劉家齊，趙正曉，魏穎，徐飛，張紅英，李密輝，陸林瑋，魏凱，董競成

(復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

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芍藥苷對哮喘模型小鼠氣道炎癥趨化因子及受體的干預作用

劉家齊，趙正曉，魏穎，徐飛，張紅英，李密輝，陸林瑋，魏凱，董競成*

(復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

目的 觀察芍藥苷給藥后對小鼠哮喘模型氣道炎癥趨化因子及受體的影響。方法 用卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立小鼠哮喘模型；ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中卵蛋白特異性IgE(OVA-IgE)和趨化因子CCL19、CCL21水平；RT-PCR法檢測肺組織中趨化因子受體CCR7mRNA表達；Western blot檢測肺組織CCR7及核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)蛋白表達。結果 芍藥苷干預組小鼠血清IL-6、TNF-α水平顯著下降；BALF中OVA-IgE和CCL19、CCL21水平顯著降低；肺組織CCR7mRNA、CCR7及NF-κB蛋白表達明顯減少。結論 芍藥苷對哮喘模型小鼠氣道炎癥趨化因子CCL19/CCL21及其受體CCR7具有顯著的抑制作用。

支氣管哮喘；氣道炎癥；趨化因子；NF-κB；芍藥苷; 小鼠

支氣管哮喘是免疫球蛋白E(IgE)介導的以炎癥、嗜酸性粒細胞浸潤及氣道高反應性為重要特征的慢性氣道疾病。多種趨化因子、炎性因子及炎癥信號通路交織作用，構成了哮喘的龐雜網絡。全球約有3億哮喘患者，造成每年約25萬人死亡以及數十億美元醫(yī)療費用支出。雖然皮質激素吸入一定程度降低了哮喘死亡率，但該病發(fā)病率依舊不斷攀升[1]。而當前新的治療方法匱乏以及治療效率低下，使得針對哮喘有效的、安全的干預藥物的需求日益迫切。芍藥苷是赤芍中的主要效應成分，本團隊前期研究表明，芍藥苷對哮喘氣道炎癥具有顯著的拮抗作用[2-3]。本實驗擬在前期基礎之上，利用卵蛋白誘導的哮喘小鼠模型，進一步探討芍藥苷對氣道炎癥中關鍵趨化因子及其受體的影響，充分發(fā)掘中醫(yī)藥寶庫，為當前哮喘防治手段匱乏的局面提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級BALB/c小鼠60只，雌性，6周齡，體重(16±3)g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】。由復旦大學藥學院實驗動物中心飼養(yǎng)【SYXK(滬)2010-0099】。超聲霧化器(402AI型)：江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司；芍藥苷：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；地塞米松片：山東新華制藥股份有限公司；卵蛋白(OVA，grade V)、氫氧化鋁：Sigma，美國；卵蛋白特異性IgE(OVA-IgE)試劑盒：Shibayagi，日本；CCL19、CCL21、IL-6、TNF-α試劑盒：Raybiotech，美國；抗鼠CCR7、p-IκBα及p-p65抗體：Abcam，英國。

1.2 動物分組、建模及藥物干預

將60只BALB/c 小鼠隨機編成6組： NC(正常對照組，10只)、A(哮喘模型組)、P 10(芍藥苷10 mg/kg組，10只)、P 25(芍藥苷25 mg/kg組，10只)、P 50(芍藥苷50 mg/kg組，10只)及DXM(地塞米松0.085 mg/kg組，10只)。參照文獻[4]，第0天起予BALB/c小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水混懸液(20 μg OVA+2 mg氫氧化鋁)，小鼠處于致敏狀態(tài)。第7、14和21天分別以相同方法加強致敏三次。第25天起利用超聲霧化器將3% OVA直接作用于小鼠肺部，連續(xù)7 d，每天1次，每次持續(xù)30 min。小鼠出現口唇發(fā)紺、呼吸加快、腹肌痙攣、點頭呼吸及站立不穩(wěn)等，表明哮喘模型建立成功。第24天起，予對應干預組小鼠分別進行芍藥苷低、中、高劑量及地塞米松溶液灌胃，連續(xù)灌服8 d，每天1次，每次0.3 mL；對照組小鼠灌服等量的生理鹽水。

1.3 標本檢測

1.3.1 BALF中OVA-IgE、趨化因子及血清IL-6、TNF-α檢測

氣道高反應性測試后[3]，將氣管灌洗針插入左支氣管處，開胸結扎右主支氣管和右肺，一次性注射器抽取PBS 0.3 mL緩慢推入左肺并迅速回抽灌洗液，灌洗2～3次?；厥盏腂ALF離心后取上清，用ELISA檢測BALF中OVA-IgE、趨化因子及血清IL-6、TNF-α水平。

1.3.2 肺組織中CCR7mRNA表達檢測

取下結扎的右側肺組織，液氮迅速固定。采用RT-PCR檢測肺組織中CCR7mRNA表達水平。依照說明書進行抽提組織RNA，經逆轉錄合成cDNA，最后使用PCR進行擴增產物。引物序列，CCR7上游引物：5’-CGCAACTTTGAGCGGAACAA-3’，下游引物：5’-TTCGCAGCTGCTATTGGTGA-3’；GAPDH上游引物：5’-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’，下游引物：5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3’。內參為GAPDH，按照2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。1.3.3 肺組織CCR7、p-IκBα及p-p65蛋白含量檢測

用Western-Blot檢測，方法如下：凍存的肺組織剪碎、勻漿、裂解，提取上清液并測定蛋白濃度；先后加10%分離膠及5%的濃縮膠；經蛋白上樣、電泳后轉PVDF膜，5%BSA室溫封閉2 h；隨后TBST洗膜，分別經封閉稀釋的CCR7(1∶2000)、p-IκBα(1∶1000)及p-p65(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)及二抗。1.4 統(tǒng)計方法

數據通過SPSS Statistics 19.0進行分析，數據以均數 ± 標準誤表示。數據滿足方差齊性，應用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；方差不齊，采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清IL-6、TNF-α水平

對比正常組，模型組血清IL-6、TNF-α水平明顯升高(P <0.01)。芍藥苷低、中、高劑量對IL-6和TNF-α水平均具有顯著下調作用，療效明顯優(yōu)于地塞米松，且P 50效果最優(yōu)(P<0.001)。(見圖1)。

2.2 BALF中OVA-IgE及趨化因子水平

較之正常小鼠，哮喘小鼠BALF中OVA-IgE(P<0.05)、CCL19(P<0.001)和CCL21(P<0.01)水平升高顯著。地塞米松能顯著降低CCL21水平(P<0.05)，但對OVA-IgE及CCL19水平有降低趨勢但無顯著性。芍藥苷低劑量組的CCL19和CCL21明顯下降，且有顯著性(P<0.05)；芍藥苷中劑量組對OVA-IgE(P<0.05)、CCL19(P<0.001)和CCL21(P<0.01)水平均有顯著抑制作用；芍藥苷高劑量組對三者有降低趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。(見圖2)。

注：NC．正常組；A．哮喘模型組；P10,P 25,P 50．芍藥苷低、中、高劑量組；DXM．地塞米松組。與正常組對比**：P<0.01；***：P<0.001；與與模型組對比#：P<0.05；##：P<0.01；###：P<0.001。圖1 芍藥苷對血清IL-6和TNF-α水平的影響Note. NC. Normal control group; A. Asthma group; P10，P25，P50. Low,medium and high does paeoniflorin groups; DXM. Dexamethasone group. **P<0.01,***P<0.001 vs.control group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs.the asthma group.Fig.1 Effect of paeoniflorin on the serum levels of IL-6 and TNF-α

注：NC．正常組；A．哮喘模型組；P 10、P 25、P 50．芍藥苷低、中、高劑量組；DXM．地塞米松組。與正常組對比*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；與模型組對比#：P<0.05；##：P<0.01；###：P<0.001。圖2 芍藥苷對BALF中OVA-IgE及CCL19、CCL21水平的影響Note. NC. Normal control group; A:Asthma group; P10,P25,P50. Low,medium and high does paeoniflorin groups; DXM. dexamethasone group. *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001， vs. control group;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001, vs.the asthma group.Fig.2 Effect of paeoniflorin on OVA-IgE and CCL19，CCL21 levels in the BALF

2.3 肺組織CCR7、NF-κB蛋白及CCR7mRNA含量變化

相比對照組，哮喘小鼠肺組織CCR7(P<0.01)、p-IκBα(P<0.05)和p-p65(P<0.05)蛋白表達明顯增加；CCR7mRNA水平顯著升高(P<0.05)。相比模型組，地塞米松對CCR7、p-IκBα和p-p65均可顯著抑制(P<0.05)，而對CCR7mRNA水平的抑制作用未顯示出差異性(P>0.05)。芍藥苷低劑量組下調CCR7和p-IκBα蛋白水平最優(yōu)(P<0.01)；高劑量組下調p-p65蛋白水平最優(yōu)(P<0.001)；且CCR7mRNA水平能夠被高劑量芍藥苷有效抑制(P<0.05)(見圖3)。

注：NC．正常組；A．哮喘模型組；P 10、P 25、P 50．芍藥苷低、中、高劑量組；DXM．地塞米松組。與正常組對比*：P<0.05；**：P<0.01；與模型組相比，與模型組對比#：P<0.05；##：P<0.01；###：P<0.001。圖3 芍藥苷對CCR7、NF-κB蛋白及CCR7mRNA含量的影響Note. NC. Normal control group; A:Asthma group; P10，P25，P50. Low,medium and high does paeoniflorin groups; DXM. Dexamethasone group. *P<0.05,**P<0.01 vs. the control group; #P<0.05,##P<0.01,###P<0.001， vs.the asthma group.Fig.3 Effect of paeoniflorin on CCR7 and NF-κB proteins and CCR7mRNA

3 討論

哮喘有著十分復雜的發(fā)病機制，在哮喘的不同病理階段，趨化因子及其受體、IgE、炎性因子及炎癥信號通路等各自扮演著不同的重要角色。芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物，來自于傳統(tǒng)的清熱活血中藥芍藥，具有抗炎、抗氧化應激等功效，且毒副作用小。我課題組近期研究已證實芍藥苷可明顯降低哮喘小鼠氣道高反應性及嗜酸性粒細胞浸潤[2-3]。

IgE可介導I型超敏反應，在哮喘的免疫過程中具有關鍵作用。當接觸變應原時，IgE交聯使嗜堿性粒細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放多種炎癥介質加重哮喘炎癥反應[5]。本研究結果顯示，哮喘模型小鼠BALF中IgE水平明顯升高，而在芍藥苷治療后顯著降低，且效果優(yōu)于地塞米松。表明芍藥苷能有效減輕IgE介導的變態(tài)反應。

IL-6和TNF-α是機體內重要的促炎癥因子，在哮喘的發(fā)病過程中起重要作用。TNF-α是炎癥啟動因子，能夠激活中性粒細胞，增加內皮細胞和上皮細胞通透性，并與IL-6交互而放大炎性信號[6]。且研究也已證實哮喘患者癥狀的嚴重程度與血清IL-6和TNF-α水平呈正相關[7-8]。本研究結果顯示，哮喘模型小鼠血清IL-6和TNF-α水平明顯升高，芍藥苷干預組IL-6和TNF-α水平顯著降低，且遠優(yōu)于地塞米松干預組。

趨化因子是一種低分子量分泌蛋白，其中CCL19(MIP-3β)和CCL21(6Ckine)通過與其共同的功能性受體CCR7結合而驅動免疫細胞定向遷移。早期研究發(fā)現CCL19、CCL21及CCR7能夠調控樹突狀細胞或巨噬細胞活性，提呈抗原及激活初始T細胞[9-12]。T淋巴細胞在受到樹突狀細胞調節(jié)時分泌大量炎性因子，直接或間接參與誘發(fā)或加重哮喘炎癥免疫反應[13]。也有研究發(fā)現，過敏性哮喘患者BALF中CCR7+T細胞比例顯著升高，CCR7的表達與過敏性哮喘的病理過程密切相關[14]。因而抑制這些趨化因子及其受體活性可能有助于減輕哮喘炎癥反應。本研究結果顯示，哮喘模型小鼠BALF中CCL19和CCL21水平明顯升高，肺組織CCR7mRNA及CCR7蛋白表達量顯著增加。經芍藥苷治療后，CCL19和CCL21水平、CCR7mRNA含量以及CCR7蛋白表達量顯著降低。說明抑制CCL19/CCL21/CCR7活性可能是芍藥苷拮抗哮喘氣道炎癥的重要機制之一。

NF-κB是一種多效的轉錄調節(jié)因子，在機體炎癥及免疫反應中起重要調控作用。p65和p50是NF-κB家族的重要成員，靜息細胞中以無活性形式與其抑制蛋白IκB結合，趨化因子、細胞因子、氧化應激等刺激可使其活化及磷酸化，激活轉錄及介導炎癥反應[15]。本研究發(fā)現，哮喘模型組小鼠肺組織p-IκB和p-p65蛋白表達明顯增加，而芍藥苷治療后p-IκB和p-p65蛋白表達被顯著抑制。表明芍藥苷可通過部分阻斷NF-κB通路而起到抗炎功效。此外，有報道顯示，CCL19/CCR7與NF-κB的交互作用能活化p-IκB，導致NF-κB入核并增強其DNA結合能力[16]。此外，也有報道稱CCL19或CCL21刺激樹突狀細胞也導致NF-κB活化[17]。

綜上所述，本研究進一步證實了芍藥苷能夠顯著降低哮喘小鼠模型血清炎癥因子IL-6和TNF-α水平，下調BALF中IgE、CCL19和CCL21水平，降低肺組織中CCR7mRNA以及CCR7、p-IκB和p-p65蛋白表達，因而可能為哮喘防治提供新的有效途徑。

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Inhibitory effect of paeoniflorin on inflammatory chemokines and their receptor in a mouse model of asthma

LIU Jia-qi, ZHAO Zheng-xiao, WEI Ying, XU Fei, ZHANG Hong-ying,LI Mi-hui, LU Lin-wei, WEI Kai, DONG Jing-cheng*

(Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China)

Objective To study the effect of paeoniflorin on inflammatory chemokines and their receptor in a rat model of ovalbumin-induced asthma.Methods Sixty 6-week old SPF female BALB/c mice were used in this study. To establish a mouse model of asthma by sensitizing and challenging with ovalbumin.ELISA was used to analyze the serum IL-6 and TNF-α, and the specific IgE against ovalbumin (OVA-IgE), CCL19 and CCL21 in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). RT-PCR was performed to determine CCR7mRNA and protein expression of chemokine receptor CCR7, and the level of NF-κB was tested by Western blot.ResultsIn In the paeoniflorin groups, the serum IL-6 and TNF-α levels were significantly lower, and the OVA-IgE, CCL19 and CCL21 levels in BALF were significantly reduced, compared with that in the control group.CCR7mRNA and protein expression of chemokine receptor CCR7 and NF-κB in the lung were significantly reduced by paeoniflorin.Conclusions Paeoniflorin has a remarkably inhibitory effect on the airway inflammatory chemokines CCL19/CCL21 and the receptor CCR7 in the mouse model of asthma.

Bronchial asthma; Airway inflammation; Chemokines; Receptor; NF-κB;Paeoniflorin; Mouse

DONG Jing-cheng. E-mail: jcdong2004@126.com

國家自然科學基金資助項目(No.81173390，81403476，81302931)。

劉家齊(1986-)男，博士研究生，研究方向：中西醫(yī)結合哮喘研究。E-mail： erick0720@163.com。

董競成，男，教授，博士生導師，研究方向：中西醫(yī)結合肺病，炎癥性疾病及腫瘤研究。E-mail： jcdong2004@126.com。

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0460-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.004

2016-01-04