萬傳璐，閆一芳，曹羽，王強

(1.安徽大學生命科學學院，合肥 230601； 2.中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室，北京 100101)

?

斑馬魚胚胎胚盾特異表達基因的鑒定

萬傳璐1，閆一芳2，曹羽2，王強2

(1.安徽大學生命科學學院，合肥 230601； 2.中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室，北京 100101)

目的 由于原腸期細胞的劇烈運動，在斑馬魚胚胎的背側(cè)匯聚形成了稱為胚盾(shield organizer)的結(jié)構(gòu)，是胚胎發(fā)育的信號組織中心，在背腹軸建立和胚層誘導過程中具有關鍵作用。系統(tǒng)鑒定在胚盾特異表達的基因，可為進一步探討胚盾形成的機制及其指導胚胎早期發(fā)育的分子機理提供參考。方法Tg(gsc:GFP) 轉(zhuǎn)基因魚在胚盾表達特異的綠色熒光。通過流式細胞分選技術分離富集GFP陽性細胞并提取總RNA進行RNA深度測序，檢測可能在胚盾高水平表達的基因。然后利用熒光實時定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和原位雜交技術鑒定若干在胚盾特異表達的基因。結(jié)果 從Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因魚胚胎中分離富集到了純度超過96%的GFP陽性細胞，RNA深度測序的結(jié)果顯示有657個基因的表達水平比整胚細胞或GFP陰性細胞高2倍以上。最后，確認了KIAA1324、ripply1、twist2、isthmin1、nme4、zgc174153、rrbp1b等7個基因在胚盾特異表達。結(jié)論 系統(tǒng)鑒定到了斑馬魚胚胎胚盾特異表達基因，為下一步研究這些基因的發(fā)育生物學功能奠定了基礎。

斑馬魚；胚盾；流式細胞分選；RNA深度測序；原位雜交

在脊椎動物發(fā)育過程中，原腸期是體軸建立和中內(nèi)胚層形成的重要時期。斑馬魚胚胎進入原腸期后，細胞除了外包運動以外，還要進行內(nèi)卷和匯聚延伸運動。內(nèi)卷發(fā)生在胚盤的邊緣，導致了內(nèi)部細胞層-下胚層的形成。下胚層將會衍生出中胚層和內(nèi)胚層。而外層細胞構(gòu)成上胚層，將來形成外胚層，包括表皮外胚層和神經(jīng)外胚層。在外包和內(nèi)卷的同時，上胚層和下胚層的細胞都向胚胎的背側(cè)匯聚，形成了軀體軸線的原基，也就是所謂的胚盾。它是胚胎背部的標志，是斑馬魚發(fā)育的信號組織中心[1]。在爪蟾、鳥類、魚類、哺乳動物中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似組織中心的存在。組織中心自身可以形成脊索、前脊索板、神經(jīng)底板、背部內(nèi)胚層等中軸組織，同時還可以指導其周圍的細胞分化為體節(jié)、神經(jīng)組織、肝臟、胰腺等，在胚胎早期發(fā)育中具有重要功能。研究表明，斑馬魚胚盾表達并分泌的Bmp信號抑制因子，如chordin、follistatin、noggin等，通過拮抗來自腹部的BMP 信號，使其形成一定的濃度梯度來指導胚胎背腹軸的建立[2-3]。

斑馬魚胚盾的形成與Wnt/β-catenin及Nodal/Smad2信號密切相關(Dale and Jones 1999)。在Wnt信號被激活后，β-catenin進入細胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用[4]。在斑馬魚胚胎發(fā)育至128細胞時，β-catenin就已經(jīng)在背側(cè)細胞的核內(nèi)積聚，這種不對稱分布是胚胎背腹分化的早期標志[5]。在ichabod和tokkaebi斑馬魚突變體中， β-catenin不能在細胞核內(nèi)積聚，導致胚盾不能形成，胚胎產(chǎn)生腹部化的表型[6-7]。最近的研究表明，母源性wnt8a的表達是β-catenin入核，指導胚盾形成的至關重要的因素[8]。在囊胚中期，β-catenin開始激活bozozok、chordin、dkk1、sqt、cyc等合子基因表達[1]。其中，Sqt和Cyc是激活Nodal/Smad2信號通路的配體蛋白[9]。

Nodal信號分子為TGF-β家族一員。在Nodal信號通路中，Nodal配體與I型受體ALK4(ActRIB)或者ALK7，以及II型受體ActRIIA或者ActRIIB結(jié)合形成復合體，使得I型受體被激活的II型受體磷酸化?；罨腎型受體募集并磷酸化Smad2，從而導致其與Smad4結(jié)合形成復合體。Smad復合體可以進入細胞核中，并且與FoxH1或者Mixer等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，共同調(diào)節(jié)目標基因的轉(zhuǎn)錄[10-12]。Nodal/Smad2信號不但對于中內(nèi)胚層的誘導是至關重要的，而且在中內(nèi)胚層的背腹分化過程中也是必不可少的。在Nodal與I型、II型受體形成復合物的過程中，有一類非常關鍵的輔助受體EGF-CFC家族蛋白Oep(One-eyed pinhead)是必需的[13]。斑馬魚MZoep突變體胚胎，缺少母源和合子期表達的Oep，不能形成胚盾，而且絕大部分的中胚層和全部內(nèi)胚層缺失[14,15]。sqt;cyc雙突變體胚胎也有類似表型[16]。

在胚胎發(fā)育過程中，基因的組織特異性表達通常意味著此基因可能在該組織形成時期發(fā)揮重要作用。Wnt和Nodal信號通路雖然對于胚盾的形成非常重要，但它們在原腸期的調(diào)控機制還不清楚。本文鑒定到的斑馬魚胚盾特異表達的基因，將為深入探討它們與Wnt和Nodal信號活性的關系及在體軸建立和中內(nèi)胚層形成中的功能提供有意義的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗中所用到的野生型斑馬魚為Tuebingen品系。Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚購自斑馬魚國際資源中心(ZL820, Zebrafish International Resource Center)。胚胎在Holtfreter 液(0.05 g/L KCl, 0.1 g/L CaCl2, 0.2 g/L NaHCO3, 3.5 g/L NaCl, pH 值為7.0)中28.5℃培養(yǎng)至所需時期。

1.2 GFP陽性細胞的分離富集

Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎生長至胚盾期時收集胚胎，脫卵膜，然后無Ca2+的Ringer緩沖液(116 mmol/L NaCl, 2.9 mmol/L KCl, 5 mmol/L HEPES, pH 7.2)室溫浸泡15 min。去除Ringer緩沖液，加入蛋白酶處理液(含有0.25% trypsin及 1 mmol/L EDTA的PBS緩沖液)28.5℃孵育，期間不時用200 μL的槍頭吹打胚胎，直至鏡下觀察大部分胚胎已分散為單個細胞。隨后加入1 mol/L的CaCl2(終濃度為2 mmol/L)和胎牛血清(終濃度為10%)終止反應。離心去上清，用含1%胎牛血清的無酚紅L-15培養(yǎng)基將細胞重懸至細胞密度為每毫升107。最后通過MoFlo XDP 高速多色流式細胞分選儀進行GFP陽性細胞的分選并分析細胞純度。

1.3 RNA提取及深度測序

分選到的GFP陽性細胞(50萬左右)用Trizol(15596-026, Invitrogen)一步法提取總RNA 約2 μg，送至上海生物芯片有限公司進行深度測序。

1.4 半定量RT-PCR(Semi-quantitative Reverse Transcription PCR)

每種樣品以1 μg總RNA為底物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(F0921K，TOYOBO)制備斑馬魚胚胎cDNA，然后對樣品中的目的基因進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。樣品中的β-actin基因的表達做為內(nèi)部參照。gsc基因引物為： F，5’-GAGACGACACCGAACCATTT-3’；R, 5’-CCTCTGACGACGACCTTTTC-3’。boz基因引物為： F，5’-ATACTCACGCAGCTTTTGGG-3’；R，5’-GACTTACTATGCAGGGCAACC-3’。chd基因引物為： F，5’- TAGACTGCTGTAAGGAGTGTCCTC-3’；R，5’- CCATGAAGTCCTCTATGCATTCCG-3’。內(nèi)參β-actin基因引物為： F，5’- ATGGATGATGAAATTGCCGCAC-3’；R，5’-ACCATCACCAGAGTCCATCACG-3’。

1.5 熒光實時定量PCR

以各樣品cDNA為模板，利用SYBR? Premix Ex Taq II (RR820A, Takara)試劑盒，按照說明書在CFX96 PCR儀(Bio-Rad)中進行熒光實時定量PCR。β-actin基因的表達做為樣品內(nèi)部參照，gsc和chd基因做為陽性對照。這些基因的引物序列同上。icn基因引物為： F，5’-ATGGCTACGTCAGATACCCAGAAAG-3’；R, 5’-GCAAAGCATTGTGATACAGGCA-3’。ihha基因引物為： F，5’-AAGCAGCAGGACAGCACGGACG-3’；R, 5’-ATCCAGTGAA GCAATGAGGAATACC-3’。frzb基因引物為： F，5’-TACCAAGACCCTGCGAAATGTAACC-3’；R, 5’-GAGGGATGTTGACCAGAGATGACTT-3’。slit3基因引物為： F，5’-AGGCTTGTTCGCTCCTCTGC-3’；R, 5’-GAAACTTCTTGCCCTTGACCTG-3’。ednra基因引物為： F，5’-GCATCGTGTTTGTGGTGGGAATAG-3’；R, 5’-TTGAGCACTGTAATCCCAACAGACG-3’。

1.6 原位雜交

相應探針的制備及原位雜交實驗操作參見孟亞平等的文章[17]。

2 結(jié)果

2.1Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎適合于分離富集胚盾中胚層細胞

goosecoid(gsc) 基因特異表達于斑馬魚原腸期胚胎的胚盾區(qū)域，是常用的背側(cè)中胚層標識基因。由1.8 kbgsc啟動子驅(qū)動表達GFP的Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，GFP具有與內(nèi)源gsc基因相似的時空表達[18]。為了確定適合分離富集胚盾中胚層細胞的發(fā)育時期，我們從受精后單細胞期至胚盾期，詳細觀測了活體Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎GFP的表達圖式。結(jié)果表明，在Sphere期及Sphere期之前沒有檢測到綠色熒光表達(圖1 A至E’)，30%外包期的Tg(gsc:GFP)斑馬魚胚胎在預定背部中胚層有可觀測到微弱的綠色熒光表達(圖1F和F’)，而生長至胚盾期，背部中胚層的熒光變得比較明亮(圖1G至H’)。鑒于此時期的背部組織比較典型，而且有較為明亮的特異熒光表達，胚盾期的Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎適合于分離富集背部信號組織中心的細胞。

2.2 流式細胞分選獲得高純度的GFP陽性細胞

確定在胚盾期從Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎分離GFP陽性細胞后，我們分批收集胚盾期胚胎，使用胰蛋白酶將胚胎消化吹散為單個細胞，最后通過流式細胞儀進行分選富集。圖2A的結(jié)果表明背部中胚層GFP陽性細胞數(shù)目僅為整個胚胎細胞數(shù)的3%左右。進一步的純度分析表明，分選到的細胞GFP陽性率超過了96%。chordin(chd)和bozozok(boz)是除gsc外另外兩個已知的胚盾特異表達基因。我們對這三個基因在GFP陽性細胞、GFP陰性細胞和來自于野生型胚胎未進行分選的細胞的表達進行了檢測。半定量RT-PCR的結(jié)果揭示，gsc、boz和chd在GFP陽性細胞中的表達明顯高于GFP陰性細胞及未進行分選富集的細胞，表明我們分選到的GFP陽性細胞確實為胚胎的胚盾細胞。

注：A～H，相應時期明場照片；E’～H’，相應時期暗場熒光照片。A～D為側(cè)面觀，動物極向上，E～H’為背部觀。A，1細胞期；B，4細胞期；C，8細胞期；D，1000細胞期；E，Sphere期；F，30%外包期；G，50%外包期；H，胚盾期； Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎在30%外包期開始在預定胚盾區(qū)域有微弱的熒光表達，胚盾期有比較明亮的特異表達的熒光。圖1 Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎GFP熒光的時空表達譜Note. A, 1-cell stage; B, 4-cell stage; C, 8-cell stage; D 1000-cell stage; E and E’, Shere stage; F and F’, 30% epiboly stage; G and G’, 50% epiboly stage; H and H’, Shield stage. A to H, bright-field images of living Tg(gsc:GFP) transgenic zebrafish embryos at indicated stages. E‘ to H’, fluorescence images of embryos in panels E to H. Embryos in panels A to D were shown in lateral views with the animal pole at the top, while embryos in panels E to H’ were shown in dorsal views. Note that the expression of GFP is detectable in the pre-organizer region of 30% epiboly Tg(gsc:GFP) embryos, but becomes much stronger in the dorsal mesoderm at shield stage.Fig.1 The spatiotemporal expression pattern of GFP in Tg(gsc:GFP) transgenic zebrafish embryos.

注：A，通過流式細胞儀從胚盾期Tg(gsc:GFP)胚胎分離GFP陽性細胞。B，流式細胞儀分析富集到的GFP陽性細胞的純度。C，不同循環(huán)數(shù)的半定量RT-PCR實驗檢測gsc、boz和chd在GFP陽性細胞、GFP陰性細胞及未進行分選的細胞中的表達。圖2 斑馬魚胚胎胚盾細胞的分離富集Note. A: Cells expressing GFP were isolated from enzymatically dispersed Tg(gsc:GFP) embryos. B: The purity of isolated GFP-positive cells was analyzed by FACS. C: The expression of gsc, boz and chd in isolated or non-isolated cells was examined by semi-quantitative RT-PCR at different cycle numbers.Fig.2 Separation and enrichment of cells located in the zebrafish shield organizer.

2.3 系統(tǒng)鑒定胚盾高表達基因

為了鑒定在斑馬魚胚胎的胚盾高表達的基因，我們從GFP陽性(GFP+)細胞、GFP陰性細胞(GFP-)和未進行分選富集的野生型胚胎細胞(WT)提取總RNA，然后進行了深度測序。每個樣品的測序通量均為4G。結(jié)果表明，在GFP陽性細胞中，有928個基因的轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)比GFP陰性細胞高2倍以上，而與未分選的野生型胚胎細胞相比，有2004個基因有高表達(2倍以上)(圖3A)。以GFP陰性細胞和未分選的野生型胚胎細胞做為對照，共有657個基因高表達于GFP陽性細胞中(2倍以上)(圖3A和3B)。這657個基因中有許多以前報導過的在胚盾特異表達的基因，如gsc、boz、chd、floatinghead(flh)、net1、dickkopfWNTsignalingpathwayinhibitor1b(dkk1b)、sonichedgehoga(shha)等。圖3C中列出了在GFP陽性細胞中富集度最高的前20個基因。目前并不清楚這些基因的是否特異表達于胚盾，大部分基因的發(fā)育生物學功能也未見報導。為了進一步確認這20個基因是否在胚盾高表達，我們從中隨意挑取了5個基因。通過qRT-PCR進行驗證。結(jié)果顯示，和陽性對照(gsc和boz)類似，ictacalcin(icn)、indianhedgehoghomologa(ihha)、frizzled-relatedprotein(frzb)、slithomolog3 (slit3)和endothelinreceptortypeA(ednra)均在GFP陽性細胞中有顯著的富集(圖3C)。以上結(jié)果表明，在斑馬魚胚盾有高水平表達的基因得到了系統(tǒng)的鑒定。

注：A，分別以GFP陰性細胞和未分選的野生型胚胎細胞為對照，在GFP陽性細胞中高表達的基因數(shù)目(2倍以上)。與GFP陰性細胞相比較，有928個基因在GFP陽性細胞中高表達(紅色區(qū)域)；與未分選的野生型胚胎細胞相比較，有2004個基因在GFP陽性細胞中高表達(紫色區(qū)域)；與兩種對照相比較，在GFP陽性細胞中高表達的基因有657個(代表紅色與紫色重疊的黃色區(qū)域)。B，657個基因的紅綠熱圖。C，在GFP陽性細胞中富集度最高的前20個基因。基因表達的差異根據(jù)RNA測序結(jié)果的RPKM (Reads Per Kilobases per Millionreads)確定。 D，以gsc和boz的表達為陽性對照，qRT-PCR檢測icn、ihha、frzb、slit3和ednra在GFP陽性細胞、GFP陰性細胞及未進行分選的野生型細胞中的表達差異。β-actin的表達做為樣品的內(nèi)部參照。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n=3。圖3 系統(tǒng)鑒定斑馬魚胚胎胚盾高表達基因Note. A, The number of organizer highly expressed genes (more than 2-fold) in GFP+ cells when compared to GFP-cells (red) or non-isolated cells (purple) or both (yellow). B, Heat map of 657 genes which are highly expressed in GFP+ cells but transcribed at a relatively low level in GFP- cells and non-isolated cells. C, The top 20 enriched genes in GFP+ cells according to RPKM values. D, The expression differences of icn, ihha, frzb、slit3 and ednrathese in GFP+, GFP- and non-isolated cells were validated by qRT-PCR analysis. The expression of gsc and boz was examined as positive control. The expression of β-actin was used as a reference to normalize the amount of mRNAs in each sample. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; n =3. Fig.3 Global identification of zebrafish shield organizer expressed genes.

2.4 原位雜交確定胚盾特異表達的基因

整胚原位雜交是研究胚胎基因表達的常用方法，可以給出特定基因在胚胎發(fā)育過程中的時空表達圖譜，在發(fā)育生物學研究中起著重要作用。為了最終確定在胚盾特異表達的基因，我們在上述657個基因之中，檢測了一些可能具有重要發(fā)育生物學功能的基因在斑馬魚胚胎中的表達圖譜。結(jié)果表明，KIAA1324、transcriptionalrepressor1 (ripply1)、twist2、isthmin1、nucleosidediphosphatekinase4 (nme4)、zgc174153和ribosomebindingprotein1homologb(rrbp1b)均在斑馬魚胚胎的胚盾區(qū)有高水平表達(圖4A至G’)，其中KIAA1324(圖4A和A’)、ripply1(圖4B和B’)、nme4(圖4E)和rrbp1b(圖4G)非常特異的表達于胚盾。我們還進一步檢測了rrbp1b在尾芽期(bud stage)的表達，發(fā)現(xiàn)rrbp1b轉(zhuǎn)錄本特異表達于脊索(圖4G’)。脊索由來自胚盾區(qū)域的中胚層發(fā)育而來，因此，這一結(jié)果進一步證實了rrbp1b在胚盾的特異表達。我們還發(fā)現(xiàn)，twist2(圖4C和C’)、isthmin1(圖4D和D’)及zgc174153(圖4F)除了在胚盾有高水平表達，還表達于胚盤邊緣的中內(nèi)胚層細胞所在區(qū)域。

注：A，KIAA1324；B，ripply1；C，twist2；D，isthmin1；E，nme4；F，zgc174153；G，rrbp1b。A，B，C，D，E, F和G是側(cè)面觀，胚盾在右側(cè)；A’，B’，C‘和D’是相應基因的動物極，從上向下觀測；G’是rrbp1b在尾芽期的表達，背部觀。圖4 原位雜交鑒定到的數(shù)個代表性基因在斑馬魚胚胎胚盾的特異表達Note. A, KIAA1324; B, ripply1; C, twist2; D, isthmin1; E, nme4; F, zgc174153; G, rrbp1b. A, B, C, D, E, F and G, shield-stage embryos were shown in lateral views with the animal pole at the top; A’, B’, C‘ and D’, animal poles in veryical views with the dorsal to the right. G’, The expression of rrbp1b in bud-stage embryo. Dorsal view with head at the top.Fig.4 The organizer expressed genes were identified by whole mount in situ hybridization.

3 討論

在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中，Wnt和Nodal信號是兩種重要的形態(tài)發(fā)生素，參與了背部信號組織中心的形成和體軸的建立等重要的發(fā)育事件的調(diào)控。為了探討Nodal信號通路如何在斑馬魚胚胎中行使其發(fā)育功能，包括我們在內(nèi)的研究者已經(jīng)通過各種辦法探討了它們在胚胎早期發(fā)育所調(diào)控的基因。例如，利用斑馬魚基因芯片技術，檢測sqt過量表達的胚胎、缺失Nodal 信號的MZoep突變體或野生型胚胎中差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)了近2000個基因的表達受到Nodal信號調(diào)控[19]。通過類似的策略，輔助以原位雜交技術，有近百個表達于胚胎胚盾或胚盤邊緣區(qū)域的Nodal信號調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)[20]。通過ChIP-chip技術，我們發(fā)現(xiàn)在原腸胚早期，Smad2可以結(jié)合在679個基因的啟動子或增強子區(qū)，調(diào)控其表達[21]。然而，Wnt信號在胚胎早期發(fā)育中所調(diào)控的基因還不清楚。本研究通過分離富集Tg(gsc:GFP)轉(zhuǎn)基因魚胚盾細胞，系統(tǒng)鑒定了在胚盾特異表達的基因，為研究這些基因的發(fā)育生物學功能提供了基礎。但是，這些胚盾高表達基因是否受到Nodal或Wnt信號調(diào)控，它們是否會形成反饋機制調(diào)控Nodal或Wnt信號活性等重要的科學問題還有待于進一步探討。

本研究通過原位雜交技術鑒定確認了KIAA1324，ripply1，twist2，isthmin1，nme4，zgc174153，rrbp1b等7個基因在胚盾高表達。其中KIAA1324、ripply1、nme4和rrbp1b非常特異的表達于胚盾，而twist2、isthmin1和zgc174153除了在胚盾有高水平表達，還表達于胚盤邊緣的中內(nèi)胚層細胞，說明它們也可能是潛在的中內(nèi)胚層形成調(diào)控基因。鑒于我們只是隨機對很小比例的基因進行了原位雜交檢測，可能在我們鑒定到的657個基因中，還有很多胚盾特異表達的基因有待于使用同樣的方法進一步確定。

[1] Schier AF, Talbot WS. Molecular genetics of axis formation in zebrafish [J]. Annu Rev Genet, 2005, 39: 561-613.

[2] Schulte-Merker S, Lee KJ, McMahon AP, et al. The zebrafish organizer requires chordino [J]. Nature, 1997, 387: 862-863.

[3] Wagner DS, Mullins MC. Modulation of BMP activity in dorsal-ventral pattern formation by the chordin and ogon antagonists [J]. Dev Biol, 2002, 245: 109-123.

[4] Logan CY, Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease [J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2004, 20: 781-810.

[5] Schneider S, Steinbeisser H, Warga RM, et al. Beta-catenin translocation into nuclei demarcates the dorsalizing centers in frog and fish embryos [J]. Mech Dev, 1996, 57: 191-198.

[6] Kelly C, Chin AJ, Leatherman JL, et al. Maternally controlled (beta)-catenin-mediated signaling is required for organizer formation in the zebrafish [J]. Development, 2000, 127: 3899-3911.

[7] Nojima H, Shimizu T, Kim CH, et al. Genetic evidence for involvement of maternally derived Wnt canonical signaling in dorsal determination in zebrafish [J]. Mech Dev, 2004, 121: 371-386.

[8] Lu FI, Thisse C, Thisse B. Identification and mechanism of regulation of the zebrafish dorsal determinant [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108: 15876-15880.

[9] Schier AF. Nodal signaling in vertebrate development [J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2003, 19: 589-621.

[10] Reissmann E, Jornvall H, Blokzijl A, et al. The orphan receptor ALK7 and the Activin receptor ALK4 mediate signaling by Nodal proteins during vertebrate development [J]. Genes Dev, 2001, 15: 2010-2022.

[11] Yeo C, Whitman M. Nodal signals to Smads through Cripto-dependent and Cripto-independent mechanisms [J]. Mol Cell, 2001, 7: 949-957.

[12] Liu F. Smad3 phosphorylation by cyclin-dependent kinases [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2006, 17: 9-17.

[13] Shen MM, Schier AF. The EGF-CFC gene family in vertebrate development [J]. Trends Genet, 2000, 16: 303-309.

[14] Zhang J, Talbot WS, Schier AF. Positional cloning identifies zebrafish one-eyed pinhead as a permissive EGF-related ligand required during gastrulation [J]. Cell, 1998, 92: 241-251.

[15] Gritsman K, Zhang J, Cheng S, et al. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling [J]. Cell, 1999, 97: 121-132.

[16] Feldman B, Gates, MA, Egan, ES, et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals [J]. Nature, 1998, 395: 181-185.

[17] 孟亞平，劉春業(yè)，石德利. ripply1在斑馬魚早期胚胎背腹發(fā)育中的作用 [J]. 中國實驗動物學報, 2015, 23(5): 446-452.

[18] Dumortier JG, Martin S, Meyer D, et al. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109: 16945-16950.

[19] 孫智慧，孟安明. 斑馬魚胚胎中受Nodal 信號調(diào)控基因的鑒定 [J]. 生物化學與生物物理進展, 2007, 34(6): 595-603.

[20] Bennett JT, Joubin K, Cheng S, et al. Nodal signaling activates differentiation genes during zebrafish gastrulation [J]. Dev Biol, 2007, 304: 525-540.

[21] Liu Z, Lin X, Cai Z, et al. Global identification of SMAD2 target genes reveals a role for multiple co-regulatory factors in zebrafish early gastrulas [J]. J Biol Chem, 2011, 286: 28520-28532.

Identification of zebrafish shield organizer-specific genes

WAN Chuan-lu1，YAN Yi-fang2，CAO Yu2，WANG Qiang2

(1. School of Life Science, Anhui University, Hefei, 230601, China; 2. State Key Laboratory of Membrane Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101)

Objective During zebrafish gastrulation, dramatic movements rearrange cells into three germ layers and contribute to the formation of the shield organizer, which acts as a dorsal signal center to pattern the body axis. Global identification of shield organizer-specific genes in early gastrulas will be valuable for studying the regulatory cascades during organizer formation and body axis establishment. MethodsTg(gsc:GFP) transgenic embryos express GFP in the shield organizer, which is controlled by a 1.8 kbgscpromoter. Flow cytometry technology and RNA deep sequencing analysis were applied to isolate GFP positive cells from theTg(gsc:GFP) transgenic embryos and systematically uncover the genes highly expressed in the dorsal organizer. Subsequently, the expression of shield organizer-specific genes was further confirmed by quantitative real-time PCR and whole mountinsituhybridization method during zebrafish embryonic development. Results GFP-positive cells exceeding 96% purity were isolated from shield-stageTg(gsc:GFP) transgenic embryos and 657 organizer highly expressed genes were identified through RNA deep sequencing analysis. The results ofinsituhybridization experiments revealed that a number of genes includingKIAA1324,ripply1,twist2,isthmin1,nme4,zgc174153 andrrbp1bwere expressed in shield organizer during zebrafish gastrulation. Conclusions The identification of these shield organizer-specific genes in the current study provides useful clues to explore the zebrafish developmental functions in further studies.

Zebrafish; Shield organizer; FACS; RNA deep sequencing;insituhybridization

WANG Qiang. E-mail: qiangwang@ioz.ac.cn

國家自然科學基金面上項目(No. 31271532)；優(yōu)秀青年科學基金項目(No.31322035)資助。

萬傳璐(1988-)，男，碩士研究生， 研究方向： 發(fā)育生物學。Email: w.chl.chzhz@163.com

王強(1975-)，男，研究員，博士生導師，主要從事發(fā)育信號轉(zhuǎn)導的研究。Email: qiangwang@ioz.ac.cn

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0441-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.001

2016-03-14