李桂芬　馬潔　孔君　張永江　魏梅生

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院　北京　100121）

馬鈴薯V病毒抗體及TAS-ELISA試劑盒的研制

李桂芬馬潔孔君張永江魏梅生*

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京100121）

用純化的馬鈴薯V病毒（Potato virus V）免疫家兔獲得多克隆抗體；免疫BALB/c小鼠，用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得2株分泌馬鈴薯V病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株并制備腹水抗體。以多克隆抗體為包被抗體，單克隆抗體為檢測抗體研制了TAS-ELISA檢測試劑盒。

馬鈴薯V病毒；多克隆抗體；單克隆抗體；TAS-ELISA試劑盒

1　前言

馬鈴薯V病毒（Potato virus V，PVV）為馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬成員[1]，是我國的檢疫性有害生物。PVV主要分布在歐洲的法國、德國、荷蘭、愛爾蘭、英國以及南美洲的玻利維亞高原和秘魯?shù)鹊貐^(qū)[2]，我國尚無該病毒侵染報道。PVV侵染的馬鈴薯葉片灰白，新生葉變小，輕度扭曲，發(fā)展為花葉和壞死斑[3]。目前該病毒可通過生物學(xué)、酶聯(lián)方法、RTPCR方法、實(shí)時熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測[2-5]。

酶聯(lián)方法具有簡便、實(shí)用、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前較常用的檢測方法，而高質(zhì)量的抗體是酶聯(lián)檢測方法的關(guān)鍵因素。因此，本研究通過常規(guī)方法純化PVV，制備多克隆和單克隆抗體，研制靈敏度高、特異性好的PVV TAS-ELISA試劑盒。

2　材料和方法

2.1材料

2.1.1毒源

PVV：從德國DSMZ引進(jìn)3株毒源，編號分別為PV-318、PV-319、PV-225，接種在本氏煙（Nicotiana benthamiana）、德氏煙（Nicotiana debneyi）上，放置在隔離溫室中。

馬鈴薯A病毒（Potato virus A，PVA）：從德國DSMZ引進(jìn)，編號PV-0320，接種在本氏煙上，放置在隔離溫室中。

馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）：從德國DSMZ引進(jìn)，編號PV-0739，接種在昆諾藜（Chenopodium quinoa）上，放置在隔離溫室中。

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）：從德國DSMZ引進(jìn)，編號PV-0403，接種在白肋煙上（Nicotiana tobacum cv.White Burley），放置在隔離溫室中。

馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）：日本來源，接種在白肋煙上，放置在隔離溫室中。

萵苣花葉病毒（Lettuce mosaic virus，LMV）：從美國ATCC引進(jìn)，編號PV-63，接種在昆諾藜上，放置在隔離溫室中。

李痘病毒（Plum pox virus，PPV）：從德國DSMZ引進(jìn)，編號PV-0001，接種在本氏煙上，放置在隔離溫室中。

2.1.2試劑

巰基乙醇：化學(xué)純，購自AMRESCO公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉：均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TritonX-100：分析純，購自Sigma公司；聚乙二醇（PEG）：化學(xué)純，MW6000，日本進(jìn)口；蔗糖：純度≥99.9%，購自AMRESCO公司。

A蛋白柱、G蛋白柱：購自GE公司；馬抗小鼠酶標(biāo)抗體：購自Vector Laboratories公司。

2.1.3儀器設(shè)備

Avanti J-26XPI離心機(jī)、Optima L-100XP離心機(jī)：BECKMAN公司。

2.2方法

2.2.1馬鈴薯V病毒繁殖與純化

PV-318接種在本氏煙上，3周后采收病葉150g，加入500 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，含0.15%巰基乙醇，0.01 mol/L乙二胺四乙酸二鈉），組織搗碎機(jī)搗碎，雙層紗布過濾，3752×g離心10 min；向580 mL上清中緩慢加入TritonX-100至1%，加入氯化鈉至0.2 mol/L，PEG至4%，4℃冰箱攪拌4 h，18 160×g離心30 min；沉淀懸浮于50 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0），緩慢加入TritonX-100至1%，4℃冰箱攪拌過夜；3024×g離心15 min，上清液210053×g離心2 h；沉淀用4 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）懸浮，4℃攪拌60 min，4110×g離心10 min；上清液經(jīng)10%-40%蔗糖梯度離心（210053×g）2 h；吸取病毒帶，即為精提純病毒。測紫外，用直沾法制備電鏡片觀察病毒粒體形態(tài)。

2.2.2家兔免疫、多克隆抗體效價測定及純化

用純化的PVV制劑免疫家兔，免疫方法見文獻(xiàn)[6]；效價測定采用間接ELISA方法，包被抗原為純化的PVV病毒4 μg/mL；用A蛋白柱進(jìn)行抗體純化。

2.2.3單克隆抗體制備及純化

將純化的PVV制劑免疫8周齡的BALB/c小鼠，具體方法和PVV純化病毒用量參見文獻(xiàn)[7]。細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化、腹水抗體的制備按常規(guī)方法[8]。腹水抗體用G蛋白柱進(jìn)行純化。

2.2.4TAS-ELISA檢測方法的建立

2.2.4.1抗體濃度確定

分別以PVV多克隆抗體1 μg/mL、2 μg/mL為包被抗體，與PVV單克隆抗體1 μg/mL、2 μg/mL組合成TAS-ELISA檢測試劑盒（馬抗小鼠酶標(biāo)抗體濃度1：1000稀釋），以確定最佳使用濃度。

2.2.4.2試劑盒特異性檢測

用試劑盒檢測PVA、PVS、PVY、PVX、LMV、PPV以確定是否與上述病毒有交叉反應(yīng)。

2.2.4.3試劑盒與DSMZ毒源反應(yīng)

用試劑盒檢測DSMZ引進(jìn)的馬鈴薯V病毒3個分離物（PV-318、PV-319、PV-225）。

2.2.4.4試劑盒靈敏度檢測

將PVV純化病毒按一定濃度稀釋以確定試劑盒檢測純化病毒靈敏度；將感染PVV（PV-318）的德氏煙病葉按一定比例稀釋以確定試劑盒檢測病汁液的靈敏度。

2.2.4.5試劑盒穩(wěn)定性檢測

試劑盒在4℃保存12個月后檢測PVV（PV-318、PV-319、PV-225）、PVA、PVS、PVY、PVX、LMV、PPV。

3　結(jié)果

3.1病毒純化

純化的PVV病毒經(jīng)紫外測定，呈典型的核蛋白吸收曲線，OD260nm=3.474，OD280nm=1.952，OD260nm/OD280nm= 1.78（圖1）；濃度1.5 mg/mL；透射電子顯微鏡下可見線狀病毒粒體（圖2）。

圖1　純化PVV的紫外吸收曲線

圖2　純化PVV線狀病毒粒體

3.2多克隆抗體效價

PVV多克隆抗體效價為1∶16000。

3.3雜交瘤細(xì)胞株及腹水抗體

3次克隆化得到2株雜交瘤細(xì)胞株，分別為5號、7號，腹水效價分別為1∶3276800、1∶102400。

3.4TAS-ELISA檢測方法的建立

3.4.1抗體濃度

酶聯(lián)試驗(yàn)加入底物后60 min讀數(shù)（OD405nm值），結(jié)果見表1。經(jīng)比較，多抗1 μg/mL為適宜包被濃度；5號單抗和7號單抗適宜使用濃度均為1 μg/mL。

表1　試劑盒適宜抗體濃度實(shí)驗(yàn)

3.4.2試劑盒特異性

5號、7號抗體分別作為檢測抗體時試劑盒的特異性結(jié)果見表2（加入底物后60 min讀數(shù)）。結(jié)果顯示，試劑盒與PVA、PVS、PVY、PVX、LMV、PPV均為陰性反應(yīng)，特異性好。

表2　試劑盒的特異性

3.4.3試劑盒與PVV分離物的反應(yīng)

試劑盒與PVV不同分離物的反應(yīng)均呈明顯陽性，見表3。

表3　試劑盒與PVV分離物的反應(yīng)

3.4.4試劑盒靈敏度

5號、7號抗體分別作為檢測抗體時與PVV不同分離物均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（表3），但5號抗體讀數(shù)高于7號抗體，5號抗體的特異性反應(yīng)優(yōu)于7號抗體（表2），因此選取5號抗體單獨(dú)作為試劑盒的檢測抗體。

試劑盒檢測純化病毒的靈敏度實(shí)驗(yàn)見圖3。當(dāng)純化病毒為15.625 ng/mL時，OD值明顯陽性，因此檢測純化病毒靈敏度為15.625 ng/mL。

檢測病汁液的靈敏度見圖4（所用病毒為PV-318）。當(dāng)PVV德氏煙病汁液稀釋倍數(shù)為1∶12800時，OD值明顯陽性，因此此稀釋倍數(shù)為試劑盒檢測病汁液靈敏度。

圖3　試劑盒檢測純化病毒靈敏度

圖4　試劑盒檢測PVV德氏煙病汁液靈敏度

3.4.5試劑盒穩(wěn)定性

試劑盒4℃保存12個月后與各病毒的反應(yīng)見表4。表4顯示，試劑盒與3個PVV分離物均呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，與PVA、PVS、PVY、PVX、LMV、PPV為陰性反應(yīng)，試劑盒穩(wěn)定性好。

表4　試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

4　討論

本研究獲得了2株分泌PVV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。5號抗體腹水效價高于7號抗體，作為檢測抗體與多克隆抗體組成檢測試劑盒時，5號抗體陽性樣品OD值高于7號，5號抗體健康樣品讀數(shù)低于7號，因此本研究研制的試劑盒使用5號抗體作為檢測抗體。

本研究研制的TAS-ELISA試劑盒用單克隆抗體作為檢測抗體，其特異性明顯好于用多克隆抗體作為包被抗體和檢測抗體的酶聯(lián)方法，如間接酶聯(lián)方法和雙抗體夾心酶聯(lián)方法。TAS-ELISA方法也省去了將特異性抗體進(jìn)行酶標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)過程，易于操作。

5　結(jié)論

本研究用差速離心和蔗糖梯度離心方法得到了純化的PVV病毒粒體，制備了特異性好和效價高的多克隆和單克隆抗體，并研制了檢測PVV的TASELISA試劑盒。該試劑盒能檢測濃度為15.625 ng/mL的純化病毒和稀釋12800倍的德氏煙病汁液，靈敏度高；與PVA、PVS、PVY、PVX、LMV、PPV不發(fā)生交叉反應(yīng)；與PVV病毒3個分離物均為強(qiáng)陽性反應(yīng)?？捎糜赑VV實(shí)際檢測。

[1]洪健，李德葆，周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[2]張永江，辛言言，李桂芬，等.實(shí)時熒光RT—PCR方法檢測馬鈴薯V病毒[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：36-38.

[3]GB/T31806-2015馬鈴薯V病毒檢疫鑒定方法[S].

[4]劉梅，黃新，馬占鴻，等．應(yīng)用DPO引物檢測馬鈴薯病毒的多重RT-PCR技術(shù)研究[J]．植物病理學(xué)報，2009，39（4）：431-434.

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Preparation of Antibody against Potato virus V and TAS-ELISA Kit

LI Guifen，MA Jie，KONG Jun，ZHANG Yongjiang，WEI Meisheng*
（Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing，100121）

The purified virus of PVV was used to immunize rabbit and polyclonal antibody was produced. Two hybridoma cell lines secreting monoclonal antibody against PVV was produced by hybridoma technology.A polyclonal antibody for capture and monoclonal antibody as detection formed TAS-ELISA Kit.

Potato virus V；Polyclonal Antibody；Monoclonal Antibody；TAS-ELISA Kit

S41-30

E-mail：liguifen2002@163.com；*通訊作者E-mail：xsms2013@163.com

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310071）

2016-03-08