薛曉晶　張焱鑫　陳會(huì)君　馬潔　王芳　蘆云

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院　北京　100123）

分子生物學(xué)方法鑒定新資源食品中乳桿菌

薛曉晶張焱鑫陳會(huì)君馬潔王芳蘆云

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京100123）

采用16S rDNA擴(kuò)增同源性分析、16S rDNA PCR-RFLP技術(shù)、種特異性序列擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)新資源食品中的副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明，16S rDNA擴(kuò)增同源性分析能夠有效鑒定嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌，無(wú)法區(qū)分副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌；16S rDNA PCR-RFLP技術(shù)可以有效鑒定嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌；種特異性序列擴(kuò)增能夠有效鑒定副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。結(jié)合檢驗(yàn)工作需要，運(yùn)用以上方法可以對(duì)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中生化鑒定法難以確認(rèn)的乳桿菌進(jìn)行有效鑒別。

新資源食品；乳桿菌鑒定；16S rDNA；RFLP；種特異性擴(kuò)增

1　前言

自2007年以來(lái)的近10年間，我國(guó)衛(wèi)計(jì)委（原衛(wèi)生部）頒布了13條公告[1-9]，批準(zhǔn)12種乳酸菌作為新資源食品或新食品原料，其中包括6種乳桿菌（鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri、發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum）。

在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中[10]，分子生物學(xué)鑒定技術(shù)已可用于乳桿菌屬的鑒定，但目前還沒(méi)有采用此類技術(shù)進(jìn)行食品中乳桿菌菌種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)，這給食品檢測(cè)中乳桿菌菌種鑒定工作帶來(lái)了很大的壓力。即使是標(biāo)準(zhǔn)中明確可以檢測(cè)的乳桿菌，在進(jìn)行傳統(tǒng)生化鑒定時(shí)也存在問(wèn)題，例如GB 4789.35-2010[11]中給出的干酪乳桿菌干酪亞種Lactobacilluscasei subsp. casei、鼠李糖乳桿菌以及標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)提及的副干酪乳桿菌的生化鑒定結(jié)果完全一致，三者無(wú)法區(qū)分。而且各別菌種尤其是商業(yè)化菌種的生化反應(yīng)鑒定結(jié)果受到其自身?xiàng)l件的影響，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果等等。此時(shí)采用分子生物學(xué)鑒定技術(shù)對(duì)乳桿菌菌種進(jìn)行鑒定顯得尤為迫切。

本研究采用16S rDNA擴(kuò)增序列比對(duì)分析、16S rDNA限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)和種特異性序列擴(kuò)增3種分子生物學(xué)鑒定手段，針對(duì)以上提到的部分菌種同時(shí)也是檢測(cè)工作時(shí)樣品中常見(jiàn)的4種乳桿菌：嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及與后兩者無(wú)法區(qū)分的干酪乳桿菌Lactobacillus casei進(jìn)行鑒定分析，建立了分子生物學(xué)鑒定方法，以彌補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)中傳統(tǒng)生化鑒定的不足。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1菌株

干酪乳桿菌干酪亞種（CICC6117）、嗜酸乳桿菌（CICC6074）、鼠李糖乳桿菌（CICC7469）、植物乳桿菌（CICC6073=299v）、動(dòng)物雙歧桿菌Bifidobacterium animalis（CICC6165）：均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；植物乳桿菌（GIM1.140）：購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；副干酪乳桿菌：來(lái)自檢測(cè)樣品。

2.1.2試劑

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；各種引物：由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；限制性內(nèi)切酶（AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ）：NEB（北京）有限公司；基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶、蛋白酶K：天根生化科技（北京）有限公司；taq DNA酶、dNTP、10×PCR buffer、6× Loading buffer、DL2000 Marker：大連寶生物TAKARA有限公司；gel-red熒光核酸凝膠染色試劑：Biotium；瓊脂糖：英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；化學(xué)試劑：均為分析純，西隴化工股份有限公司。

2.2方法

2.2.1乳桿菌的培養(yǎng)及DNA提取

6株乳桿菌菌種懸液涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，36℃培養(yǎng)48 h-72 h；從平板上挑取單菌落至MRS肉湯中，36℃培養(yǎng)18 h-24 h，按基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

2.2.2乳桿菌的16S rDNA序列分析

將提取的6株乳桿菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用16S通用引物[15]，正向引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，反向引物1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；2%瓊脂糖凝膠凝膠電泳，目的片段長(zhǎng)度約1500 bp，產(chǎn)物純化后送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序；將所得基因序列測(cè)序結(jié)果登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用DNAstar（lasergene）軟件分析序列相似性；再采用MAGA5.0軟件通過(guò)鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)判斷乳酸菌的同源關(guān)系。

2.2.3乳桿菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

4株乳桿菌（嗜酸乳桿菌CICC6074、鼠李糖乳桿菌CICC7469、植物乳桿菌CICC6073=299v、副干酪乳桿菌）的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物分別用AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ進(jìn)行酶切[16]，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠凝膠電泳。

2.2.4種特異性PCR[17，18]

使用干酪乳桿菌種特異性引物（正向引物L(fēng). casei：5'-TGC ACT GAG ATT CGA CTT AA-3'，反向引物Y2：5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'）、副干酪乳桿菌種特異性引物（正向引物L(fēng).para：5'-CAC CGA GAT TCA ACA TGG-3'，反向引物Y2）、鼠李糖乳桿菌種特異性引物（正向引物L(fēng).rham：5'-TGCATCTTGATTTAATTTTG-3'，反向引物Y2），對(duì)干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌進(jìn)行種特異性擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠凝膠電泳，目的片段長(zhǎng)度約290 bp。

3　結(jié)果與分析

3.1乳桿菌的16S rDNA序列同源性分析

5株乳桿菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中給出的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA進(jìn)行比對(duì)，采用DNAstar（lasergene）軟件統(tǒng)計(jì)各序列相似度：副干酪乳桿菌（NO.1）、干酪乳桿菌（NO.4）的相似度為99.3%，鼠李糖乳桿菌（NO.7）與前兩者的相似度分別為98.9%和99.1%，3者與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度都在99%以上；嗜酸乳桿菌（CICC6074）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度在99%以上；植物乳桿菌（CICC6073=299v）、植物乳桿菌（GIM1.140）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度都在99%以上；嗜酸乳桿菌和2株植物乳桿菌與副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌3者的相似度在93%以下。結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

通過(guò)MEGA5.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

以非同屬的動(dòng)物雙歧桿菌（CICC6165）為外標(biāo)，副干酪乳桿菌（NO.1）、干酪乳桿菌（NO.4）、鼠李糖乳桿菌（NO.7）所屬分支接近，2株植物乳桿菌（CICC6073=299v、GIM1.140）、嗜酸乳桿菌（CICC6074）分屬于不同的分支，且與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌同支。該結(jié)果與比對(duì)結(jié)果一致。

圖1　乳桿菌16S rDNA序列比對(duì)相似度結(jié)果

圖2　基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.2乳桿菌的16S rDNA PCR-RFLP序列分析

4株乳桿菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ內(nèi)切酶酶切得到不同長(zhǎng)度的片段，通過(guò)分析片段譜圖可以在一定程度上將4種菌進(jìn)行區(qū)分。乳桿菌16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜見(jiàn)圖3。

圖3顯示，泳道1-4、5-8、9-12依次為副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌（CICC6073=299v）的AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ內(nèi)切酶譜圖。嗜酸乳桿菌的3種酶切譜圖（泳道3/7/11）與其他3種菌都不相同；副干酪乳桿菌（泳道5）HinfⅠ酶切譜圖與鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌譜圖（泳道6/8）不相同；植物乳桿菌的AluⅠ酶切譜圖（泳道4）與副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌譜圖（泳道1/2）不同，其HaeⅢ酶切譜圖（泳道12）也與副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌譜圖（泳道9/10）略有不同。將以上結(jié)果歸納于表1中。

圖3　乳桿菌16S rDNA PCR-RFLP酶切圖譜

表1　乳桿菌16S rDNA PCR-RFLP分析結(jié)果

3.3種特異性PCR擴(kuò)增

乳桿菌16S rDNA序列同源性分析顯示，干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌相似度很高，這與文獻(xiàn)[13，15]報(bào)道一致。在菌種未知的情況下，采用16S rDNA同源性分析很難有效將3者區(qū)分，此時(shí)可通過(guò)種特異性PCR對(duì)3者進(jìn)行鑒別。干酪乳酸菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌種特異性擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖4。

圖4　干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌種特異性擴(kuò)增圖譜

圖4所示，泳道1-4、5-8、9-12依次為干酪乳桿菌特異性、副干酪乳桿菌特異性、鼠李糖乳桿菌特異性擴(kuò)增譜圖。在干酪乳桿菌特異性擴(kuò)增中（泳道1-4，依次為干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、空白對(duì)照），只有干酪乳桿菌出現(xiàn)單一目的條帶（290 bp）；在副干酪乳桿菌特異性擴(kuò)增中（泳道5-8，菌種順序同泳道1-4），只有副干酪乳桿菌出現(xiàn)單一目的條帶（290 bp）；在鼠李糖乳桿菌特異性擴(kuò)增中（泳道9-12，菌種順序同泳道1-4），只有鼠李糖乳桿菌出現(xiàn)單一目的條帶（290 bp）?？偨Y(jié)擴(kuò)增結(jié)果，通過(guò)3種乳桿菌的特異性引物擴(kuò)增，可有效將這3種菌區(qū)分開(kāi)，見(jiàn)表2。

表2　干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌特異性擴(kuò)增結(jié)果

4　討論

16S rDNA擴(kuò)增同源性分析可進(jìn)行種水平或亞種水平的乳桿菌鑒定，能夠區(qū)分嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等，其種間相似度低于93%。但對(duì)于親緣關(guān)系極近的乳桿菌（16S rDNA序列相似度達(dá)99%以上），如鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌，則無(wú)法采用該方法鑒別。16S rDNA PCR-RFLP技術(shù)可以有效鑒定嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌，而干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的酶切帶型完全一致而無(wú)法區(qū)分（在本文中未體現(xiàn)）。鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌3者則可采用種特異性序列擴(kuò)增進(jìn)行有效鑒別。

除本研究采用的3種方法外，還有隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD）[16]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)（AFLP）、變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）[17，18]、16S-23S rRNA區(qū)間序列分析等多種技術(shù)也可用于乳桿菌的鑒定。鑒于乳桿菌的多樣性特點(diǎn)和每一種分子技術(shù)的局限性，目前還無(wú)法通過(guò)單純一種分子鑒定手段完成所有乳桿菌的鑒定工作。本研究采用的3種技術(shù)是眾多技術(shù)中對(duì)人員、儀器、耗材要求較低的幾種，更適于廣大檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)際應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)人員在檢驗(yàn)工作中以傳統(tǒng)生化鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合以上一種或幾種分子生物學(xué)方法，可對(duì)難以用生化鑒定法確認(rèn)的乳桿菌進(jìn)行有效地鑒別。

5　結(jié)論

本研究通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增同源性分析、16S rDNA PCR-RFLP技術(shù)和種特異性序列擴(kuò)增技術(shù)的綜合分析，有效完成了副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus、嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum的鑒定工作。希望本研究方法能應(yīng)用于更多乳桿菌的鑒定，并在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化篩選更適合的分子鑒定方法，以用于乳桿菌及其他乳酸菌的分型鑒定，使食品中乳桿菌分型鑒定工作得到普及，推動(dòng)整體微生物檢測(cè)水平的發(fā)展，為進(jìn)一步完善食品中乳桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委.關(guān)于發(fā)酵乳桿菌CECT5716等3個(gè)菌種的公告[A].2016年第6號(hào)公告.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委.關(guān)于批準(zhǔn)塔格糖等6中新食品原料的公告[A].2014年第10號(hào)公告.

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委.關(guān)于批準(zhǔn)殼寡糖等6種新食品原料的公告[A].2014年第6號(hào)公告.

[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告[A].2011年第25號(hào)公告.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.關(guān)于批準(zhǔn)翅果油等2種新資源食品的公告[A].2011年第1號(hào)公告.

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.關(guān)于批準(zhǔn)γ-氨基丁酸、初乳堿性蛋白、共軛亞油酸。共軛亞油酸甘油脂、植物乳桿菌（菌株號(hào)ST-Ⅲ）、杜仲籽油為新資源食品的公告[A].2009年第12號(hào)公告.

[7]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.關(guān)于批準(zhǔn)低聚半乳糖等新資源食品的公告[A].2008年第20號(hào)公告.

[8]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.關(guān)于批準(zhǔn)嗜酸乳桿菌等7種新資源食品的公告[A].2008年第12號(hào)公告.

[9]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部監(jiān)督局.關(guān)于已獲批準(zhǔn)新資源食品調(diào)查情況的函[A].衛(wèi)監(jiān)督食一便函〔2008〕140號(hào)，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部衛(wèi)新食準(zhǔn)字（2007）第0006號(hào).

[10]SNT 1941.3-2007進(jìn)出口食品中乳酸菌檢驗(yàn)方法第3部分：乳酸桿菌的PCR法[S].

[11]GB 4789.35-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)[S].

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[13]于潔，孫志宏，張家超，等.16S rDNA-RFLP技術(shù)鑒定西藏地區(qū)乳制品中的乳桿菌[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，38（6）：804-810.

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Identification of Lactobacillus of New Resource Food by Molecular Biology Methods

XUE Xiaojing，ZHANG Yanxin，CHEN Huijun，MA Jie，WANG Fang，LU Yun
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100123）

Identification of four species（L.paracasei，L.rhamnosus，L.plantarum，L.acidophilus）of Lactobacillus of new resource food by using techniques of the analysis of 16S rDNA homology amplification，16S rDNA PCR-RFLP and species-specific sequence amplification.The results show that the analysis of 16S rDNA homology amplification can identify L.plantarum and L.acidophilus effectively，but it is not useful to distinguish between L.paracasei and L.rhamnosus.16S rDNA PCR-RFLP technique identify L.paracasei，L. rhamnosus，L.plantarum，L.acidophilus effectively.Species-specific amplification can effectively identify L. paracasei and L.rhamnosus.Considering the requirements of examination，the above methods can be used to identify the strains which can not be identified by the biochemical identification method described in the national standard of food safety.

New Resource Food；Identification of Lactobacillus；16S rDNA；RFLP；Species-Specific Amplification

R939.11+7

E-mail：xuexiaojing@caiqtest.com

中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院科研項(xiàng)目（2015JK019）

2016-09-23