程超，白敏冬，鄭琦琳，陳操，孟祥盈，張芝濤

（1.大連海事大學輪機工程學院，遼寧大連116026；2.廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，福建廈門361005；3大連海事大學環(huán)境工程研究所，遼寧大連116026）

羥基自由基殺滅壓載水中有害赤潮物種的生物有效性研究

程超1，白敏冬2，3*，鄭琦琳2，陳操1，孟祥盈1，張芝濤3

（1.大連海事大學輪機工程學院，遼寧大連116026；2.廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院，福建廈門361005；3大連海事大學環(huán)境工程研究所，遼寧大連116026）

本研究采用大氣壓下強電離放電協(xié)同氣液混溶技術，高效制備羥基自由基（·OH）殺滅3個門的典型有害赤潮物種，使用熒光染色、測定光合作用潛能等生物學檢測方法確定·OH致死閾值。結果表明，5.05×104cells／m L的赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）、5.28×104cells／mL的亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）和5.02×104cells／mL的中肋骨條藻（Skeletonema costatum），其致死閾值分別為1.24 mg／L、2.01 mg／L、1.12 mg／L，此時其葉綠素a分解率分別為77%、85%和74%。利用光學顯微鏡觀察，處理前后藻細胞結構有明顯的改變。因此，·OH致死方法可有效地殺滅壓載水中的有害赤潮藻。

羥基自由基；赤潮藻；致死閾值

1　引言

赤潮是一種海洋生態(tài)異?，F(xiàn)象，它的大面積頻繁發(fā)生，導致海洋生態(tài)系統(tǒng)的結構與功能幾乎徹底崩潰，我國沿海赤潮爆發(fā)的主要成因之一是通過船舶壓載水遷移到中國海域的外來赤潮藻。這些外來藻類對生態(tài)適應性強、分布廣，只要環(huán)境適宜就可爆發(fā)赤潮，幾乎導致海洋生態(tài)結構與功能的崩潰［1—3］。為切斷海洋生物入侵的主要途徑，2004年國際海事組織（IMO）通過了《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》，制定了嚴格的壓載水排放標準（D-2）。即將強制執(zhí)行的D-2壓載水排放標準規(guī)定：尺寸大于50μm的入侵生物少于10個／L；10～50μm的入侵生物少于10個／mL［4］。因此，亟待發(fā)明一種高效殺滅船舶壓載水中海洋入侵藻的方法。

近年來，國內外學者做了大量殺藻的研究，化學方法主要包括硫酸銅法（CuSO4）、氯法（NaClO）、臭氧法（O3）等。Ebenezer等［5］研究利用CuSO4殺滅1.3 ×107cells／m L多環(huán)旋溝藻，投加量為5 mg／L，經(jīng)過1 d時間的處理，可致死100%的藻。但研究指出CuSO4殺藻時間長，具有毒性，藥劑在海水中不能分解、消失，將長期傷害非赤潮海洋生物，影響海洋生態(tài)環(huán)境。Tsolaki等［6］研究電解海水產(chǎn)生NaClO等活性物質殺滅壓載水中的藻類，對于1×104cells／mL的甲藻，致死CT值200 mg·min／L；但電解法對赤潮藻的殺滅效果受海水鹽度高低的制約較大，殘余氧化劑濃度高、處理時間長，電解會產(chǎn)生氫氣，存在爆炸隱患，排放壓載水含有三鹵甲烷、鹵代乙酸、鹵代乙腈等化學副產(chǎn)物，海洋生態(tài)不安全［7—9］。Oemcke和Van［10］研究表明，臭氧法殺滅壓載水中的前溝甲藻，投加臭氧量5～10 mg／L，處理時間6 h，可有效處理壓載水中的藻；Warschkun［9］等指出O3處理壓載水會形成化學副產(chǎn)物，如溴酸鹽等，會對海洋生態(tài)造成潛在的威脅。

在研究治理海洋外來赤潮藻的方法時，應遵循高級氧化技術［11—12］（AOT或AOP）的原則，其核心是羥基自由基（·OH）。·OH是強氧化劑（氧化還原電位2.80 V），可低劑量致死赤潮藻；·OH反應速率達到109mol／（L·s），是O3的107倍，可在數(shù)秒內快速致死赤潮藻；·OH是綠色的氧化劑，剩余·OH分解成H2O、O2，不會對海洋生態(tài)造成負面影響。此外，·OH致死生物的劑量與生物體的比表面積成反比，海洋浮游生物與海洋中小型生物如魚蝦的比表面相差甚大，致死赤潮藻類的·OH劑量對魚蝦等海洋生物幾乎無影響。

本研究使用1.0 t／h的小型處理系統(tǒng)，以3種典型的赤潮藻作為研究對象，即赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）、亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）、中肋骨條藻（Skeletonema costatum），對其進行殺滅研究，以SYTOX Green熒光染色結合葉綠素熒光參數(shù)Fv／Fm值來確定·OH致死的閾值濃度，并對細胞形態(tài)進行觀察和分析。

2　材料和方法

2.1實驗材料

實驗藻種：赤潮異彎藻（H．a(chǎn)kashiwo）、亞歷山大藻（A．tamarense）、中肋骨條藻（S．costatum），購置于廈門大學國家重點實驗室藻種庫。使用三角燒瓶以f／2培養(yǎng)液單種培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，光照2 000 lx，光暗比為14L∶10D。利用顯微鏡（OLYMPUS）對藻細胞的活性進行監(jiān)測，并通過直接計數(shù)法計算藻細胞密度。同時檢測藻液的吸光度，待細胞生長至對數(shù)期進行實驗。實驗所用海水取自大連塔河灣，經(jīng)沉淀沙濾，0.45μm混合纖維濾膜過濾和高溫消毒，冷卻后待用。

2.2實驗流程

利用大氣壓強電場強電離放電方法，在等離子體源的窄間隙放電空間中，放電電場強度E大于等于100 k V／cm，電子平均能量大于等于10 eV，電子密度大于等于1014cm-3，電離占空比大于等于2%，大量電子具有將O2電離（12.5 eV）、離解（8.6 eV）的高能量，可生成高濃度的氧等離子體O+2、O（1D）、O（3P）、O3等氧活性粒子［13］。并通過文丘里高速射流作用在水中生成等氧自由基溶液，以·OH為主包括HO-2、O2·-、O3·-、HO3·、H2O2等，其濃度定義為總殘余氧化劑TRO（Total Residual Oxidant）。從液液混容器出口到取樣點處理時間為1 s，在此管道傳輸過程中，·OH殺滅壓載水中的藻類。圖1給出實驗流程系統(tǒng)。

圖1　實驗流程系統(tǒng)圖Fig.1 Schematic process of the experiment system

2.3檢測方法

2.3.1TRO檢測

TRO濃度采用N，N-二乙基對苯二胺（DPD，美國EPA方法8016）法［14］，使用CECIL-CE2501紫外分光光度計檢測，在處理系統(tǒng)中采用美國HACHCL17型余氯在線分析儀檢測?！H濃度以對羥基苯甲酸（4-HBA）作為捕捉劑，通過Dionex Ultimate 3000高級液相色譜（HPLC）測定其生成產(chǎn)物三四羥基苯甲酸（3，4-DHBA）的濃度來測定［15］。

2.3.2藻細胞活性及形態(tài)觀察

采用熒光計數(shù)法判定藻細胞的活性及狀態(tài)，選擇核酸染色劑SYTOX Green（Life Technologies，美國）作為熒光染料［16］，染色濃度1μmol／mL，染色時間15 min，使用正置熒光顯微鏡（Nikon 90i，日本）對藻細胞進行觀察計數(shù)，活細胞中葉綠素a在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光；死細胞在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光。

2.3.3藻細胞的光合潛能分析

光合潛能Fv／Fm值表示藻細胞光合反應中心（PSII）的最大光量子產(chǎn)量［17］，采用浮游植物熒光儀（ZQ-WALZ 004 PHYTO-PAM，德國）進行測定。取一定體積的樣品，經(jīng)充分暗適應，打開測量光可測得最小熒光F0；給出一個飽和脈沖，得到葉綠素熒光F［18］m，根據(jù)Fm和F0可以計算出：

2.3.4藻細胞葉綠素a檢測

葉綠素a是存在于藻類中的光合色素，使用丙酮萃取熒光分光光度計進行測定。取一定體積的樣品，利用GF／F玻璃纖維膜（Whatman）過濾，過濾后將玻璃纖維膜剪碎置于離心管中，并加入10 mL的90%的丙酮置于-20℃的冰箱里萃取12 h，再將樣品進行離心分離取上清液，采用熒光分光光度計（Agilent G9800A，美國），在激發(fā)波長430 nm、發(fā)射波長663 nm下，測定葉綠素a的濃度。

3　結果與分析

3.1熒光染色確定致死藻的閾值

將TRO溶液注入到排放壓載水的管路中，分別對藻密度為5.05×104cells／m L的H．a(chǎn)kashiwo，5.28×104cells／mL的A．tamarense，5.02×104cells／mL的S．costatum進行殺滅，結果如圖2所示。隨著TRO注入濃度的逐步增加，藻密度急劇下降，最后熒光染色鑒別未見活細胞，H．a(chǎn)kashiwo的致死閾值濃度為1.24 mg／L，A．tamarense的致死閾值濃度為2.01 mg／L，S．costatum的致死閾值濃度為1.12 mg／L。對于不同種類的藻，TRO閾值濃度不同，因為藻細胞的大小、結構差異所致，但致死趨勢相同。

圖2　藻密度與TRO濃度關系Fig.2 Relationship between the concentration of TRO and the alga densities

熒光顯微鏡下觀察到·OH處理前后藻細胞的熒光染色圖如圖3所示，處理前3種藻H．a(chǎn)kashiwo、A．tamarense和S．costatum的細胞多以單體細胞形式存在，形態(tài)完整，在特定熒光的激發(fā)下顯示為自體紅色熒光；在TRO致死閾值下，藻細胞膜的通透性發(fā)生改變，SYTOX Green染料進入到細胞與DNA結合，使其發(fā)出綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察到3種藻細胞被全部致死。

Wright等［19］利用O3法處理壓載水，TRO投加量在2.5～7.0 mg／L，可達到IMO壓載水排放標準；Oemcke和Van［10］采用O3法殺滅1×104cells／mL的甲藻，所需殺滅劑量大于5 mg／L，殺滅時間大于10 min。Jung等［20］利用電解法處理壓載水，投加TRO在5～10 mg／L時，處理時間大于40 min；Tsolaki等［6］實驗表明電解法殺滅壓載水中的外來藻，處理時間為45 min。本實驗·OH致死典型的赤潮藻，TRO劑量小于2 mg／L，殺滅時間僅為1 s，遠小于上述傳統(tǒng)方法。因此，采用·OH法防治海洋外來赤潮藻具有不可比擬的優(yōu)勢，不僅能滿足IMO壓載水排放標準，而且具有廣泛實際應用前景。

3.2光合潛能確定致死藻的閾值

在·OH作用下，H．a(chǎn)kashiwo、A．tamarense、S．costatum的光合潛能變化如圖4所示，3種藻的初始Fv／Fm值分別為0.56、0.76、0.55，在正常情況下Fv／Fm值相對穩(wěn)定［21］，隨著TRO注入濃度的增大，F(xiàn)v／Fm值急劇減小，當TRO分別為1.30 mg／L、2.10 mg／L、1.20 mg／L時，F(xiàn)v／Fm值分別降至檢測限以下，表明·OH已破壞藻細胞的光合反應系統(tǒng)，導致藻細胞無法進行光合作用，失去了賴以生存的能量生產(chǎn)和轉換中心。H．a(chǎn)kashiwo、A．tamarense、S．costatum的光合潛能表征TRO閾值與熒光染色法相比，分別提高了0.06 mg／L，0.09 mg／L，0.08 mg／L，表明藻細胞在受到·OH攻擊時，不僅細胞膜通透性發(fā)生了改變，同時藻細胞的光合作用系統(tǒng)也受到嚴重損傷，但沒有被完全破壞，繼續(xù)提高TRO值，3種藻的光合作用系統(tǒng)被完全破壞，無法檢測到Fv／Fm值。

3.3葉綠素a含量變化

藻細胞葉綠素a含量變化如圖5所示，對于藻密度基本相同的H．a(chǎn)kashiwo、A．tamarense、S．Costatum，其葉綠素a含量分別為35.72μg／L、69.85μg／L、30.35μg／L，這種差別主要是細胞的大小和結構差異導致的。隨著注入TRO濃度的增加，葉綠素a含量急劇降低，在致死閾值時，H．a(chǎn)kashiwo的葉綠素a含量降為10.02μg／L，分解率為77%；A．tamarense葉綠素a含量降為8.18μg／L，分解率為85%；S．Costatum的葉綠素a含量降為7.85μg／L，分解率為為74%，表明葉綠素a大部分被氧化分解。實驗表明·OH具有極強的氧化脫色能力，可通過細胞膜進入細胞內氧化分解葉綠素，使藻細胞無法進行光合作用，導致細胞死亡。

圖3　處理前后藻細胞的熒光染色圖Fig.3 Fluorescence change before and after treatment

圖4　光合潛能與TRO濃度關系Fig.4 Effect of TRO dosage on photochemical parameters

圖5　處理前后葉綠素a含量變化Fig.5 Effect of TRO dosage on chlorophyll a content

3.4藻細胞形態(tài)分析

采用光學顯微鏡觀察，·OH處理前后藻細胞形態(tài)的變化如圖6所示，圖A、B、C為處理前，圖a、b、c為處理后。H．a(chǎn)kashiwo屬于黃藻門，細胞呈橢圓形，長約8～25μm，寬約6～15μm，無細胞壁，由質膜包裹，內容物有序分布，色素體光亮稠密，細胞能夠快速游動；處理后細胞收縮呈圓形，細胞靜止不動，葉綠素脫色嚴重。A．tamarense屬于甲藻門，細胞近圓形，上下殼為半球形，大小相近，細胞長度在20～52μm，寬度在17～44μm，細胞能夠快速游動；處理后細胞輪廓模糊，葉綠素脫色，細胞質收縮，細胞有明顯變形。S．costatum屬于硅藻門，細胞為透鏡形或圓柱形，直徑為6～22μm，有硅質外殼，殼面圓而鼓起，與鄰細胞組成長鏈，色素體數(shù)目1～10個，但通常呈2個；處理后細胞形態(tài)相對完整，但·OH能通過硅質外殼上的縫隙進入細胞內，使葉黃素等色素體脫色，內容物缺失嚴重。

3種藻H．a(chǎn)kashiwo，A．tamarense，S．Costatum的致死閾值由其大小和結構決定的，A．tamarense的細胞體積大，外層有細胞壁包裹，殺滅閾值高于H．a(chǎn)kashiwo和S．costatum。H．a(chǎn)kashiwo的細胞體積雖比S．costatum大，但其無細胞壁，二種藻的殺滅閾值相當。

圖6　·OH處理藻細胞形態(tài)的變化Fig.6 Cellular morphology change before and after treatment

4　結論

與現(xiàn)有的氯法和臭氧法相比，無論是投加劑量還是處理時間羥基法殺滅赤潮藻類都具有不可比擬的優(yōu)勢。

（1）熒光染色法確定致死閾值表明：藻密度為5.05×104cells／mL的H．a(chǎn)kashiwo，5.28×104cells／mL的A．tamarense，5.02×104cells／mL的S．costatum致死閾值濃度分別為1.24 mg／L，2.01 mg／L，1.12 mg／L。

（2）光合潛能法確定致死閾值表明：對于上述密度的3種藻，其致死閾值分別為1.30 mg／L、2.10 mg／L、1.20 mg／L，略高于熒光法的致死閾值。

（3）TRO濃度分別達到各致死閾值時，各個藻細胞的葉綠素含量大大降低，其分解率分別達到了77%、85%、74%。

（4）3種藻的殺滅閾值高低與細胞的大小和結構有關，處理后3種藻的形態(tài)結構都發(fā)生明顯改變，細胞輪廓模糊，細胞質收縮，色素體呈現(xiàn)明顯的脫色現(xiàn)象。

綜上所述，羥基法殺滅赤潮藻具有廣闊的實際應用前景，能更好的滿足國內外綠色防治壓載水中外來赤潮藻的需求。

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Research on biological effectiveness of hydroxyl radicals killing marine red tide algae in ballast water

Cheng Chao1，Bai Mindong2，3，Zheng Qilin2，Chen Cao1，Meng Xiangying1，Zhang Zhitao3
（1．College of Marine Engineering，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China；2．College of Environment and Ecology，Xiamen University，Xiamen 361005，China；3．Environmental Engineering Institute，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China）

In this study，the three typical red tide species were chosen as the experiment algae and the inactivationwas achieved by hydroxyl radials generated from a strong ionization discharge combined with hydrodynamic cavitations.The viability and integrity of the algae were determined by the fluorescence staining and Pulse Amplitude Modulation.The results suggest that a quick and complete loss of viability was achieved for three species after exposure to hydroxyl radical，for the Heterosigma akashiwo，Alexandrium tamarensem，Skelrtonema costatum which the density is 5.05×104cells／mL，5.28×104cells／mL，5.02×104cells／mL respectively，the lethal thresholds are 1.24 mg／L，2.01mg／L，and 1.12 mg／L separately.Meanwhile Algal cells were deformed and shrunk after·OH attack and chlorophyll content was degraded at the same time.The chlorophyll content decomposition rate reaches to 77%，85%and 74%at the lethal thresholds.Above all，the use of hydroxyl radicals is an efficient method to kill red tide species in ballast water.

hydroxyl radials；red tide algae；lethal thresholds

程超，白敏冬，鄭琦琳，等.羥基自由基殺滅壓載水中有害赤潮物種的生物有效性研究［J］.海洋學報，2016，38（2）：131—137，

10.3969／j.issn.0253-4193.2016.02.013

Cheng Chao，Bai Mindong，Zheng Qilin，et al.Research on biological effectiveness of Hydroxyl radicals killing marine red tide algae in ballast water［J］.Haiyang Xuebao，2016，38（2）：131—137，

10.3969／j.issn.0253-4193.2016.02.013

U664.9

A

0253-4193（2016）02-0131-07

2015-06-09；

2015-09-23。

國家科技支撐計劃（2013BAC06B01，2013BAC06B02）；國家重大科研儀器研制項目（NSFC 61427804）；國家杰出青年科學基金（NSFC 61025001）；海洋科學研究公共利益的專項基金。

程超（1991—），男，湖北省當陽市人，主要研究方向船舶海洋污染防控。E-mail：845624123＠qq.com

白敏冬，教授，長江學者獎勵計劃特聘教授、國家杰出青年基金獲得者。E-mail：mindong-bai＠163.com