張嘉熙　何美麗　趙冰松　李臨梅

1.中國(guó)人民解放軍第263醫(yī)院口腔治療中心 北京 101149；2.北京佳美口腔醫(yī)院正畸科 北京 100020

促紅細(xì)胞生成素在成骨細(xì)胞分化中的實(shí)驗(yàn)研究

張嘉熙1何美麗1趙冰松1李臨梅2

1.中國(guó)人民解放軍第263醫(yī)院口腔治療中心 北京 101149；2.北京佳美口腔醫(yī)院正畸科 北京 100020

目的 研究促紅細(xì)胞生成素（EPO）對(duì)成骨細(xì)胞分化和功能的影響以及EPO-EPO受體（EPOR）信號(hào)在成骨細(xì)胞中的作用，探討EPO在骨穩(wěn)態(tài)中的作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系（ST2），加入EPO蛋白，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因的變化，采用堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色方法觀察成骨細(xì)胞骨形成功能。采用RNA干擾技術(shù)沉默EPOR基因，檢測(cè)阻斷EPO-EPOR信號(hào)通路后成骨細(xì)胞分化和功能的變化。結(jié)果 骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)EPOR，EPO與受體EPOR結(jié)合后，可誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，增加Runx2、Alp和Col1等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)增加ALP蛋白的表達(dá)和鈣結(jié)節(jié)的沉積。EPOR基因沉默后，成骨相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。結(jié)論 EPO通過(guò)EPOR信號(hào)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和功能。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞； 成骨細(xì)胞； 促紅細(xì)胞生成素； 促紅細(xì)胞生成素受體

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是由腎皮質(zhì)腎小管周?chē)g質(zhì)細(xì)胞和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，是參與紅細(xì)胞前體細(xì)胞分化和成熟的一個(gè)至關(guān)重要的細(xì)胞因子，EPO腎功能衰竭的患者必須注射促紅細(xì)胞生成素以避免嚴(yán)重貧血[1]。EPO與促紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPOR）結(jié)合發(fā)揮作用，引發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的增殖和分化[2]。因此EPO-EPOR信號(hào)是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞增殖、分化和存活所必需的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 然而，EPO/EPOR信號(hào)在非造血細(xì)胞中的作用還知之甚少。最近，有學(xué)者已經(jīng)證明了EPO能激活造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的JAK/STAT信號(hào)，導(dǎo)致骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的產(chǎn)生和骨形成，而且EPO在體外還直接激活間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[3]。因此，本研究設(shè)想EPO-EPOR信號(hào)參與了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程，應(yīng)用骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2，研究EPO通過(guò)與EPOR結(jié)合誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的骨形成的作用。

1　材料和方法

1.1材料

α-最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（GIBCO公司，美國(guó)）；RNA提取試劑盒（北京博邁德公司）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2（ATCC號(hào)：TIB-71，ATCC細(xì)胞庫(kù)，美國(guó)）。青霉素-鏈霉素（PAA公司，美國(guó)）。維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2儀器設(shè)備

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（三洋公司，日本），ABI7300熒光定量PCR儀（非凡公司，美國(guó)）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

ST2細(xì)胞用α-MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)于37℃、95%濕度、5%CO2環(huán)境中。細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。ST2細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)：取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況比較良好的ST2細(xì)胞進(jìn)行傳代后，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與ST2細(xì)胞培養(yǎng)相同。每日觀察細(xì)胞貼壁增殖情況及細(xì)胞形態(tài)的變化。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制：在正常的有血清培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mg·L-1維生素C，β-甘油磷酸鈉10 mmol·L-1，1×10-8mol·L-1地塞米松，避光，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

ST2細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組：實(shí)驗(yàn)組（簡(jiǎn)稱EPO組），對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組（EPO+轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GI583527），轉(zhuǎn)染對(duì)照組（EPO+空白質(zhì)粒TR30013）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別用含或不含EPO蛋白（20 U·mL-1）的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)（含10%FBS、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液和1%青霉素-鏈霉素）。轉(zhuǎn)染組采用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)使EPOR基因沉默，分別按實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒shRNA TR30013作為陰性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒EPOR shRNA-GI583527，每2天換液。

1.4基因沉默

ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染EPOR短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），使EPO的配體EPOR基因沉默，從而達(dá)到EPO不發(fā)揮作用的效果。使用脂質(zhì)體2000攜帶EPOR shRNA，按照試劑盒的說(shuō)明操作。ST2細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)直到細(xì)胞達(dá)到80%匯合。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，使EPOR基因沉默，在無(wú)血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒EPOR（shRNAGI583527），6孔板每孔脂質(zhì)體2000為6 μL，相對(duì)應(yīng)EPOR shRNA為2.5 μg。稀釋培養(yǎng)基為250 μL的無(wú)血清、無(wú)雙抗α-MEM培養(yǎng)基，混勻之后，靜止20 min，轉(zhuǎn)染5 h后換10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒shRNA-TR30013，方法同上。

1.5熒光定量PCR

細(xì)胞分別培養(yǎng)2、4、6 d時(shí)提取總RNA，總RNA進(jìn)行定量（260 nm的吸光度），逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，使用SYBR?Premix Ex Taq? PCR試劑盒，內(nèi)參為β-肌動(dòng)蛋白，熒光定量PCR所用引物如下：Epor（基因片段標(biāo)號(hào)為：NM_ 010149.3），Runx2（NM_001145920.1），Col1（NM_007742.3），Alp（NM_007431.2）。結(jié)果表示成2（-ΔΔCt）形式，以對(duì)照組為1。

1.6ALP活性檢測(cè)

ALP檢測(cè)試劑盒內(nèi)A、B溶液比例為1∶1，避光，吸取培養(yǎng)基，鹽水沖洗1遍，每孔加入200 μL的AB混合液，靜置40 min后加入50 μL終止液。檢測(cè)細(xì)胞ALP活性，酶聯(lián)儀520 nm測(cè)定各孔吸光度。

1.7鈣結(jié)節(jié)測(cè)定

取ST2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別處理，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組按要求相應(yīng)的換條件培養(yǎng)液，而對(duì)照組仍為等體積的常規(guī)培養(yǎng)液。各組每3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)3周左右，顯微鏡觀察鈣化結(jié)節(jié)形成過(guò)程。

茜素紅染色：鏡下可以查見(jiàn)黑色不透明區(qū)域時(shí)行茜素紅染色，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗后，95%乙醇固定10 min，10 ℃、0.2%茜素紅染色30 min，蒸餾水沖洗，倒置顯微鏡下拍照保存。

茜素紅定量：染色完成后，配洗脫液：10%氯化十六烷吡啶單水合物（用PBS緩沖液稀釋），37 ℃以6孔板每孔1 mL洗脫20 min，將洗脫液吸取到96孔板內(nèi)，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在波長(zhǎng)562 nm處振蕩10 s測(cè)光密度（optical density，OD）值。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，配對(duì)t檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EPO對(duì)成骨細(xì)胞的作用

ST2細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為20 U·mL-1的EPO，對(duì)照組加入相同體積的PBS液，培養(yǎng)2、4和6 d分別提取總RNA。采用熒光定量PCR檢測(cè)EPO對(duì)成骨細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示（圖1），實(shí)驗(yàn)組EPOR的表達(dá)在培養(yǎng)2 d（P＜0.05）和4 d（P＜0.01）時(shí)呈遞增趨勢(shì)，而成骨分化標(biāo)志性基因Runx2、Col1和Alp的表達(dá)都有所增加。其中Runx2和Alp細(xì)胞培養(yǎng)第4天時(shí)表達(dá)增加（P＜0.05），Col1在培養(yǎng)2、4和6 d時(shí)表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。

圖1　定量熒光PCR檢測(cè)EPO對(duì)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 1 The expression of gene osteoblast differentiation of EPO by real-time PCR

2.2EPOR基因沉默對(duì)成骨細(xì)胞的作用

采用熒光定量PCR檢測(cè)EPOR基因沉默后，EPO對(duì)成骨向誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞的影響。圖2A結(jié)果顯示，EPOR基因沉默后，其表達(dá)受到抑制。其中第四天表達(dá)明顯降低（P＜0.01），沉默效率最高能達(dá)到約80%。圖2B～D為成骨分化標(biāo)志性基因的表達(dá)，Runx2、Col1和Alp表達(dá)都有所降低。其中Runx2的表達(dá)在第2天和第4天明顯降低（P＜0.01），Col1和Alp在細(xì)胞培養(yǎng)第6天時(shí)表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。

圖2　EPOR基因沉默后定量熒光PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)Fig 2 The expression of gene osteoblast differentiation of EPO by real-time PCR after EPOR gene silence

2.3EPO對(duì)成骨細(xì)胞的功能作用

ST2細(xì)胞培養(yǎng)3、7和14 d的ALP檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，圖中2組3、7和14 d的ALP活性均呈遞增趨勢(shì)，7和14 d實(shí)驗(yàn)組明顯比對(duì)照組表達(dá)升高（P＜0.01）。圖4為茜素紅染色，檢測(cè)2組鈣結(jié)節(jié)量的變化，圖4A為對(duì)照組，4B為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組的鈣結(jié)節(jié)量明顯比對(duì)照組高。對(duì)照組茜素紅定量在波長(zhǎng)562 nm處測(cè)得OD值為0.134 3，而實(shí)驗(yàn)組OD值為0.189，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3　ALP檢測(cè)Fig 3 ALP activity assay

圖4　鈣結(jié)節(jié)檢測(cè)EPO對(duì)成骨細(xì)胞的影響 體式顯微鏡 × 100Fig 4 Alizarin red stain for erythropoietin calcium in osteoblasts stereomicroscope × 100

3　討論

EPO是一種造血肽激素，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和紅系祖細(xì)胞前體細(xì)胞的終末分化[4]。人EPO基因位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂22區(qū)，有多肽和糖基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約3.4×104，含有2個(gè)二硫鍵、一個(gè)碳末端的精氨酸（Arg）殘基[5]。未成熟的EPO前體僅由193個(gè)氨基酸組成，發(fā)育過(guò)程中，一個(gè)包含27個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)碳末端C-精氨酸解離，碳水化合物加入，形成由165個(gè)氨基酸和4條糖鏈組成的成熟EPO。

EPOR是人類Epor基因編碼的蛋白質(zhì)，由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜域、胞內(nèi)域組成。EPOR是分子量為5.9×104，其本身沒(méi)有內(nèi)源性酪氨酸激酶活化劑來(lái)激活受體信號(hào)。EPOR作為一個(gè)二聚體預(yù)先存在，它與3.4×104的EPO配體結(jié)合，改變其二聚化的狀態(tài)。在EPO的刺激下，EPOR胞漿近膜部分到羧基末端的8個(gè)酪氨酸殘基全部發(fā)生磷酸化，結(jié)合胞質(zhì)內(nèi)包含SH2功能區(qū)的信號(hào)傳遞因子，從而發(fā)揮EPO促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等的功能。

EPO可以活化造血干細(xì)胞中的JAK/STAT信號(hào)，誘導(dǎo)BMP2的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)骨形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EPO可以直接作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表型，增加Runx2、Col1和Alp等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。

經(jīng)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPO組的Runx2、Col1和Alp等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)明顯增加，得出EPO可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。同時(shí)，EPOR基因沉默組成骨相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制。由此得出，EPO促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化是通過(guò)與EPOR結(jié)合而發(fā)揮作用的。本研究又對(duì)EPO功能進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)ALP與鈣結(jié)節(jié)的結(jié)果得出，加入EPO的實(shí)驗(yàn)組明顯比對(duì)照組高表達(dá)，說(shuō)明EPO能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能。

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（本文編輯 張玉楠）

Roles of erythropoietin on the differentiation of osteoblasts

Zhang Jiaxi1, He Meili1, Zhao Bingsong1, Li Linmei2.

(1.Center of Stomatology, 263 Hospital of People Liberation Army, Beijing 101149, China; 2. Dept. of Orthodontics, Jiamei Dental Hospital, Beijing 100020, China)

Objective This study aimed to investigate the effects of erythropoietin(EPO) on the differentiation and function of osteoblasts, to identify the roles of EPO-erythropoietin receptor(EPOR) in osteoblasts, and to explore the effects and mechanism of EPO in bone homeostasis. Methods Mouse bone marrow stromal cell line ST2 was cultured in vitro and treated with EPO. Changes in osteoblastic gene levels were quantified by real-time polymerase chain reaction. The function of osteoblasts in bone formation was observed by alkaline phosphatase(ALP) and alizarin red staining. EPOR expression was knocked down by RNA interfere. The differentiation and function of osteoblasts were then tested by the above methods. Results ST2 cells expressed EPOR. After binding with EPOR, EPO induced osteoblast differentiation from bone marrow stromal cells. Expression levels of osteoblast-related genes Runx2, Alp, and Col1 increased. ALP and calcium deposition increased. Expression levels of osteoblast-related genes were repressed after EPOR knockdown. Conclusion EPO promotes the differentiation and function of osteoblasts through EPO-EPOR signaling.

bone marrow stromal cell； osteoblasts； erythropoietin； erythropoietin receptor

Q 51

A [doi] 10.7518/gjkq.2016.06.004

2016-03-22；

2016-09-01

張嘉熙，碩士，Email：491994879@qq.com

李臨梅，學(xué)士，Email：jeson_yue5@sina.com