiàn)elix Teitge，et al.Another potential carp killer?：Carp Edema Virus disease in Germany [J].BMC Veterinary Research，2015，11：114-117.

[6]E Lewisch，B Gorgoglione，K Way，et al.Carp Edenma virus/Kio sleepy disease：An Emerging Disease in Central-East Europe[J]. Transboundary and Emerging Disease，2014，9：1-7.

A Preliminary Study of Carp Edema Virus Disease

XU Lipu1，WANG Jingbo1，ZHANG Wen1，PAN Yong1，CAO Huan1，WANG Shu1，WANG Xiaoliang1，WANG Peng1，NA Lihai1，JIANG Yulin2*
（1.Beijing Aquaculture Technology Extention Station，Beijing，100021；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

To find the potential reason causing Koi to die in a fishing farm in Shunyi district，Beijing，the nested PCR was performed with the degenerate primers.After gel electrophoresis，two bands，548 bp and 180 bp，were obtained in samples from the dead fish and no band was found in samples from the health fish.Then，these bands were sequenced and the sequences were blasted to CEV H504 sequence in NCBI database.The result showed that the CEV causes the Koi to die.And the present results implied that the CEV has spread in Beijing area，and more attention should be paid to reduce the loss of fishing income.

Koi Sleepy Disease；Carp Edema Virus；Koi Herpes Virus Disease；Koi；Carp

Q789

E-mail：xulipu001@163.com；*通信作者E-mail：yulinjiangpost@gmail.com

北京市農(nóng)業(yè)試驗示范項目（20160117）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市觀賞魚創(chuàng)新團隊（GSY-02-09）

2016-06-13