王淑娟，劉文舉，劉曉麗，王立克，龐訓(xùn)勝

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

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褪黑素受體Mel1a在鴨不同組織中的表達(dá)研究

王淑娟1，劉文舉1，劉曉麗2，王立克1，龐訓(xùn)勝1

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

褪黑素是由松果體分泌的吲哚類(lèi)激素，褪黑素通過(guò)與其受體(Mel-1a， Mel-1b and Mel-1c)結(jié)合發(fā)揮對(duì)動(dòng)物的節(jié)律性，生殖調(diào)控，抗凋亡和抗氧化等調(diào)節(jié)作用。為探究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鴨不同組織中的表達(dá)與分布以及在各個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)量，研究褪黑素通過(guò)Mel1a受體參與鴨的生殖調(diào)控作用及其他生物學(xué)效應(yīng)奠定基礎(chǔ)，采集鴨心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌肉組織，利用PCR、免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù)研究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鴨各組織中表達(dá)分布以及Mel1amRNA的相對(duì)表達(dá)量。研究結(jié)果表明：鴨Mel1amRNA在心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌組織中均存在表達(dá)；Mel1a蛋白在大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中均有表達(dá)；Mel1amRNA定量結(jié)果表明，各組織中的Mel1amRNA表達(dá)量存在差異，大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對(duì)表達(dá)量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對(duì)表達(dá)量較低。褪黑素首先通過(guò)與其受體結(jié)合而發(fā)揮生理調(diào)控功能，所以通過(guò)研究Mel1amRNA和蛋白在不同組織的表達(dá)分布及其相對(duì)表達(dá)量，為研究褪黑素及其受體的生理功能如調(diào)控晝夜節(jié)律，抗凋亡、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、卵母細(xì)胞成熟以及胚胎的發(fā)育探究提供基礎(chǔ)。

鴨；褪黑素受體1a；免疫組織化學(xué)；組織表達(dá)；熒光定量PCR

褪黑素是由松果體分泌的具有多種生物功能的吲哚類(lèi)激素，并且在調(diào)控動(dòng)物晝夜節(jié)律及季節(jié)性繁殖動(dòng)物的生殖活動(dòng)等功能具有重要的作用[1-3]。光照對(duì)褪黑素的分泌具有抑制作用，白天血液中的褪黑素的濃度要低于夜間。褪黑素發(fā)揮其多種生物學(xué)功能前提是與其受體相結(jié)合，隨著人們研究的不斷深入，褪黑素受體的相關(guān)信息已日益完善。褪黑素受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族[4-5]。在脊椎動(dòng)物中褪黑素受體存在3種亞型，分別為Mel1a，Mel1b和Mel1c[6]；然而在哺乳動(dòng)物中只存在2種褪黑素受體，分別為MT1和MT2，哺乳動(dòng)物的MT1和MT2分別與脊椎動(dòng)物中的Mel1a和Mel1b相對(duì)應(yīng)[7-8]。在哺乳動(dòng)物中缺失Mel1c，這可能是物種在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因的丟失。近來(lái)也有研究認(rèn)為哺乳動(dòng)物中存在第3種褪黑素受體，NQO2(醌類(lèi)還原酶)被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物的第3個(gè)褪黑素受體，但是NQO2不是G-蛋白偶聯(lián)受體家族，并且NQO2在倉(cāng)鼠和兔中存在表達(dá)，而在人類(lèi)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種受體[9-11]。也有研究者把與褪黑素受體具有同源性的GPR50 (G protein-coupled receptor 50)作為哺乳動(dòng)物的第3種受體，但是研究認(rèn)為GPR50并不與褪黑素相結(jié)合，可能與MT1以異二聚體的形式相結(jié)合，從而抑制褪黑素受體MT1的活性[12-13]。Mel1a主要表達(dá)于各個(gè)物種的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織[4，14]。Natesan等[15]對(duì)雞的神經(jīng)組織研究表明Mel1a，Mel1b和Mel1c均表達(dá)于神經(jīng)組織。Rada等[16]運(yùn)用免疫組化和western blot的方法研究表明在雞的眼球中存在Mel1a，Mel1b和Mel1c的表達(dá)，并且主要分布于角質(zhì)層、脈絡(luò)膜、鞏膜和視網(wǎng)膜。然而Adachi 等[7]通過(guò)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞研究褪黑素受體的表達(dá)分布，只有Mel1a和Mel1c 2種受體，而不存在Mel1b受體。Sallinen等[17]研究兔的Mel1a mRNA 組織分布表明褪黑素受體均表達(dá)于視網(wǎng)膜，心肌、肝臟、哈德淚腺和小腸組織中。在哺乳動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)Mel1a在視交叉上核、垂體和生殖系統(tǒng)具有較高的表達(dá)水平，這可能有褪黑素發(fā)揮生理調(diào)控機(jī)能有關(guān)[18]。Mel1a也表達(dá)于金魚(yú)的各組織中，并且在腦和視網(wǎng)膜的表達(dá)量明顯高于其他組織[19-21]。Mel1a表達(dá)于腦部，如下丘腦、頂蓋前區(qū)和視頂蓋，這可能與Mel1a參與視覺(jué)信息的呈遞有關(guān)[22]。

褪黑素具有廣泛的生物學(xué)功能，特別是對(duì)動(dòng)物的生殖生理具有重要的調(diào)控作用。褪黑素及其受體在鴨上的研究比較少，而研究褪黑素功能的基礎(chǔ)是褪黑素受體的組織表達(dá)分布，研究褪黑素受體的表達(dá)分布為研究褪黑素的功能以及不同組織的表達(dá)調(diào)控具有重要的意義，本研究基于此利用免疫組織的方法研究Mel1a受體蛋白在鴨不同組織的表達(dá)分布以及RT-PCR的方法研究Mel1a的mRNA在鴨不同組織的表達(dá)分布及相對(duì)表達(dá)量，為研究Mel1a對(duì)鴨的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象

選取產(chǎn)蛋期母鴨6只，取新鮮的心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌肉組織于液氮中保存?zhèn)溆?，用于提取RNA；同時(shí)采取大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織固定在多聚甲醛中用于免疫組化分析。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根(中國(guó)北京)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自fermentas(美國(guó))、TaqDNA 聚合酶等購(gòu)自北京天根(中國(guó)北京)、dNTP Mix購(gòu)自天根公司(中國(guó)北京)、免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德(中國(guó)武漢)、褪黑素受體A購(gòu)自北京博奧森(中國(guó)北京)，熒光定量試劑購(gòu)自羅氏公司(德國(guó))。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將保存在液氮中的心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌組織分別取出約50 mg，在加有液氮的研缽中用研棒研成粉末狀。然后將組織粉末轉(zhuǎn)移到裂解液中，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，提取的總RNA溶于50 μL RNasefree-H2O中，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。將提取的各組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序及條件：5.0 μL總RNA、0.5 μL Oligo(dT) 引物和6.5 μL RNasefree-H2O，65 ℃ 5 min，迅速置于冰上預(yù)冷2 min；然后加入5.0 μL M-MLV RT 5×緩沖液、1.25 μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑和1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，得到鴨各組織的cDNA，置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)

參考GenBank報(bào)道的原雞(Gallusgallus)(gi4538-2490)、小白鷺(Egrettagarzetta)(GI:697840607)、紅喉潛鳥(niǎo)(Gaviastellata)(GI:698414251)、斑尾非洲咬鵑(Apalodermavittatum)(GI:699600918)、雙領(lǐng)鸻(Charadriusvociferus)(GI:699659678)、絨啄木鳥(niǎo)(Picoidespubescens)(GI:699670255)、麝雉(Opisthocomushoazin)(GI:700395793)、啄羊鸚鵡(Nestornotabilis)(GI:701302251)和紅冠蕉鵑 (Tauracoerythrolophus)(GI:701333387)Mel1a基因序列，針對(duì)序列保守區(qū)域利用Primer 5.0軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)1對(duì)引物。引物由上海生工公司合成，見(jiàn)表1。

1.5 鴨Mel1a基因擴(kuò)增及鑒定

以反轉(zhuǎn)錄的鴨腦組織的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：1.0 μL cDNA、10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL、2.5 μL 10×Buffer、0.5 μLTaq酶(5 U·μL-1)，加ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。

表1 鴨Mel1a和GAPDH基因擴(kuò)增引物

Table 1 The PCR primer for theMel1aandGAPDHgenes

基因引物退火溫度/℃Mel1a5'-GGGCCTAAGTGTCATTGGAT-3'585'-AGTAACTATGGCTATGGGAAG-3'GAP-DH5'-GTGGTGCAAGAGGCATTGCT-GAC-3'585'-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3'

反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物保存在4 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的片段。用凝膠試劑盒回收目的片段，并與克隆載體Pmd-18T連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB固體培養(yǎng)基平皿，挑取單菌落培養(yǎng)，以菌液為模板，用鴨Mel1a基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，觀察是否有目的片段，挑選陽(yáng)性菌液，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 Mel1a mRNA組織表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄的鴨各組織的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.5節(jié)，檢測(cè)各組織中Mel1amRNA的表達(dá)。

1.7 免疫組化

免疫組化檢測(cè)鴨大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織Mel1a蛋白的表達(dá)，大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織經(jīng)固定、包埋、切片、烤片；60 ℃恒溫箱中烘烤120 min、脫蠟和水化；二甲苯(20 min)→二甲苯(20 min)→無(wú)水乙醇(5 min×2次)→95%乙醇(5 min×2次)→90%乙醇(5 min)→80%乙醇(5 min)，并依次滴加抗原修復(fù)液、3%過(guò)氧化氫、5%脫脂奶粉封閉液、兔抗Mel1a多抗，再滴加生物素化山羊抗兔二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1 min，鹽酸乙醇分化、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察Mel1a蛋白的表達(dá)情況。

1.8 Mel1a基因定量檢測(cè)

Mel1a引物見(jiàn)表1，在熒光定量PCR 10.0 μL反應(yīng)體系中加入5.0 μL含綠色熒光的2×Mix Buffer，稀釋5倍后的樣品cDNA 2.0 μL為模板，10 mmol·L-1的引物0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O補(bǔ)至10.0 μL，分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，然后進(jìn)行熒光定量PCR程序(表2)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，反應(yīng)程序如表2所示。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用LightCycler 480系統(tǒng)軟件分析熒光定量PCR數(shù)據(jù)，以大腦基因表達(dá)量為參照，應(yīng)用2-ΔΔCt方法分析Mel1a基因在其他組織的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)程序

Table 2 Reaction program of real-time PCR

反應(yīng)步驟溫度/℃時(shí)間/s循環(huán)次數(shù)/次熒光信號(hào)預(yù)孵育95301無(wú)955擴(kuò)增582045在延伸階段結(jié)束時(shí)7220熔解曲線60251在溫度緩慢升高過(guò)程中冷卻40101無(wú)

采用SPSS 11.0計(jì)算重復(fù)樣品之間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)差，最后使用Excel繪制Mel1a基因在鴨各組織中的相對(duì)表達(dá)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨組織總RNA的提取

提取的鴨組織總RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，圖1中28S條帶亮度高于18S，當(dāng)28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍時(shí)，表明提取的RNA質(zhì)量較好，并且沒(méi)有出現(xiàn)5S，表明RNA無(wú)降解，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 鴨Mel1a基因擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的鴨Mel1a基因引物(表1)，以鴨腦cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符，為292 bp(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的Mel1a基因序列與GenBank中其他物種的Mel1a同源性很高。

2.3 Mel1a mRNA組織表達(dá)譜

以鴨心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的鴨Mel1a基因引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明鴨Mel1amRNA在鴨的各組織中均表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量存在差異，脾、心、小腦、卵巢和肝的表達(dá)量相對(duì)較高，而骨骼肌的表達(dá)量相對(duì)較低(圖3)。

圖1 鴨組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from duck tissues

M: Marker 1DNA分子標(biāo)記；1～5: Mel1a PCR 產(chǎn)物圖2 鴨Mel1a基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Mel1a detected by PCR

圖3 Mel1a基因和內(nèi)參基因(GAPDH)在鴨組織中的表達(dá)Fig.3 The expression of Mel1a and GAPDH at mRNA level in duck tissues

A， 大腦；B， 肺；C， 肝；D， 骨骼?。籈， 腎；F， 心；G， 胰圖4 鴨Mel1a受體蛋白在各組織中表達(dá)分布Fig.4 The expression of Mel1a in duck tissues

2.4 Mel1a受體蛋白在不同組織的表達(dá)

免疫組化結(jié)果與Mel1amRNA組織表達(dá)譜相似，鴨Mel1a受體蛋白在大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中均存在表達(dá)(圖4)。

2.5 Mel1a mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

利用熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)Mel1amRNA在各組織的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，以大腦基因表達(dá)量為對(duì)照，分析Mel1a基因在鴨其他10種組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖5。Mel1a基因在所檢測(cè)的組織中均存在表達(dá)，其中大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對(duì)表達(dá)量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對(duì)表達(dá)量較低。

圖5 鴨Mel1a基因 mRNA相對(duì)定量結(jié)果Fig.5 The relative expression of Mel1a mRNA in duck tissues

3 討論

褪黑素是由松果體分泌的，在調(diào)控生殖生理功能中具有重要作用的吲哚類(lèi)激素，褪黑素通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。本研究以鴨不同組織的Mel1a為研究對(duì)象，利用PCR和免疫組化的方法研究Mel1amRNA和蛋白在鴨不同組織中的表達(dá)分布，以及應(yīng)用定量PCR的方法研究Mel1amRNA在鴨不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，研究結(jié)果表明鴨Mel1amRNA在心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌組織中均存在表達(dá)；Mel1a受體蛋白均表達(dá)于大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中；Mel1amRNA定量結(jié)果表明各組織中的Mel1amRNA表達(dá)量存在差異，在大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對(duì)表達(dá)量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對(duì)表達(dá)量較低。褪黑素受體在鴨組織表達(dá)的廣泛性以及不同的表達(dá)量，表明褪黑素及其受體在不同組織中發(fā)揮不同的調(diào)控作用，如抗凋亡、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)。

Mel1amRNA和蛋白在部分物種中的表達(dá)已經(jīng)被鑒定，然而關(guān)于鴨的各個(gè)組織的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。Natesan等[15]對(duì)雞的Mel1amRNA在視網(wǎng)膜的表達(dá)分布研究表明Mel1a表達(dá)于光感受器，視網(wǎng)膜的內(nèi)核層以及視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。Rada等[16]研究表明雞的眼球中存在Mel1a受體，主要分布于角質(zhì)層、脈絡(luò)膜、鞏膜和視網(wǎng)膜然，在夜晚表達(dá)量最高，褪黑素受體在眼球中表達(dá)特別是視網(wǎng)膜中表達(dá)與褪黑素通過(guò)受體調(diào)控晝夜節(jié)律有關(guān)。Sallinen等[17]研究表明兔的Mel1amRNA表達(dá)于下丘腦，視網(wǎng)膜，心肌、肝臟、哈德淚腺和小腸組織中，下丘腦中Mel1amRNA白天和晝夜表達(dá)差異顯著。Mel1a表達(dá)于金魚(yú)的腦、視網(wǎng)膜、肝臟和腎臟組織中，并且在腦和視網(wǎng)膜的表達(dá)量明顯高于其他組織[20]。Mel1a也表達(dá)于魚(yú)腦部，如下丘腦、頂蓋前區(qū)和視頂蓋，這可能與Mel1a參與視覺(jué)信息的呈遞有關(guān)[22]。Iigo等[23]研究表明褪黑素在神經(jīng)系統(tǒng)具有較多的結(jié)合位點(diǎn)。本研究與以上研究相符合，與其他組織相比Mel1a在神經(jīng)系統(tǒng)具有較高的表達(dá)水平。Mel1a在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)與其調(diào)控動(dòng)物的晝夜節(jié)律功能有著重要的關(guān)聯(lián)，同時(shí)Mel1a通過(guò)視網(wǎng)膜感受外界光照的變化，參與光信號(hào)的呈遞使動(dòng)物的生理行為呈現(xiàn)一定的節(jié)律性以及調(diào)節(jié)睡眠和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)[24-25]。褪黑素還可以調(diào)節(jié)腦垂體釋放促黃體素和生長(zhǎng)激素，并且在神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控中具有重要的作用[1，26-27]。

褪黑素受體同樣在鳥(niǎo)類(lèi)的免疫器官中表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用[28]，進(jìn)一步的研究表明褪黑素可以調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞的活性、嗜中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和增加抗原遞呈細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)以及細(xì)胞因子IL-1，IL-6，TNF a的表達(dá)[29-33]，本研究發(fā)現(xiàn)Mel1amRNA表達(dá)于免疫器官脾和肝組織上，這與褪黑素及其受體在免疫調(diào)節(jié)上的作用相符合。因此，褪黑素可能通過(guò)其受體在調(diào)節(jié)免疫器官增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性以及增加免疫因子的分泌具有重要作用。

褪黑素是由松果體分泌的然后通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—性腺軸，調(diào)節(jié)繁殖動(dòng)物的生殖功能，而對(duì)于雌性動(dòng)物主要通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)Mel1amRNA和蛋白在鴨卵巢中均存在并且在卵巢中有較高的表達(dá)水平。以前的研究表明褪黑素受體在其他物種的卵巢中表達(dá)，鼠和人的卵巢中存在Mel1a表達(dá)[34-35]，褪黑素受體在牛卵母細(xì)胞和胚胎中也均有表達(dá)[36-37]。我們以前的研究表明Mel1a在牛卵巢顆粒細(xì)胞中存在表達(dá)[38]。Chowdhury等[39]在鳥(niǎo)類(lèi)生殖系統(tǒng)中研究發(fā)現(xiàn)褪黑素及其受體可促進(jìn)顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟，能調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素的合成。褪黑素及其受體通過(guò)對(duì)卵巢功能的調(diào)節(jié)如卵母細(xì)胞的成熟以及激素的分泌和胚胎的發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的繁殖性能。褪黑素首先通過(guò)與其受體結(jié)合而發(fā)揮生理調(diào)控功能，所以本研究通過(guò)研究Mel1amRNA和受體蛋白在不同組織的表達(dá)分布，為研究褪黑素及其受體的生理功能如調(diào)控晝夜節(jié)律，抗凋亡、抗應(yīng)激、增強(qiáng)免疫力、卵母細(xì)胞成熟以及胚胎的發(fā)育探究提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Study on expression of melatonin receptor Mel1a in several duck tissues

WANG Shu-juan1， LIU Wen-ju1， LIU Xiao-li2， WANG Li-ke1， PANG Xun-sheng1

(1.CollegeofAnimalScience，AnhuiScienceandTechnologyUniversity，F(xiàn)engyang233100，China; 2.CollegeofAnimalScience，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

Melatonin is an indole hormone secreted by the pineal gland， and involved in regulating the circadian， seasonal reproduction， antioxidant activity and anti-apoptosis. The present study investigated the expression， distribution and relative expression quantity ofMel1amRNA and Mel1a protein in different organs of duck， which laid the foundation for further study on regulating effect of melatonin on the reproductive physiology and other biological function. In this study， we collected the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. The expression of Mel1a in duck tissues were detected by the methods of PCR and immunohistochemical techniques at mRNA and protein levels. TheMel1amRNA relative expression quantities in different organs were detected by real-time PCR. The major results were described as follows:Mel1amRNA was expressed in the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. Mel1a protein was expressed in the brain， lung， liver， muscle， kidney， heart and pancreas tissues of duck. Moreover， real-time quantitative PCR was used to detect the relative expression level ofMel1agene in different tissues and the gene expression level in brain was selected as a baseline. The quantitative results showed thatMel1agene had high expression levels in brain， lung， ovary， spleen， cerebellum and pancreas and low levels in kidney， liver， muscle and heart. Melatonin plays an important role in physiological regulation function by binding to its receptors and it is very important to study the melatonin receptor expression and distribution， which are useful to elucidate the role and mechanism of melatonin on circadian rhythm， anti-apoptosis， antioxidant activity， enhancing immunity， oocyte maturation and embryo development.

duck; Mel1a; immunohistochemistry; tissue expression; fluorescent quantitative PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.05

2016-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301972)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308085QC66)；安徽省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(kj20136077)

王淑娟(1983—)，女，山東菏澤人，博士，講師，從事動(dòng)物生殖生理與繁殖研究。E-mail：wangshujuan2012@hotmail.com

S834

A

1004-1524(2016)06-0928-07

王淑娟，劉文舉，劉曉麗，等. 褪黑素受體Mel1a在鴨不同組織中的表達(dá)研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(6)： 928-934.