宋玉美賀瑜梁柏瑩郭松超歐陽軼強

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室

?；撬釋β闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤生長的影響及其機制

宋玉美賀瑜梁柏瑩郭松超歐陽軼強

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室

目的探討?；撬釋β闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤生長的影響及機制。方法10只SPF級5周齡裸鼠接種MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞后隨機分為牛磺酸干預(yù)組和對照組，每組5只。?；撬岣深A(yù)組給予添加5%的?；撬犸嬎?，對照組給予正常無菌飲水。測量兩組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量，采用蛋白免疫印跡法檢測雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidemic growth factor receptor 2，HER-2）和鳥苷三磷酸酶激活蛋白（guanosine triphosphatase activating protein，p21ras）表達量的變化。結(jié)果實驗結(jié)束時所有裸鼠均存活，裸鼠乳腺癌模型造模成功。牛磺酸對裸鼠乳腺癌模型腫瘤的抑制率為41.6%。相對于對照組，?；撬岣深A(yù)組裸鼠腫瘤組織中ER表達量提高了134%（P＜0.05），PR表達量提高了47.5%（P＜0.05），HER-2表達量降低了67%（P＜0.05），p21ras表達量降低了62.2%（P＜0.01）。結(jié)論?；撬峥梢种坡闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤生長，其機制可能與上調(diào)ER、PR和下調(diào)HER-2、p21ras有關(guān)。

乳腺腫瘤；?；撬?；抗腫瘤；裸鼠；雌激素受體；孕激素受體；人類表皮生長因子受體2；鳥苷三磷酸酶激活蛋白

?；撬崾且环N人體條件必需的含硫氨基酸，是機體內(nèi)源性抗損傷物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)?；撬峥赏ㄟ^增強大鼠機體的免疫力、抗氧化能力、DNA損傷修復(fù)和抑制癌細(xì)胞增殖等途徑，抑制大鼠腫瘤的生長［1］，對二甲基苯蒽誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌有一定治療作用［2］。MDAMB-231細(xì)胞引起的乳腺癌侵襲性強、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后較差，且缺乏有效的治療方法［3］。本實驗采用人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231接種裸鼠，建立裸鼠乳腺癌模型，觀察?；撬釋β闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤生長的影響，并探討其干預(yù)機制，以期為乳腺癌的治療提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物與細(xì)胞

5周齡SPF雌性BALB/c裸鼠10只，體重18～22 g，取自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002）。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為廣西醫(yī)科大學(xué)保存提供。

1.2主要試劑和儀器

L-15培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（上海依科賽生物制品公司）、青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶。一抗：ER鼠單克隆抗體、PR鼠單克隆抗體、HER-2鼠單克隆抗體、p21ras鼠單克隆抗體均為美國Origene公司產(chǎn)品。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗鼠多克隆抗體為英國Abcam公司產(chǎn)品。RIPA裂解液和PMSF購自碧云天生物科技公司。PVDF膜，TBST洗脫液，脫脂奶粉，ECL發(fā)光試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，牛磺酸粉劑（楚牛牌食品添加劑，GB14759-2010），1%戊巴比妥鈉，全波長酶標(biāo)儀，超聲波組織破碎儀，Western Blot凝膠電泳儀，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國Protein Simple公司。

1.3裸鼠乳腺癌模型的建立

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的L-15培養(yǎng)基在37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞計數(shù)后用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至1×107個/mL，在裸鼠左側(cè)的第二對乳腺脂肪墊下注射0.1 mL生理鹽水定量的細(xì)胞后，將10只裸鼠隨機分為牛磺酸干預(yù)組和對照組，每組5只。牛磺酸干預(yù)組裸鼠給予5%的?；撬犸嬎?，對照裸鼠給予正常無菌飲水，兩組裸鼠飲水量及進食量一致，每只裸鼠飲水量約為6 mL/d。每兩天觀察、測量并記錄細(xì)胞接種部位腫瘤的生長情況。第40天用1%戊巴比妥鈉過量麻醉處死荷瘤裸鼠，完整剝離腫瘤，測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積（腫瘤體積=長徑×短徑2/2），繪制腫瘤生長曲線。同時稱量腫瘤質(zhì)量，計算腫瘤抑制率=（對照組腫瘤平均質(zhì)量-牛磺酸干預(yù)組腫瘤平均質(zhì)量）/對照組腫瘤平均質(zhì)量×100%。腫瘤組織放于液氮速凍，轉(zhuǎn)而保存于-80℃冰箱。

1.4蛋白免疫印跡法檢測ER、PR、HER-2、p21ras蛋白的表達情況

取30 mg腫瘤組織加入400 μL裂解液勻漿，超聲裂解組織，11 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA定量法測蛋白濃度。將上清液與2X上樣緩沖液混合后，100℃加熱5 min變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗ER、PR、HER-2、p21ras單克隆抗體（抗體濃度為1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加HRP標(biāo)記過二抗（抗體稀釋濃度為1∶4 000），室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，多功能成像系統(tǒng)曝光。以GAPDH做內(nèi)參，用Alpha View軟件分析條帶的灰度值，計算兩組腫瘤蛋白表達量含量。

1.5組織病理學(xué)檢查

裸鼠乳腺癌腫瘤組織浸入福爾馬林溶液（10%甲醛）固定后，對腫瘤組織進行取材、脫水、包埋、切片，經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下觀察，進行病理學(xué)鑒定。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，獨立樣本比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1裸鼠造模情況

實驗期間所有裸鼠均存活，實驗結(jié)束時，所有裸鼠均長出腫瘤，腫瘤最大體積的長徑和短徑均約2 cm，符合實驗預(yù)期，表明造模成功。見圖1。

2.2裸鼠腫瘤組織病理學(xué)檢查結(jié)果

肉眼觀察：兩組腫瘤組織均為淺灰白色，似有包膜，質(zhì)地略軟，切開似有壞死。鏡下觀察：乳腺結(jié)構(gòu)不明顯；腫瘤呈實體性，細(xì)胞豐富，無腺管狀結(jié)構(gòu)；腫瘤細(xì)胞增生活躍，多為合體細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞核呈空泡狀，可見核分裂相；癌巢內(nèi)有壞死和出血，癌巢周圍可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤等病理改變，兩組組織病理學(xué)表現(xiàn)相似，均診斷為裸鼠乳腺髓樣癌。病理切片結(jié)果符合乳腺癌組織病理特征，裸鼠乳腺癌模型造模可靠。見圖2。

圖1　實驗結(jié)束時裸鼠腫瘤生長情況

圖2　兩組裸鼠腫瘤組織的病理學(xué)檢查結(jié)果

2.3?；撬釋β闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤生長的影響

接種腫瘤細(xì)胞25 d后，?；撬岣深A(yù)組腫瘤體積較對照組明顯減緩（見圖3）。實驗結(jié)束時，?；撬岣深A(yù)組裸鼠的腫瘤體積為（178.70±67.02）cm3，腫瘤質(zhì)量為（2.02±0.75）g；對照組腫瘤體積為（306.01±45.93）cm3，腫瘤質(zhì)量為（3.46±0.95）g，兩組腫瘤體積和質(zhì)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗結(jié)束時?；撬釋β闶笕橄侔┠[瘤的抑制率為41.6%。提示?；撬崮苡行б种颇[瘤生長。

2.4?；撬釋β闶竽[瘤組織中ER、PR、HER-2和p21ras蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡實驗表明，與對照組比較，牛磺酸干預(yù)組腫瘤組織中ER表達量提高了134%（P＜0.05），PR表達量提高了47.5%（P＜0.05）；HER-2表達量下降了67%（P＜0.05），p21ras表達量下降了62.2%（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖3　兩組裸鼠乳腺癌模型的腫瘤體積生長曲線比較

圖4　兩組裸鼠腫瘤組織中ER、PR、HER-2和p21ras蛋白免疫印跡比較

3　討論

本實驗采用裸鼠注射MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞，建立裸鼠乳腺癌模型。經(jīng)病理切片檢查結(jié)果證實裸鼠腫瘤組織為乳腺髓樣癌，說明建立的裸鼠乳腺癌模型可靠。?；撬岣深A(yù)組裸鼠給予?；撬犸嬎?5 d后，腫瘤體積和質(zhì)量明顯下降，實驗結(jié)束時兩組腫瘤體積和質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，?；撬釋β闶笕橄侔┠[瘤的抑制率為41.6%，提示?；撬峋哂幸种迫橄侔┠[瘤組織生長的作用。

乳腺癌內(nèi)分泌治療是降低復(fù)發(fā)率和死亡危險的有效手段，ER和PR是臨床上乳腺癌內(nèi)分泌治療中的靶分子，在乳腺癌進展和治療過程中有重要作用［4］。ER和PR也是判斷乳腺癌預(yù)后的有效指標(biāo)，有報道ER和PR陽性表達者，其治愈率較高，而復(fù)發(fā)率較低［5，6］。Ruddy等［7］研究亦發(fā)現(xiàn)ER和PR陽性表達者對內(nèi)分泌治療較敏感，可使腫塊縮小，癌細(xì)胞凋亡，其術(shù)后5年生存率高于陰性者［8］。本研究中，蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，接種MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的裸鼠模型經(jīng)?；撬岣深A(yù)，相比對照組，ER和PR的表達量明顯提高，說明?；撬峥赡芡ㄟ^提高腫瘤組織中ER和PR的表達而干預(yù)乳腺癌內(nèi)分泌環(huán)節(jié)的調(diào)控，從而影響乳腺癌腫瘤的發(fā)展。

HER-2參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是腫瘤治療的研究熱點之一，也是乳腺癌治療的靶分子之一。國內(nèi)外學(xué)者報道，HER-2與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，HER-2高表達的乳腺癌患者其預(yù)后較差［9，10］。HER-2過表達亦可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生藥物抵抗，對激素療法和化療藥物產(chǎn)生耐受［11］。本實驗中?；撬岣深A(yù)組組織中HER-2的表達量明顯降低，說明?；撬釋ER-2的表達有一定抑制作用，牛磺酸可能通過降低HER-2的表達，參與乳腺癌細(xì)胞的生長增殖環(huán)節(jié)，抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖，促進細(xì)胞凋亡，減緩腫瘤增長速度，從而發(fā)揮控制腫瘤生長的作用。

p21ras是調(diào)控細(xì)胞生長分化的信號因子，是RAS基因的表達產(chǎn)物。RAS基因是人類最常見的原癌基因，許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)RAS基因過度活躍，因此也成為治療腫瘤的靶點［12］。p21ras與下游相關(guān)效應(yīng)蛋白組成信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和凋亡，當(dāng)p21ras過表達，信號傳導(dǎo)通路激活，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生癌變。在已有的報道中，多項實驗研究證明，在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)p21ras過量表達的現(xiàn)象。本實驗結(jié)果亦顯示，牛磺酸干預(yù)組組織中p21ras表達量降低，提示?；撬峥赡芡ㄟ^降低p21ras表達量，參與和控制腫瘤細(xì)胞的生長分化進程，從而延緩腫瘤生長。

綜上所述，?；撬釋β闶笕橄侔┠Ｐ湍[瘤表現(xiàn)出較好的抑制作用，其機制可能是?；撬嵬ㄟ^對乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的ER、PR、HER-2和p21ras蛋白進行良性調(diào)控，從腫瘤的內(nèi)分泌以及細(xì)胞生長、增殖和分化等環(huán)節(jié)，抑制乳腺癌細(xì)胞生長，減緩了裸鼠乳腺癌模型腫瘤生長。

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［2016-08-29收稿］［2016-09-20修回］［編輯羅惠予］

Effects of taurine on tumor growth in a nude mouse breast cancer model

Song Yumei，He Yu，Liang Boying，Guo Songchao，Ouyang Yiqiang（Department of Nutrition and Food，Hygiene Public Health of Guangxi Medical University，Nanning 530021,P.R.China）
Corresponding author：Guo Songchao.E-mail：2433164518@qq.com

Objective To study the effect of taurine on the humanized nude mouse model of triple-negative breast cancer.Methods Five-week-old SPF level nude mice（n=10）were inoculated with MDA-MB-231 breast cancer cells and randomly divided into one group that

normal drinking water and another group that

water containing 5%taurine（n=5 animals per group）. Tumor volume and weight were examined after treatment,and Western blotting was used to assess expression of estrogen receptor（ER）,progesterone receptor（PR），human epidermal growth factor receptor 2（HER-2）and guanosine triphosphatase-activating protein p21ras.Results All mice survived until the end of the experiment，and all tumors grew.Compared to control mice,mice given taurine had tumors with 41.6%smaller weight and volume（P＜0.05），134%higher expression of ER（P＜0.05）,47.5%higher expression of PR（P＜0.05），67%lower expression of HER-2（P＜0.05）and 62.2%lower expression of p21ras（P＜0.01）.Conclusion Taurine inhibits tumor growth by up-regulating expression of ER and PR and down-regulating expression of HER-2 and p21ras.

Breast neoplasms；Taurine；Antitumor；Nude mice；Estrogen receptor；Progesterone receptor；Human epidemic growth factor receptor 2；Guanosine triphosphatase activating protein

R737.9

A

1674-5671（2016）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.05.01

廣西科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目資助（14-91-02）

郭松超。E-mail：2433164518@qq.com