師忠芳，徐立新，盧易，董麗萍，閆旭，楊少華,3，袁芳*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué) 北京市神經(jīng)外科研究所，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050；3. 北德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)與藥理系，美國德克薩斯州沃思堡 76107)

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比較谷氨酸引起兩品種大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹的差異

師忠芳1，徐立新1，盧易2，董麗萍1，閆旭1，楊少華1,3，袁芳1*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué) 北京市神經(jīng)外科研究所，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050；3. 北德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)與藥理系，美國德克薩斯州沃思堡 76107)

目的 比較Wistar大鼠及SD大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)對谷氨酸所致細(xì)胞腫脹的差異。方法 利用新生1 d的Wistar大鼠和SD大鼠進(jìn)行AST原代及傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)10 d分別給予1、10 mmol/L谷氨酸孵育48 h，通過乳酸脫氫酶釋放率檢測細(xì)胞活性，通過膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色、Image Pro Plus軟件測量細(xì)胞周長表示細(xì)胞體積變化，通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測水通道蛋白4(AQP4) mRNA表達(dá)變化。結(jié)果 谷氨酸對不同品種大鼠AST活性影響沒有差異(P>0.05)。在正常情況下，Wistar大鼠AST周長小于SD大鼠，在給予谷氨酸處理后，均明顯大于SD大鼠(P<0.05)。在給予1 mmol/L谷氨酸后，Wistar大鼠AST的AQP4 mRNA表達(dá)明顯高于SD大鼠(P<0.05)。結(jié)論 Wistar大鼠AST對谷氨酸所致細(xì)胞腫脹較SD大鼠明顯，且谷氨酸對兩品種大鼠AST上AQP4表達(dá)變化的影響存在差異。

谷氨酸；星形膠質(zhì)細(xì)胞；水通道蛋白4；大鼠

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性氨基酸，對神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持起重要作用。缺血性腦損傷時(shí)，腦內(nèi)谷氨酸濃度增高，產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性作用，加重腦損傷，引起腦水腫[1]。研究表明腦水腫主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AST)腫脹，谷氨酸增加能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹[2,3]。大量研究顯示，水通道蛋白4(aquaporin 4, AQP4)參與缺血性腦損傷后腦水腫的發(fā)生發(fā)展[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸能引起培養(yǎng)AST腫脹和AQP4表達(dá)變化[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠及Sprague-Dawley (SD)大鼠在缺血性腦損傷所致腦梗死體積，病變區(qū)域的腦血流量及表觀彌散系數(shù)變化之間存在差別[6,7]，但是不同品種大鼠AST對谷氨酸所致細(xì)胞腫脹是否存在差異不清楚，因此本研究觀察谷氨酸所致的Wistar大鼠及SD 大鼠培養(yǎng)AST體積及AQP4表達(dá)變化是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級新生1 d的雄性Wistar大鼠和SD大鼠各27只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍)2012-0004]。在北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物室屏障環(huán)境 【SYXK(京)2013-0009】進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，并通過北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物福利倫理審查(編號No.201401007)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

最低必需培養(yǎng)基(minimum essential medium, MEM) (Gibco)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (Gibco)、胰蛋白酶(Merck)、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多克隆抗體(Dako)、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗 (Molecular Probes)、含4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的熒光封片劑(中杉金橋)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)比色測定法試劑盒(普利萊)、TRIzol試劑(Life Technologies)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)、SYBR Green I 核酸染料試劑盒(Roche)、L-谷氨酸鈉(國藥集團(tuán))。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、熒光倒置相差顯微鏡(Zeiss)、多功能酶標(biāo)儀(Tecan)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠AST原代培養(yǎng)參考McCarthy的方法并加以改良[3]，無菌條件下，取新生1 d 的Wistar和SD雄性乳鼠大腦皮層組織，將其切割成約1 mm3小塊，吹打過濾后，接種于含10%FBS的MEM培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。每3～4 d換液1次。原代培養(yǎng)約10 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)過大約10 d，GFAP免疫細(xì)胞熒光染色鑒定培養(yǎng)細(xì)胞純度，之后將培養(yǎng)液分別更換為含有1、10 mmol/L 的L-谷氨酸鈉的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅更換新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2 GFAP免疫熒光染色及細(xì)胞周長測定

根據(jù)我們已發(fā)表文獻(xiàn)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[8]：培養(yǎng)細(xì)胞丙酮固定30 min，正常羊血清封閉15 min，加入兔抗大鼠GFAP抗體(1∶50)，陰性對照用PBS代替一抗，4℃過夜。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG (1∶100)避光孵育3 h，含DAPI的熒光封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。利用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對細(xì)胞周長進(jìn)行測定，每孔細(xì)胞隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)10個(gè)細(xì)胞的周長，其均數(shù)代表該視野細(xì)胞周長測量結(jié)果，每組測量3孔細(xì)胞。

1.2.3 LDH釋放率檢測細(xì)胞活性

分別在1、10 mmol/L谷氨酸孵育48 h后取培養(yǎng)基上清5 μL(細(xì)胞外)，接著將細(xì)胞及培養(yǎng)上清于-80℃冰箱中反復(fù)凍融兩次后，從培養(yǎng)板中取5 μL裂解液(細(xì)胞內(nèi)外)，之后按照LDH試劑盒說明操作，用多功能酶標(biāo)儀于440 nm波長處測定LDH含量。計(jì)算LDH釋放率，LDH釋放率=(細(xì)胞外LDH活力單位/細(xì)胞內(nèi)外總LDH活力單位) × 100%。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR)法檢測AQP4 mRNA表達(dá)

根據(jù)我們已發(fā)表文獻(xiàn)的方法[9]：使用TRIzol試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后利用SYBR Green方法進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。按照GenBank大鼠AQP4(NM012825.4)序列、β-actin (NM031144.3)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，AQP4上游：5’-TGAATCCAGCTCGATCCTTTG-3’，下游：5’-TATCCAGTGGTTTTCCCAGTTTC-3’； β-actin上游：5’-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3’，下游5’-CTAGGAGCCAGAGCAGTAATC-3’，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系包括：AQP4或β-actin上游引物和下游引物各1 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水7 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。熒光信號用LightCycler480 SW1.5軟件進(jìn)行分析，用AQP4/β-actin來表示AQP4 mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體外培養(yǎng)AST鑒定

GFAP細(xì)胞免疫熒光染色顯示，不同品種大鼠體外培養(yǎng)AST均呈現(xiàn)大致均一的單層扁平細(xì)胞，具有短而粗大的細(xì)胞突起，培養(yǎng)細(xì)胞95%以上為GFAP免疫熒光染色陽性細(xì)胞?？梢悦黠@看出Wistar大鼠AST小于SD大鼠，見圖1。

圖1 Wistar與SD大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP免疫熒光染色(×200)Fig.1 Immunofluorescence staining for GFAP in the cultured astrocytes of Wistar and SD rats

2.2 細(xì)胞活性變化

谷氨酸對Wistar大鼠AST的LDH釋放率沒有影響(P>0.05)。1 mmol/L谷氨酸不引起SD大鼠AST的LDH釋放率變化(P>0.05)，而10 mmol/L谷氨酸能引起細(xì)胞LDH釋放率增加(P<0.05)。 但是Wistar大鼠與SD大鼠AST的LDH釋放率在給予1、10 mmol/L谷氨酸后的差異均無顯著性(P>0.05)，提示谷氨酸對不同品種大鼠AST活性的影響沒有差異，見圖2A。

2.3 細(xì)胞周長變化

已有研究提示細(xì)胞周長比細(xì)胞直徑能更加精確地反映細(xì)胞體積的變化[10]，因此本研究應(yīng)用細(xì)胞周長變化來代表細(xì)胞體積的變化。細(xì)胞周長測量結(jié)果顯示，未給予谷氨酸處理情況下Wistar大鼠AST周長比SD大鼠周長少20% (P<0.05)，給予谷氨酸處理48 h后，Wistar大鼠和SD大鼠的AST周長均增加 (P<0.05)，并且1及10 mmol/L谷氨酸處理后，Wistar大鼠AST周長增加均大于SD大鼠(P<0.05)，分別多20%和60%，見圖2B、圖3。

注：A：細(xì)胞活性； B：細(xì)胞周長； C：AQP4表達(dá)。與0 mmol/L谷氨酸組比較，*P<0.05 差異有顯著性；與SD大鼠比較，#P<0.05 差異有顯著性。圖2 谷氨酸引起Wistar與SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性、周長及水通道蛋白4表達(dá)變化的比較±s)Note. A: Cell viability; B: Cell perimeter; C: AQP4 mRNA expression.*P<0.05, compared with the 0 mmol/L glutamate group; #P<0.05, compared with the SD rats.Fig.2 Comparison of the effect of glutamate on cultured astrocytes of the Wistar and SD rats

圖3 谷氨酸孵育后Wistar與SD大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP免疫熒光染色(×200)Fig.3 Immunofluorescence staining for GFAP in cultured astrocytes of the Wistar and SD rats after incubation wih glutamate

2.4 AQP4表達(dá)變化

RT-qPCR結(jié)果顯示，未給予谷氨酸處理組不同品種大鼠AST上AQP4表達(dá)沒有差異(P>0.05)。 給予谷氨酸孵育48 h后，Wistar大鼠和SD大鼠AQP4 mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)，但兩品種的變化規(guī)律不同。在Wistar大鼠，1 mmol/L谷氨酸引起AQP4表達(dá)增加，10 mmol/L谷氨酸導(dǎo)致AQP4表達(dá)降低(P<0.05)，但仍高于對照組。在SD大鼠，谷氨酸可引起AQP4表達(dá)持續(xù)增加(P<0.05)。Wistar大鼠與SD大鼠比較，1 mmol/L谷氨酸引起Wistar大鼠的AQP4表達(dá)水平是SD大鼠的230% (P<0.05)， 而10 mmol/L谷氨酸引起的AQP4表達(dá)變化兩者沒有明顯差異(P>0.05)，見圖2C。

3 討論

已有的研究表明在大鼠整體腦缺血模型中Wistar大鼠和SD大鼠的腦梗死體積及模型穩(wěn)定性存在差異[6]，本研究我們首次利用體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞比較了谷氨酸所致細(xì)胞腫脹Wistar大鼠和SD大鼠的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酸引起的細(xì)胞體積變化Wistar大鼠比SD大鼠更加顯著，并且AQP4表達(dá)變化規(guī)律不同。

Wistar大鼠與SD大鼠都是白色封閉群大鼠，SD大鼠是由封閉群Wistar大鼠培育而成。Wistar大鼠是1907年由美國費(fèi)城Wistar研究所動(dòng)物室培育，該品種大鼠頭部較寬，耳朵較長，尾的長度小于身長；SD大鼠是1925年由美國SD農(nóng)場用Wistar大鼠培育而成，該品種大鼠頭部狹長，尾長接近于身長，生長發(fā)育較Wistar快。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，不同品種大鼠培養(yǎng)AST形態(tài)大致相同，但Wistar大鼠AST體積明顯小于SD大鼠，同時(shí)，通過細(xì)胞周長的測量我們發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠AST周長比SD大鼠小約20%，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大體動(dòng)物的發(fā)現(xiàn)是相似的。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)谷氨酸可以引起Wistar大鼠和SD大鼠體外培養(yǎng)AST體積增加，而且Wistar大鼠來源AST體積增加更加顯著，提示谷氨酸引起的Wistar大鼠細(xì)胞腫脹較SD大鼠明顯。Walberer等[11]研究發(fā)現(xiàn)，永久性大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型能導(dǎo)致Wistar大鼠比SD大鼠出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦水腫，我們的研究結(jié)果可以解釋這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。許多研究顯示W(wǎng)istar大鼠與SD大鼠對不同刺激及藥物的敏感程度在有些方面存在很大差異[12]，朱英標(biāo)等[13]研究發(fā)現(xiàn)與Wistar大鼠相比，SD大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病潛伏期較長，神經(jīng)癥狀較嚴(yán)重，總體中樞炎癥改變較為嚴(yán)重；O’Malley等[14]研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激暴露能導(dǎo)致SD大鼠下丘腦細(xì)胞外信號激酶磷酸化水平增加及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子增加，而Wistar大鼠沒有此改變。王克柱等[15]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典條件反射階段SD大鼠對飲水盒的探索能力強(qiáng)，而在獎(jiǎng)勵(lì)性操作條件反射階段Wistar大鼠的操作能力優(yōu)于SD大鼠，這些研究充分表明Wistar大鼠與SD大鼠對相同刺激的反應(yīng)存在差別，我們的研究也說明谷氨酸引起的Wistar大鼠AST細(xì)胞腫脹程度大于SD大鼠。

AQP4是CNS含量最多的水通道蛋白，主要表達(dá)于AST足突處的細(xì)胞膜上，參與腦內(nèi)水平衡等生理功能，病理情況下參與各種腦疾病包括缺血性腦損傷等所致腦水腫的形成與消散[16，17]。Tang等[18]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)AST缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞腫脹與AQP4表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸長時(shí)間作用可以引起AST上AQP4表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[5]。 在本研究中我們觀察到谷氨酸引起Wistar大鼠與SD大鼠AST上AQP4表達(dá)增高， Wistar大鼠AST在給予1 mmol/L谷氨酸孵育后AQP4表達(dá)量比SD大鼠高130%，同時(shí)顯示出比SD 大鼠更加明顯的細(xì)胞腫脹，推測谷氨酸孵育后Wistar大鼠AST較SD大鼠細(xì)胞更加腫脹可能與其AQP4表達(dá)量的顯著增加有關(guān)。研究表明AQP4表達(dá)受蛋白間的相互作用、蛋白激酶C磷酸化、轉(zhuǎn)錄因子活化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等多種因素的調(diào)節(jié)，我們的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶可能參與培養(yǎng)AST劃痕損傷后AQP4表達(dá)調(diào)節(jié)[8]，另有研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注損傷后梗死核心區(qū)及半暗帶巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α表達(dá)增加[19]，同時(shí)會激活Wnt7a信號通路[20]。谷氨酸所致AST上AQP4表達(dá)變化引起細(xì)胞腫脹的信號通路分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

研究表明在腦內(nèi)除了有大量AQP4表達(dá)外，還有AQP1、3、5、8、9、12等的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 mmol/L谷氨酸引起Wistar大鼠AST較SD大鼠細(xì)胞更加腫脹，但AQP4表達(dá)卻不高。分析其原因可能是較高濃度的谷氨酸作用AST時(shí)，有其他水通道蛋白參與細(xì)胞腫脹的調(diào)節(jié)。有研究報(bào)道稱AQP1及AQP9在各種腦疾病及急性腦損傷所致腦水腫的形成消散中其重要作用[4]。不同品種大鼠AST對谷氨酸引起的腫脹敏感程度不同除了AQP4以外是否還有其他水通道蛋白如AQP1、AQP9等參與也有待于進(jìn)一步探討。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，谷氨酸引起Wistar大鼠體外培養(yǎng)AST腫脹比SD大鼠更加嚴(yán)重，可能與谷氨酸引起不同品種大鼠AST上AQP4表達(dá)差異有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們在開展腦水腫相關(guān)研究時(shí)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)該考慮不同品種間的差異。

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Comparison of the differences in glutamate-induced astrocyte swelling between Wistar and Sprague-Dawley rats

SHI Zhong-fang1, XU Li-xin1, LU Yi2, DONG Li-ping1,YAN Xu1, YANG Shao-hua1,3, YUAN Fang1*

(1. Beijing Institute of Neurosurgery, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China;2. Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050; 3. Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, Fort Worth, Texas 76107, USA)

Objective To compare the differences between the cell swelling of cultured astrocytes (AST) from Wistar and Sprague-Dawley (SD) rats after incubation with glutamate. Methods Primary cultured AST derived from the cerebral cortex of one-day-old Wistar or SD rats were prepared. The cultured AST received 1 or 10 mmol/L glutamate treatment for 48 h on the tenth day after subculture. The viability of AST was determined by lactate dehydrogenase (LDH) kit to assess the cell injury, and the perimeter of AST was measured using Image Pro Plus software after glial fibrillary acidic protein immunofluorescence staining to evaluate the astrocyte swelling. Then, the expression of aquaporin 4 (AQP4) in cultured AST was detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Results No significant difference was found in the LDH release after the glutamate treatment in cultured AST from these two strains (P>0.05). The perimeter of AST from normal Wistar rats was shorter than that from SD rats, but was longer after the treatment of glutamate (P<0.05). Meanwhile, AQP4 expression in the Wistar rats was significantly higher than that from SD rats after incubation with 1 mmol/L glutamate (P<0.05). Conclusions These results suggeste that cultured AST from Wistar rats are more susceptible to glutamate-induced swelling than that from SD rats, and there are differences between the effects of glutamate on AQP4 expression in astrocytes of Wistar and SD rats.

Glutamate; Astrocyte; Aquaporin 4; Rats

YUAN Fang, E-mail: florayuan@vip.sina.com

國家自然科學(xué)基金(NO. 81271286，81228009);北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目資助號：7152027)。

師忠芳(1980-)，女， 碩士研究生，專業(yè)：神經(jīng)病理與病理生理學(xué)。E-mail: shizhongfangbj@163.com

袁芳(1963-)， 女，研究員，研究方向：神經(jīng)功能保護(hù)，癲癇及腦腫瘤相關(guān)研究。E-mail: florayuan@vip.sina.com

研究報(bào)告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0454-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.003

2016-04-05