李 裕

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006）

高效液相色譜紫外檢測法測定飼料中N-氨甲酰谷氨酸的含量

李 裕

（湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006）

本實驗建立了高效液相色譜紫外檢測法測定飼料中N-氨甲酰谷氨酸含量的方法。配合飼料樣品用水提取后經(jīng)混合型陰離子固相萃取柱凈化富集。以甲醇-0.05%磷酸水溶液（V/V，5∶95）為流動相，C18色譜柱分離，檢測波長215 nm。結(jié)果表明，在1.5～500 μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好，R2=1，樣品回收率為88.6%～101.2%，相對標準偏差為0.69%～2.31%（n=5），定量限為0.075 mg/g?？梢姳痉椒ㄟm用于飼料中N-氨甲酰谷氨酸的含量測定。

飼料；N-氨甲酰谷氨酸；高效液相色譜

N-氨甲酰谷氨酸是N-乙酰谷氨酸的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)類似物，能激活動物體內(nèi)氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ和二氫吡咯-5-羧酸合成酶，從而促進精氨酸的生成。精氨酸在調(diào)控動物機體營養(yǎng)代謝和免疫反應(yīng)方面有重要作用，可提高多胎動物窩產(chǎn)仔數(shù)和初生重、促進幼齡動物生長和發(fā)育（Wu等，2004）。N-氨甲酰谷氨酸的成本僅為精氨酸的1/10（馮濤等，2012）。目前含有N-氨甲酰谷氨酸的飼料產(chǎn)品主要有飼料添加劑和配合飼料兩大類。

目前報道的檢測飼料中N-氨甲酰谷氨酸的方法有高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（梁婧等，2015；唐圣蕓等，2014）。相比常見的高效液相色譜紫外檢測法，串聯(lián)質(zhì)譜法對色譜條件、樣品凈化容忍度較高，而且靈敏度高、定性更準確，常用于復(fù)雜基質(zhì)中極痕量物質(zhì)的檢測。但串聯(lián)質(zhì)譜儀器昂貴，運行和維護成本也較高，大部分飼料企業(yè)尚未配備。而且對于含量較高樣品的檢測，由于串聯(lián)質(zhì)譜上機的稀釋倍數(shù)大、離子源的離子化效率及穩(wěn)定性等因素，定量可能不如高效液相色譜紫外檢測法準確。因此，本實驗旨在建立一種適用于大多數(shù)飼料企業(yè)實驗室使用，能準確測定飼料中N-氨甲酰谷氨酸含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器Waters 2695高效液相色譜儀配2489型紫外檢測器、2998型二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；Delta 320型pH計（梅特勒-托利多公司）；OASIS MAX固相萃取柱（150 mg，6cc，美國Waters公司）。

1.2 試劑N-氨甲酰谷氨酸（純度≥98%，Sigma公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

N-氨甲酰谷氨酸標準儲備液：準確稱取N-氨甲酰谷氨酸對照品102 mg置于100 mL容量瓶中，用水溶解，定容至刻度，搖勻。該溶液濃度為1.0 mg/mL。

N-氨甲酰谷氨酸標準工作液：移取不同體積標準儲液，用流動相配制成不同濃度標準工作液：1.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL。

1.3 樣品前處理

1.3.1 飼料添加劑樣品前處理準確稱取飼料添加劑樣品0.2 g置于100 mL容量瓶中，加入約70 mL水，搖勻，置超聲清洗儀中超聲約10 min，取出恢復(fù)至室溫后，加水定容至刻度，搖勻。用去離子水稀釋至合適的上機濃度，過0.22 μm針頭式濾器，供高效液相色譜測定。

1.3.2 配合飼料樣品前處理準確稱取配合飼料1 g置于100 mL容量瓶中，加入70 mL水，搖勻，置超聲清洗儀中超聲約10 min，取出恢復(fù)至室溫后，加水定容至刻度，搖勻。濾紙過濾后，用5%氨水溶液微調(diào)至pH≥6.5（如果樣液pH本身大于6.5則不用調(diào)）。

1.3.3 過柱凈化OASIS MAX固相萃取柱中加入5 mL甲醇進行柱活化，加入5mL水進行柱平衡，準確移取2mL樣液加入柱中，使流速小于1 mL/min緩慢過柱；加入3 mL 5%氨水清洗，抽干；加入3 mL甲醇清洗，抽干；6 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫入10 mL小燒杯。通風(fēng)櫥內(nèi)65℃水浴。待液體揮發(fā)至干，準確移取1mL水加入小燒杯中，充分溶解后過0.22 μm針頭式濾器，供高效液相色譜測定。

1.4 色譜條件色譜柱：菲羅門lunaC18柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇-0.05%磷酸水溶液（V/V，5∶95）。流速：0.7 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30℃；檢測波長：215 nm。

1.5 標準曲線的繪制將1.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL的對照品工作液，依次注入色譜儀，測定各濃度工作液的峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.6 靈敏度的測定分別稱取3份1.00 g空白配合飼料，按樣品處理方法測定，測得基線噪音值，按10倍信噪比計算，得到方法的定量限。

1.7 回收率的測定

1.7.1 飼料添加劑回收率的測定自制N-氨甲酰谷氨酸含量分別為5%、10%、20%的混合型添加劑樣品。每個含量的樣品設(shè)置5個重復(fù)，按1.3.1方法進行處理后上機測定。采用外標法計算含量、回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.7.2 配合飼料回收率的測定稱取空白配合飼料，加入標準儲備液，使添加濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%。每個含量的樣品設(shè)置5個重復(fù)，按1.3.2方法進行處理后上機測定。采用外標法計算含量、回收率和相對標準偏差（RSD）。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖色譜圖見圖1～5。N-氨甲酰谷氨酸峰形完好，無雜峰干擾。

圖1 N-氨甲酰谷氨酸標準溶液色譜圖

圖2 空白飼料添加劑色譜圖

圖3 飼料添加劑中添加N-氨甲酰谷氨酸色譜圖

圖4 空白配合飼料色譜圖

圖5 配合飼料中添加N-氨甲酰谷氨酸色譜圖

2.2 線性范圍與定量限檢測線性方程為y= 0.0005x-0.6556，R2=1。在1.5～500 μg/mL濃度范圍線性關(guān)系良好。本方法測定飼料中N-氨甲酰谷氨酸的定量限為0.075 mg/g（相當(dāng)于含量0.0075%）。

2.3 準確度與精密度當(dāng)飼料添加劑N-氨甲酰谷氨酸含量為5%、10%、20%時，平均回收率分別為101.2%（RSD=0.81%）、100.5%（RSD=0.76%）、99.7%（RSD=0.69%）。配合飼料中N-氨甲酰谷氨酸含量為0.05%、0.1%、0.2%時，平均回收率分別為88.6%（RSD=2.31%）、90.4%（RSD=1.96%）、92.3%（RSD=1.89%）。

3 討論

3.1 流動相的選擇N-氨甲酰谷氨酸有兩個羧酸基團和一個N-氨甲?；鶊F。極性強的離子型化合物在C18色譜柱上幾乎是不保留的。水相中含有一定量的磷酸，可抑制羧酸基團的離子化，增加保留時間。同時還可以抑制C18色譜柱上硅羥基的離子化，削弱COO-與Si-Oδ-Hδ+的相互作用，減小拖尾。本實驗中磷酸加入量為0.001%～0.1%能滿足檢測要求。從保護色譜柱、緩沖能力兩方面考慮，磷酸的加入量定為0.05%。乙腈的洗脫能力強，且目標化合物不溶于乙腈，所以不適合選用。本試驗選擇甲醇為有機相。甲醇比例降到色譜柱允許的5%時，隨柱溫變化，保留時間在7～12 min，可滿足色譜分離的要求。

3.2 檢測波長的選擇N-氨甲酰谷氨酸在紫外檢測器范圍僅有末端吸收，在205～190 nm范圍吸收值突躍很大。235～210 nm范圍吸收值增加平穩(wěn)，但吸收值不高?？紤]到水、甲醇的紫外截止波長分別為200、205 nm。本試驗不使用梯度洗脫，選擇215 nm作為檢測波長。

3.3 提取N-氨甲酰谷氨酸溶于水、甲醇，不溶于乙腈。用水、甲醇提取都能滿足實驗要求。用甲醇提取并未表現(xiàn)出提取液雜質(zhì)較少的優(yōu)勢，原因可能是提取液中鹽類等離子型化合物變少，但油脂、脂溶性維生素等干擾物質(zhì)增加。因此，本實驗選擇水為提取溶劑。

3.4 凈化有機酸類化合物適合使用陰離子柱進行純化。離子交換時，樣液的pH值很關(guān)鍵。由于柱容量的限制和色譜分離的需要，在保證N-氨甲酰谷氨酸完全陰離子化的同時，需盡量避免其他陰離子數(shù)量的增加，所以調(diào)節(jié)pH值的氨水不宜過量。樣液中N-氨甲酰谷氨酸濃度較高時（如200 μg/mL），pH值5.2可保證N-氨甲酰谷氨酸陰離子化完全。樣液中N-氨甲酰谷氨酸濃度較低時（如10 μg/mL），pH值6.5可保證N-氨甲酰谷氨酸陰離子化完全。

3.5 空白樣品的選擇含有N-氨甲酰谷氨酸的飼料產(chǎn)品目前僅有飼料添加劑和配合飼料兩大類。飼料添加劑產(chǎn)品、混合型飼料添加劑產(chǎn)品的配物料通常有淀粉、谷氨酸鈉、中草藥提取物等。所以制備空白飼料添加劑樣品時，按淀粉65%、谷氨酸鈉25%、杜仲葉提取物5%、淫羊藿提取物5%的比例制成飼料添加劑空白樣品。以驗證這些物料對本方法是否有干擾?？瞻着浜巷暳鲜褂媚筹暳蠌S家提供的不含N-氨甲酰谷氨酸的仔豬配合飼料。

3.6 添加濃度的選擇飼料添加劑產(chǎn)品、混合型飼料添加劑產(chǎn)品中N-氨甲酰谷氨酸的含量一般為40%～80%。含量越高，就越容易測定。飼料添加劑選擇5%、10%、20%三種含量做添加回收試驗。N-氨甲酰谷氨酸在配合飼料中的加入量大多在0.09%～0.2%（馮濤等，2012；彭瑛等，2011）。所以配合飼料選擇的添加濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%。

4 結(jié)論

建立了測定飼料添加劑、配合飼料中N-氨甲酰谷氨酸含量的高效液相色譜方法。本方法準確度、精密度、定量限均符合飼料中N-氨甲酰谷氨酸含量的檢測要求，而且操作相對簡單，對儀器設(shè)備要求不高，適合大多數(shù)飼料企業(yè)質(zhì)檢實驗室使用。

[1]馮濤，白佳樺，閆學(xué)軍，等.N-氨甲酰谷氨酸在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（10）：137～139.

[2]梁婧，徐懿，宋亮，等.HPLC-ESI-MS/MS法檢測N-氨甲酰谷氨酸的含量［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2015，36（5）：22～23.

[3]彭瑛，蔡力創(chuàng).精氨酸和精氨酸生素對斷奶仔豬生長性能、器官重及生化指標的影響［J］．中國畜牧獸醫(yī)．2011，38（8）：23～26．

[4]唐圣蕓，王遠興，溫平威，等.高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的N-氨基甲酰-L-谷氨酸［J］.色譜，2014，32（2）：184～188.

[5]Wu G，Knabe D A，Kim S W.Arginine nutrition in neonatal pigs［J］.The Journal of Nutrition，2004，134（10）：2783～2790.

A high performance liquid chromatography（HPLC）method was developed for the quantitation of N-carbamylglutamate in feed.Sample was extracted with water，and purified by anion exchange SPE cartridge.The HPLC separation was achieved on a C18 column using a mobile phase of methanol and 0.05%phosphoric acid aqueous solution（V∶V= 5∶95）.The UV detector was operated at 215 nm.The method provided good linearity from 1.5 μg/mL to 500 μg/mL（R2=1）. The recoveries were in the range of 88.6%～101.2%and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 0.69%～2.31%（n=5）.The quantification limit was 0.075 mg/g.It was a simple，rapid and reliable method for the determination of N-carbamylglutamate in feed.

feed；N-carbamylglutamate；high performance liquid chromatography

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161711

S816.17

A

1004-3314（2016）17-0041-03