李治鑫，李 鑫，韓文炎

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州310008； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

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外源24-表油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)茶樹(Camellia sinensis L.)耐熱性的生理機(jī)制

李治鑫1，2，李 鑫1，*，韓文炎1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州310008； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

以茶樹品種龍井43為試驗(yàn)材料，研究外源24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)處理對高溫脅迫下茶樹葉片光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)：葉面噴施EBR能顯著提高高溫脅迫下茶樹葉片的凈光合速率(Pn)，氣孔導(dǎo)度(Gs)，Rubisco最大羧化速率(Vc，max)、Rubisco的最大再生速率(Jmax)和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)；同時(shí)外源EBR處理后，高溫脅迫下茶樹葉片中的抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性顯著提高，而MDA含量則顯著下降。外源EBR主要通過解除非氣孔因素的限制、促進(jìn)光合碳反應(yīng)的進(jìn)行來緩解高溫脅迫對茶樹葉片光合作用的抑制；同時(shí)EBR能夠有效利用多種抗氧化途徑以清除其細(xì)胞內(nèi)的自由基和活性氧，最終緩解高溫脅迫對茶樹的傷害。

茶樹；高溫；油菜素內(nèi)酯；光合特性；抗氧化酶

茶樹(CamelliasinensisL.)是一種多年生常綠葉用經(jīng)濟(jì)作物，適宜生長在溫暖濕潤的環(huán)境中，其最適宜的生長溫度為20～25 ℃，當(dāng)環(huán)境溫度高于40 ℃或低于-6 ℃時(shí)，其生長會受到嚴(yán)重的損害[1]。隨著全球氣候變化的日益加劇，茶樹等作物越來越容易受到高溫、凍害和干旱等極端環(huán)境因素的影響。近年來，全國范圍內(nèi)極端高溫天氣頻繁出現(xiàn)，有關(guān)茶樹遭受熱害的報(bào)道也在不斷增加[2]。高溫脅迫會嚴(yán)重降低茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，探究茶樹的耐熱機(jī)制以及尋求提升茶樹耐熱性的方法是科研和生產(chǎn)中亟待解決的重大問題。

油菜素甾醇類物質(zhì)(Brassinosteroids， BRs)是從油菜花粉中分離鑒定出的一類具有促進(jìn)植物生長作用的物質(zhì)[3]，現(xiàn)已被公認(rèn)為第六大植物激素[4]。近年來，已有研究證實(shí)BRs具有促進(jìn)植物生長和提高作物產(chǎn)量的作用[5-6]，同時(shí)BRs還能增強(qiáng)植株對鹽[7]、干旱[8]等多種脅迫的抗性，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可廣泛應(yīng)用[9]。目前，關(guān)于BRs提高植物抗性機(jī)理的研究主要集中在1年生蔬菜作物上，對于多年生植物的研究則相對較少，有關(guān)其在茶樹上的研究更是鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)以茶樹品種龍井43為材料，研究了葉面噴施24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)處理對高溫脅迫下茶樹葉片光合特性、熒光參數(shù)和抗氧化酶活性的影響，揭示了外源油菜素內(nèi)酯提高茶樹耐熱性的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

采用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所培育并大面積推廣的茶樹優(yōu)質(zhì)品種龍井43為試驗(yàn)品種。選取優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)成齡茶園的茶樹，以0.1 μmol·L-1的24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)進(jìn)行葉面噴施，同時(shí)以含有相同濃度乙醇的清水進(jìn)行葉面噴施作為對照。EBR由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院喻景權(quán)課題組贈予，由無水乙醇溶解成100 μmol·L-1的母液冷藏儲存。

葉面噴施EBR和清水處理12 h后，分別剪取處理茶樹的枝條作為試驗(yàn)材料，放入純水內(nèi)培養(yǎng)，并置于智能人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行常溫和高溫處理。環(huán)境條件如下：正常生長箱中溫度設(shè)定為25 ℃，高溫處理生長箱中溫度設(shè)定為43 ℃。兩個(gè)生長箱中其他環(huán)境條件一致：平均光強(qiáng)為600 μmol·m-2·s-1，相對濕度控制在80%左右。

最終所取枝條可以分為4個(gè)處理。處理1：對照(CK)，即清水處理后置于正常溫度；處理2：油菜素內(nèi)酯(BR)，即葉面噴施24-表油菜素內(nèi)酯后的枝條置于正常溫度；處理3：高溫(Heat)，即清水處理后置于高溫處理；處理4：油菜素內(nèi)酯和高溫復(fù)合處理(BR+Heat)，即面噴施24-表油菜素內(nèi)酯后置于43 ℃下連續(xù)處理。在人工氣候箱中進(jìn)行不同溫度處理后12 h分別進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定及取樣，選取茶樹自頂芽向下的第3張葉片進(jìn)行光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)和抗氧化酶活性的測定，每次測量設(shè)5～6個(gè)重復(fù)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 光合氣體交換測定

使用LI-COR 6400型光合儀(美國LI-COR公司生產(chǎn))，在600 μmol·m-2·s-1光強(qiáng)和400 μmol·mol-1CO2濃度下測定茶樹葉片的光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)。測定條件為：葉片溫度(25±1.5)℃，空氣濕度70%～80%。光合作用CO2響應(yīng)曲線(A/Ci)利用Caemmerer等[10]的方法測定，然后參考Ethier等[11]的方法分析Rubisco最大羧化速率(Vc， max)以及Rubisco的最大再生速率(Jmax)。

1.2.2 熒光參數(shù)測定

使用IMAGING-PAM調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(德國Walz公司生產(chǎn))測定茶樹葉片的熒光參數(shù)。葉片暗適應(yīng)30 min后，照射檢測光(<0.05 μmol·m-2·s-1)測得最小熒光(Fo)，再照射飽和脈沖光(4 000 μmol·m-2·s-1)測定最大熒光(Fm)。PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm，選定整個(gè)葉面為AOI(area of interest)計(jì)算Fv/Fm的平均值。

1.2.3 MDA含量測定

MDA含量的測定參照Cakmak等[12]的方法。取0.3 g茶樹葉片加入磷酸緩沖液(50 mmol·L-1磷酸鈉，0.2 mmol·L-1EDTA和2% PVP)提取，在12 000g下離心20 min，取上清液用于MDA測定。吸取上清液1 mL，加入3 mL TBA反應(yīng)液(2% TBA和30% 三氯乙酸的混合液)，在95 ℃的水浴鍋中保溫30 min，結(jié)束后立即置于冰浴中冷卻，在1 500g下離心10 min，測定D532和D600下的吸光值，兩者的差值用于計(jì)算最終的MDA含量(消光系數(shù)為155 mmol·L-1·cm-1)。

1.2.4 抗氧化酶活性測定

抗氧化酶提取方法與MDA的提取方法相同。取0.3 g茶樹葉片加入磷酸緩沖液(50 mmol·L-1磷酸鈉，0.2 mmol·L-1EDTA和2% PVP)提取，在12 000g下離心20 min，取上清液用于測定。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定采用Nakano和Asada[13]的方法。加3 mL反應(yīng)混合液(25 mmol·L-1PBS緩沖液，1 mmol·L-1H2O2，0.25 mmol·L-1AsA和100 μL酶液)，立刻測定D290的動力學(xué)變化，測定時(shí)間間隔為20 s，以不加H2O2的反應(yīng)速率作為空白對照(消光系數(shù)為2.8 mmol·L-1·cm-1)。

過氧化氫酶(CAT)活力的測定參照Cakmak等[12]的方法。吸取100 μL酶液，加入1 700 μL的25 mmol·L-1PBS(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)，200 μL 的10 mmol·L-1H2O2，在25 ℃下反應(yīng)，并立刻測定D470的動力學(xué)變化(消光系數(shù)為39.4 mmol·L-1·cm-1)。

超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定采用Giannopolitis等[14]的方法。吸取酶液50 μL，加50 mmol·L-1PBS(pH 7.8，含15 mmol·L-1甲硫氨酸，65 μmol·L-1NBT，2.0 μmol·L-1核黃素，0.1 mmol·L-1EDTA)3 mL，以緩沖液取代酶液作為空白。在溫度25 ℃，光強(qiáng)100 μmol·m-2·s-1下照光10 min，然后置于暗下終止反應(yīng)，立即測定D560吸光值。

過氧化物酶(POD)活力的測定參照Cakmak等[12]的方法。取100 μL酶液，加1 700 μL 25 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)，100 μL 20 mmol·L-1H2O2，100 μL 1%愈創(chuàng)木酚，在25 ℃下反應(yīng)，并立刻測定D470的動力學(xué)變化(吸光系數(shù)為26.6 mmol·L-1·cm-1)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用Excel 2010與SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片光合特性的影響

凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)是反映植物葉片光合特性最主要的指標(biāo)[15]。由圖1-A可以看出，外源EBR能顯著(P<0.05)提高茶樹葉片的凈光合速率。外源EBR處理后，茶樹葉片的Pn和Gs分別提高了19.86%和23.25%(圖1-A和1-B)(較對照而言，下同)。高溫處理后，茶樹葉片的Pn和Gs分別降低了47.15%和55.64%。與單一的高溫處理相比，經(jīng)外源EBR和高溫前后復(fù)合處理的茶樹葉片的Pn和Gs均顯著提高，其較對照而言分別提高了25.67%和20.47%。然而，與對照相比，

圖中不同處理間沒有相同字母代表差異顯著，P<0.05，下同圖1 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片光合特性的影響Fig.1 Effects of EBR treatment on photosynthetic characteristics in tea leaves under heat stress

Ci經(jīng)EBR、高溫、EBR和高溫前后復(fù)合處理后均沒有出現(xiàn)顯著差異(圖1-C)。可見，外源EBR處理能顯著緩解高溫脅迫對茶樹葉片光合作用的抑制。

2.2 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片Vc，max和Jmax的影響

Vc，max是指植物光合作用過程中由核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)催化的最大羧化反應(yīng)速率，Jmax則是指在光合循環(huán)中RuBP產(chǎn)物的最大再生速率[16]。由圖2-A和2-B可以看出，外源EBR處理后，茶樹葉片的Vc，max顯著提高，而Jmax則無顯著變化(P>0.05)。高溫處理后，茶樹葉片的Vc，max和Jmax均顯著降低，降幅分別為40.61%和36.10%。與單一的高溫處理相比，經(jīng)外源EBR和高溫前后復(fù)合處理的茶樹葉片的Vc，max和Jmax均顯著提高，其較對照而言分別提高了31.34%和16.67%。可見，外源EBR處理能顯著緩解高溫脅迫對茶樹葉片Rubisco最大羧化效率的抑制，從而保證光合作用中羧化反應(yīng)階段的順利進(jìn)行；同時(shí)其也能緩解高溫脅迫對茶樹葉片RuBP最大再生速率的抑制，促進(jìn)光合電子傳遞的進(jìn)行。

圖2 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片Vc，max(A)和Jmax(B)的影響Fig.2 Effects of EBR treatment on Vc，max (A) and Jmax (B) in tea leaves under heat stress

2.3 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片F(xiàn)v/Fm和MDA含量的影響

Fv/Fm代表光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)的最大效率或PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，是衡量PSⅡ光抑制程度的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。圖3是Fv/Fm指標(biāo)直觀的圖像化表示，標(biāo)尺上不同顏色即對應(yīng)著不同的數(shù)值，茶樹葉片顏色的變化即代表著其Fv/Fm數(shù)值的變化。由圖3和圖4-A可以看出，外源EBR處理后，茶樹葉片的Fv/Fm無顯著變化(P>0.05)。高溫處理后，茶樹葉片的Fv/Fm顯著降低，降幅為31.56%。與單一的高溫處理相比，經(jīng)外源EBR和高溫前后復(fù)合處理的茶樹葉片的Fv/Fm顯著提高，其較對照而言提高了17.62%。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低可以表明膜脂受破壞的程度[18]。由圖4-B可見，外源EBR處理后，茶樹葉片內(nèi)的MDA含量無顯著變化；而高溫處理后，茶樹葉片內(nèi)的MDA含量提高了79.03%。與單一的高溫處理相比，經(jīng)外源EBR和高溫前后復(fù)合處理的茶樹葉片內(nèi)的MDA含量顯著降低?？梢姡庠碋BR處理能顯著緩解高溫脅迫下茶樹葉片光系統(tǒng)Ⅱ出現(xiàn)的光抑制；同時(shí)也能降低高溫下茶樹葉片中過度積累的膜脂過氧化物MDA的含量。

2.4 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片抗氧化酶活性的影響

在正常的生理代謝中，植物通過一定的酶學(xué)機(jī)制保護(hù)自身免受活性氧的傷害，而抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)則是該酶學(xué)機(jī)制中最重要的4種關(guān)鍵酶[19]。由圖5可見，與對照相比，外源EBR處理后，茶樹葉片的APX，CAT，SOD和POD活性均顯著提高(P<0.05)，其活性分別提高了30.29%，34.30%，20.03%和39.98%；高溫處理后，茶樹葉片的CAT和SOD活性顯著提高，其活性分別提高了17.64%和55.15%，而APX和POD活性的提升則不顯著。與單一的高溫處理相比，經(jīng)外源EBR和高溫前后復(fù)合處理的茶樹葉片的APX，CAT，SOD和POD活性均顯著提高，其較對照而言分別提高了58.36%，55.28%，27.77%和42.41%。可見，外源EBR處理能顯著提高高溫脅迫下茶樹葉片中抗氧化酶的活性，從而減輕活性氧對茶樹的損傷。

圖3 高溫和外源EBR處理后茶樹葉片熒光成像圖Fig.3 Fluorescence imaging figure of tea leaves under heat stress and EBR treatment

圖4 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片F(xiàn)v/Fm(A)和MDA含量(B)的影響Fig.4 Effects of EBR treatment on Fv/Fm(A) and MDA contents(B) in tea leaves under heat stress

3 討論

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以在一定程度上反映環(huán)境因子的變化對植物光合系統(tǒng)產(chǎn)生的影響及其機(jī)制[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫處理后，茶樹葉片的Fv/Fm顯著降低；而外源EBR處理能顯著提高高溫脅迫下茶樹葉片的Fv/Fm，這說明外源EBR處理能有效緩解高溫脅迫下茶樹受到的光抑制。高溫脅迫后，茶樹葉片的Pn，Gs，Vc，max和Jmax均顯著降低，而Ci卻略有提升，這說明非氣孔因素是高溫脅迫下茶樹葉片光合作用降低的主要原因。前人研究表明，高溫脅迫下，植物葉片中的Rubisco活化狀態(tài)決定了其光合能力[21-22]。當(dāng)Rubisco失活以后，其羧化效率(Vc，max)會顯著下降，進(jìn)而影響RuBP的再生能力(Jmax)和卡爾文循環(huán)相關(guān)酶活性。我們之前的研究表明，高溫脅迫會抑制茶樹葉片光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ的活性，同時(shí)也會嚴(yán)重影響茶樹光合碳同化過程，從而抑制茶樹的光合作用[23]。在本研究中，外源EBR處理能顯著提高高溫脅迫下茶樹葉片的Pn，Gs，Vc，max和Jmax，而Ci則無顯著變化，與Ogweno等[24]的研究結(jié)果一致。這說明外源EBR主要通過提高Rubisco羧化效率和RuBP再生能力進(jìn)而緩解高溫脅迫對茶樹葉片光合作用的抑制，與自然條件下外源EBR促進(jìn)植物光合代謝的機(jī)制具有一定的相似性[25-26]。

圖5 外源EBR對高溫脅迫下茶樹葉片抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of EBR treatment on antioxidant enzyme activity in tea leaves under heat stress

此外，高溫脅迫下茶樹葉片細(xì)胞中的膜脂過氧化作用加劇，MDA含量顯著提高，茶樹細(xì)胞膜的完整性遭受破壞。而外源EBR處理能顯著降低高溫脅迫下茶樹葉片細(xì)胞中MDA的含量，從而抑制膜脂過氧化過程， 緩解高溫脅迫對茶樹的損傷。自然條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除會處于一種動態(tài)的平衡，而遭受高溫脅迫后，這種平衡會受到破壞，從而造成活性氧的過量積累，最終導(dǎo)致植物受到不同程度的損傷[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，遭受高溫脅迫后，茶樹葉片中CAT和SOD的活性顯著提高，說明高溫脅迫發(fā)生后茶樹可以通過提高CAT和SOD活性來及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的自由基和活性氧。外源EBR處理后，能夠進(jìn)一步提高高溫脅迫下茶樹葉片中的APX，CAT，SOD和POD活性，與Ogweno等[24]的研究結(jié)果一致。這說明EBR能夠通過增強(qiáng)茶樹的抗氧化系統(tǒng)清除其細(xì)胞內(nèi)的自由基和活性氧，從而更有效地緩解高溫脅迫對其自身的損傷。同時(shí)，抗氧化能力的提高也會緩解高溫脅迫對茶樹葉片光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的損傷，從而緩解高溫脅迫對茶樹葉片光合作用的抑制，最終共同緩解了高溫脅迫對茶樹的傷害。

綜上所述，本研究表明外源EBR能夠有效緩解高溫脅迫對茶樹的傷害：一方面外源EBR通過提高茶樹的Rubisco羧化效率和RuBP再生能力，促進(jìn)光合碳反應(yīng)的進(jìn)行來緩解高溫脅迫對茶樹葉片光合作用的抑制。同時(shí)EBR還能夠有效促進(jìn)茶樹抗氧化系統(tǒng)以清除其細(xì)胞內(nèi)的自由基和活性氧，最終緩解高溫脅迫對茶樹的傷害。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Physiology mechanism of exogenous 24-epibrassinolide-induced heat resistance in tea plants(CamelliasinensisL.)

LI Zhi-xin1，2， LI Xin1，*， HAN Wen-yan1，*

(1.TeaResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310008，China; 2.GraduateSchoolofChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China)

The present study investigated the effects of exogenous 24-epibrassinolide (EBR) on gas exchange， chlorophyll fluorescence parameters， lipid peroxidation (MDA content) and antioxidant enzymes activities in tea (Camelliasinensiscv. Longjing 43) leaves under heat stress. Results showed that foliar application of EBR could significantly increasePn，Gs，Vc，max，JmaxandFv/Fmin tea leaves under heat stress. Moreover， EBR remarkably increased activities of APX， CAT， SOD and POD， but decreased MDA content in tea leaves following heat stress. These results suggest that exogenous EBR mitigates heat stress-induced photosynthetic inhibitions in tea leaves， mainly by eliminating the non-stomatal limitations and promoting the photosynthetic carbon reaction. Furthermore， EBR strengthened the antioxidant system effectively to scavenge harmful levels of reactive oxygen species and thus alleviated heat stress in tea plant.

CamelliasinensisL.; heat stress; EBR; photosynthetic characteristics; antioxidant enzymes

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.09

2015-09-10

李治鑫(1991—)，男，湖北鄂州人，碩士研究生，從事茶樹栽培與生理生化研究。E-mail：lizhixin@tricaas.com

*通信作者，李鑫，E-mail：lixin@tricaas.com；韓文炎，E-mail：hanwy@tricaas.com

S571.1

A

1004-1524(2016)06-0959-07

李治鑫，李鑫，韓文炎. 外源24-表油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)茶樹(CamelliasinensisL.)耐熱性的生理機(jī)制[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(6)： 959-965.