楊澤曉，劉常鈺，王 印，姚學(xué)萍，鄔旭龍，王 波，李桂黎，蒙正群，劉亞東

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 四川 溫江 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

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一株鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株的分離鑒定及其血清型鑒定相關(guān)基因的克隆

楊澤曉1，2，劉常鈺1，王 印1，2，姚學(xué)萍1，鄔旭龍1，王 波1，李桂黎1，蒙正群1，劉亞東1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院， 四川 溫江 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

為探索某鵝場鵝巴氏桿菌病疫情發(fā)生的原因，采集初診為鵝巴氏桿菌感染病例的肝臟、心臟等樣品進行細菌分離純化，經(jīng)過染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗、種與血清型PCR鑒定、致病性試驗和藥敏試驗等進行鑒定，并根據(jù)GenBank中多殺性巴氏桿菌血清型相關(guān)基因設(shè)計引物進行其血清型相關(guān)基因的克隆分析。結(jié)果顯示，分離到1株莢膜A型鵝源多殺性巴氏桿菌，屬于多殺亞種，血清型Ⅰ型，具有較強致病性，對實驗小鼠最小致死量為5 cfu。該分離菌株具有多重耐藥性，僅對頭孢三嗪、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢唑肟和氟苯尼考5種藥物敏感。成功克隆的該分離菌株莢膜合成相關(guān)基因hyaD-hyaC的開放閱讀框4 155 bp，與已發(fā)布基因序列同源性高達99%；血清型Ⅰ型PCR的擴增基因片段303 bp，與巴氏桿菌C48-1株擴增基因片段序列完全相同。綜上，該株血清型Ⅰ型莢膜A型的鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株，是鵝場疫情發(fā)生的病原，克隆的莢膜合成相關(guān)基因和菌體血清型特異性基因遺傳相對穩(wěn)定。

鵝；多殺性巴氏桿菌；血清型； PCR鑒定

鵝巴氏桿菌病(goose pasteurellosis)又稱鵝霍亂，是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida， Pm)引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病[1-2]。隨著近些年我國養(yǎng)鵝業(yè)的不斷發(fā)展，有關(guān)鵝巴氏桿菌病的報道不斷增多[3-4]。

鵝巴氏桿菌病的發(fā)生機理尚不清楚，傳播途徑復(fù)雜多樣，流行也無明顯季節(jié)性，常會受到天氣劇變、臺風(fēng)、合群、長途運輸?shù)韧饨缫蛩氐挠绊?，該病一旦流行，很難查出傳染源，且往往會反復(fù)發(fā)生[5]。該病發(fā)病急、死亡快，其發(fā)病率和死亡率因飼養(yǎng)管理、病原毒力等方面不同而存在差異。據(jù)不完全統(tǒng)計，發(fā)病率可高達35%，死亡率高達70%，如果出現(xiàn)混合感染，死亡率可能更高[6-7]。加上Pm的血清型比較復(fù)雜，不同血清型間又缺乏交叉免疫保護作用，以及Pm菌株耐藥現(xiàn)象，Pm感染的控制難度在不斷增加[8]，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。

劉加波等[9]采用RAPD技術(shù)對9株禽Pm廣西分離株和3株參考株DNA的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，廣西流行Pm菌株呈現(xiàn)多樣性，且與標(biāo)準(zhǔn)Pm強毒株存在差異。近些年我國分離到F型Pm[10]，這表明我國Pm感染情況呈現(xiàn)越來復(fù)雜的趨勢。2013年7月，四川某鵝場發(fā)生疫情，育成肉鵝出現(xiàn)急性死亡，死亡率15%左右。筆者通過對送檢病死鵝只臨床癥狀、剖檢病變初診，認(rèn)為屬鵝巴氏桿菌病，然而與畜主陳述曾免疫接種過巴氏桿菌疫苗的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果出現(xiàn)了較大偏差。為探索是否出現(xiàn)Pm的變異導(dǎo)致免疫失敗，并明確引發(fā)此次典型鵝霍亂疫情的原因，本研究在對病例剖檢基礎(chǔ)上無菌采集肝臟、心臟等材料進行細菌分離和純化，通過染色鏡檢、培養(yǎng)特性、生化試驗、藥敏試驗、動物致病試驗和分子生物學(xué)技術(shù)對分離株進行了鑒定，并對分離菌株的血清型相關(guān)基因進行了克隆分析，以期為鵝巴氏桿菌病的防控提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、菌種與試驗動物

營養(yǎng)瓊脂，標(biāo)準(zhǔn)藥敏試紙和微量生化試管，購自杭州微生物試劑有限公司；DNA marker DL2000和pMD19-T載體購自成都飛克(天泰)科技有限公司；2×TaqPCR Mastermix 、瓊脂糖和TIANgel Midi Purification Kit(DP209)等購自成都安雅生物試劑有限公司；15日齡健康雛鵝6只、體質(zhì)量25 g雌性KM小鼠35只、鵝源大腸埃希菌、Pm參照株 P1059、C48-1由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫研究室提供。

1. 2 引物設(shè)計合成

根據(jù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)已公布的Pm基因序列，參考相關(guān)文獻[11-13]進行Pmkmt1基因的種特異性引物(P1/P2)、莢膜型分型引物(針對A，B，D，E，F(xiàn)莢膜型特異性基因hyaD-hyaC，bcbD，dcbF，ecbJ，fcbD擴增的A1/A2，B1/B2，D1/D2，E1/E2，F(xiàn)1/F2，A3/A4，A5/A6)和Pm血清Ⅰ型引物(F/R)篩選設(shè)計(表1)，送往北京華大科技有限公司合成，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol·L-1，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 臨床剖檢

按常規(guī)方法對送檢病鵝進行剖檢，觀察臟器病理變化，并無菌采取病料以進行細菌分離鑒定。

表1 Pm分離鑒定PCR用擴增引物

Table 1 The PCR primers for Pm identification

項目與引物編號引物序列(5’→3’)產(chǎn)物大小/bp參考文獻 Kmt1基因[11]P1ATCCGCTATTTACCCAGTGG456P2GCTGTAAACGAACTCGCCAC 莢膜血清群[12]A1TGCCAAAATCGCAGTCAG1044A2TTGCCATCATTGTCAGTGB1CATTTATCCAAGCTCCACC760B2GCCCGAGAGTTTCAATCCD1TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCCC657D2CATCTACCCACTCAACCATATCAGE1TCCGCAGAAAATTATTGACTC511E2GCTTGCTGCTTGATTTTGTCF1AATCGGAGAACGCAGAAATCAG852F2TTCCGCCGTCAATTACTCTG Pm血清型Ⅰ型[13]FAAGGGGATGGGTTTAGAGCCAGT303RAAGGGGATGGGTTTAGAGCCAGT hyaD-hyaC基因A3ATGAATACATTATCACAAGC2147AF067175A4CTGACTGCGATTTTGGCAA5CACTGACAATGATGGCAA998A6TTAAGCATCACCGCCAAA

1.4 病原菌分離鑒定

1.4.1 細菌分離純化

按照文獻[4]進行綿羊鮮血平板等培養(yǎng)基的制作，將無菌采取的心臟、肝臟、脾臟等病變組織接種于血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況，挑菌后革蘭染色鏡檢，通過平板劃線法進行細菌純化，進行瑞氏染色鏡檢。

1.4.2 培養(yǎng)特性與生化試驗

取分離菌株純培養(yǎng)物，接種于鮮血平板、血清平板、普通平板、麥康凱平板，觀察細菌培養(yǎng)特性，并根據(jù)微量生化發(fā)酵管說明書分別接種葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、蕈糖、山梨醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露醇、硫化氫、尿素酶、VP、賴氨酸和鳥氨酸等生化管，同時挑單個菌落進行觸酶試驗和氧化酶試驗。

1.4.3 PCR鑒定

(1)Pmkmt1基因PCR

根據(jù)鵝只剖檢病變、細菌染色鏡檢和生化試驗的結(jié)果，以P1/P2為引物，按照文獻[11]中反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行分離菌株的kmt1基因PCR鑒定，同時以Pm 參照株P(guān)1059、C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。

(2)莢膜血清群PCR鑒定

以A1/A2，B1/B2，D1/D2，E1/E2和F1/F2為引物，采用文獻[12]中血清群多重PCR方法進行分離菌株莢膜血清群鑒定，同時以Pm 參照株P(guān)1059，C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。

(3)血清型Ⅰ型PCR鑒定

以分離菌株純培養(yǎng)物為模板，按照參考文獻[13]中PCR方法進行分離菌株的血清型鑒定，同時以Pm 參照株P(guān)1059，C48-1和鵝致病性大腸埃希菌為對照。反應(yīng)體系為2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，引物F和R 各1.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4.4 動物試驗

[10]方法，將分離菌株在血平板上培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水沖洗菌苔， 參照麥?zhǔn)媳葷岱y定菌液濃度后，稀釋至5×108cfu·mL-1，分別進行鵝致病性試驗和小鼠致病性研究。

(1)鵝致病試驗

將6只雛鵝飼養(yǎng)3 d后，隨機分為2組，每組3只。試驗組雛鵝腹腔注射分離菌株稀釋物0.3 mL，對照組雛鵝腹腔注射生理鹽水0.3 mL。連續(xù)7 d觀察雛鵝發(fā)病、死亡情況，并及時采集病死鵝心臟、肝臟、脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

(2)小鼠致病性試驗

將10只小鼠隨機分為2組，每組5只，試驗組腹腔注射分離菌株稀釋物(每只0.2 mL)，對照組注射生理鹽水(每只0.2 mL)。連續(xù)7 d觀察小鼠發(fā)病、死亡情況，并及時采集病死小鼠脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

(3)小鼠最小致死濃度(MLD)測定

用無菌生理鹽水對分離菌株稀釋物繼續(xù)進行梯度稀釋，并采用平板法進行cfu計數(shù)，使其濃度分別為5 000，500，50和25 cfu·mL-1，將25只小鼠隨機分為5組，每組5只，分別腹腔注射不同濃度菌液或生理鹽水，每只0.2 mL。連續(xù)7 d觀察發(fā)病、死亡情況，并及時采集病死小鼠脾臟樣品進行抹片鏡檢和細菌分離鑒定。

1.5 藥敏試驗

按參考文獻[4]操作，采用Kirby-Bauer法檢測分離菌株對30種常用抗菌藥物的敏感性，結(jié)果根據(jù)藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)(WS/T125—1999)進行敏感性的判定。

1.6 分離菌株血清型鑒定基因的克隆分析

1.6.1 hyaD-hyaC基因的克隆分析

(1)hyaD-hyaC基因PCR擴增

根據(jù)莢膜血清群鑒定結(jié)果，設(shè)計合成莢膜生物合成相關(guān)基因hyaD-hyaC序列的PCR引物(表1)，分別以A1/A2，A3/A4，A5/A6為引物進行分離Pm菌株hyaD-hyaC基因的擴增。PCR反應(yīng)體系為 2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，上下游引物各1.5 μL，菌液模板2.0 μL，ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

(2)hyaD-hya基因的克隆分析

根據(jù)TIANgel Midi Purification Kit(DP209)說明書分別純化回收預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行序列測定，最后將測序結(jié)果用DNAStar軟件拼接后進行BLAST同源性分析。

1.6.2 血清型Ⅰ型鑒定基因的克隆分析

按照1.6.1節(jié)中⑵的方法，分別純化回收1.4.3節(jié)Pm分離菌株和C48-1株血清型Ⅰ型PCR鑒定產(chǎn)物，送往北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行序列測定，最后將測序結(jié)果進行BLAST同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病鵝剖檢病變

剖檢可見，病鵝呈現(xiàn)急性禽霍亂的特征性病理變化，腹膜、氣囊大量點狀出血(圖1-A)，心包大量淡黃滲出液，心肌與心冠脂肪有點狀出血(圖1-B)；氣管表面充血和有出血點(圖1-C)、肺臟充血和點狀出血；肝臟稍腫大，質(zhì)脆，棕色或者淡黃色，表面有大量白色或淡黃色針尖大小壞死點(圖1-B—D)；脾臟淤血腫大，也可見淡黃色或白色大小不等壞死點(圖1-E)；消化道尤其十二指腸充血，呈卡他性或出血性炎癥(圖1-F)。

2.2 病原菌分離鑒定

按照1.4.1節(jié)和1.4.2節(jié)操作進行病變組織中細菌的分離純化及分離菌株的培養(yǎng)特性觀察和生化試驗，結(jié)果分離到1株兩端鈍圓、兩極濃染、革蘭陰性小桿菌(圖2-A—B)；該菌在鮮血平板和血清平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，可以見到大小不一的淡灰白色、濕潤、露珠樣菌落(圖3-A)，在白光45度照射下菌落呈現(xiàn)藍綠色熒光和橙色熒光(圖3-B)，無溶血性(圖3-A)，也可在普通平板上生長，但在麥康凱平板上不能生長。生化試驗結(jié)果顯示該菌株可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、山梨醇和蕈糖；觸酶試驗(圖3-A)和氧化酶試驗陽性；不發(fā)酵麥芽糖、菊糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、肌醇和甘露醇；硫化氫、尿素酶、VP、賴氨酸和鳥氨酸反應(yīng)陰性。這與多殺性巴氏桿菌多殺亞種培養(yǎng)特性和生化特征[7]相符合。

按照1.4.3節(jié)操作分別進行了分離菌株kmt1的PCR擴增、Pm莢膜血清型PCR鑒定和血清型Ⅰ型鑒定，結(jié)果如圖4所示。分離菌株與Pm對照菌株P(guān)1059，C48-1的kmt1基因PCR和Pm莢膜血清型PCR均擴增出456 bp(圖4泳道1，2,3)和1 044 bp(圖4泳道5，6，7)預(yù)期長度的DNA條帶，而鵝大腸埃希菌對照無特異性擴增(圖4泳道4，8)；分離菌株與C48-1的血清型Ⅰ型PCR擴增出303 bp(圖4泳道9，10)預(yù)期大小條帶。鵝大腸埃希菌和P1059菌株均無擴增(圖4泳道11，12)，因此鑒定該分離菌株為鵝源莢膜A型多殺性巴氏桿菌，血清型Ⅰ型，并將其命名為GHaiNPm2012株。

A， 氣囊、漿膜出血；B， 心臟點狀出血；C， 氣管出血；D， 肝臟壞死點；E， 脾臟壞死結(jié)節(jié)；F， 十二指腸出血圖1 病鵝的剖檢病理變化Fig.1 The pathological anatomy changes of sick geese

A， 革蘭染色結(jié)果； B， 瑞氏染色結(jié)果圖2 染色鏡檢(1 000×)Fig.2 The morphological examination (1 000 ×)

按照1.4.4節(jié)操作進行Pm分離株的動物致病性試驗，結(jié)果顯示，攻菌試驗組的雛鵝和小鼠都在2 d全部死亡，剖檢以臟器出血性病變?yōu)橹?，取肝臟涂片鏡檢可以觀察到兩極濃染革蘭陰性小桿菌，經(jīng)過細菌分離鑒定重新獲得該菌，對照組無異常表現(xiàn)。這表明該分離菌株GHaiNPm2012株對鵝和小鼠具有較強的致病性，也是該鵝場發(fā)生疫情的病原。

小鼠最小致死濃度(MLD)測定試驗顯示：生理鹽水對照組小鼠正常，除25 cfu·mL-1攻菌組小鼠死亡2只外，其他攻菌劑量組小鼠均在2 d內(nèi)全部死亡，且取病死小鼠脾臟樣品又重新分離鑒定到該菌，因此，該菌的小鼠MLD為5 cfu。

A， 血平板培養(yǎng)特性； B， 血清平板菌落熒光圖3 Pm分離株培養(yǎng)特性Fig.3 Cultured characteristics of the Pm isolate

1，2，3，4分別為Pm isolate，C48-1，P1059和鵝大腸埃希菌的kmt1基因PCR產(chǎn)物；5，6，7，8分別為Pm isolate，C48-1，P1059和鵝大腸埃希菌的莢膜型PCR鑒定產(chǎn)物；9，10，11，12分別為Pm isolate，C48-1，P1059和鵝大腸埃希菌的血清型1型PCR鑒定產(chǎn)物圖4 分離菌株kmt1基因、莢膜型和血清型Ⅰ型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of the kmt1 gene， capsular-serotype and serotype 1 for the Pm isolate

2.3 藥敏試驗

按照1.5節(jié)操作進行常用藥物的敏感性試驗，結(jié)果顯示該Pm分離株僅對氟苯尼考、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻吩和頭孢唑肟等5種藥物敏感，對氟哌酸、優(yōu)立新、頭孢噻肟、先鋒必素和先鋒V中度敏感，對鏈霉素、強力霉素、復(fù)方新諾明、痢特靈、慶大霉素、復(fù)方阿莫西林、萬古霉素和潔霉素等藥物耐受。

2.4HyaD-hyaC基因的克隆分析

按照1.6.1節(jié)操作對A型莢膜生物合成相關(guān)基因HyaD-hyaC的PCR，結(jié)果見圖5。擴增出2 147 bp(泳道1)、1 044 bp(泳道2)和998 bp(泳道3)預(yù)期大小的3段特異性DNA條帶，通過序列測定，拼接為4 155 bp，包含軟骨素合成酶(1—2 919 bp)與UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(2 983—4 155 bp)2個開放閱讀框。經(jīng)BLAST分析顯示與CP008918，CP003328，AF067175等已登錄的基因同源性高達99%，表明成功克隆了GPmHaiN2012的hyaD-hyaC基因，測序結(jié)果已提交GenBank，登錄號為KP0336621。

1， 引物A3/A4 PCR產(chǎn)物；2， 引物A1/A2 PCR 產(chǎn)物；3， 引物A5/A6 PCR產(chǎn)物圖5 GHaiNPm2012分離株hyaD-hyaC基因的PCRFig.5 The hyaD-hyaC gene PCR results of GHaiNPm2012

采用MegAlign軟件對克隆序列與CP008918，CP003328，AF067175等序列進行分析，顯示在第49，72，531，1 017，1 089，1 620，1 803和1 908等位點出現(xiàn)18個核苷酸差異，其中第531(A→C)，1 017(T→C)，1 620(T→C)，1 803(T→G)和1 908(T→C)位等5個為新出現(xiàn)變異。推導(dǎo)的氨基酸序列對比分析顯示新出現(xiàn)的突變均在軟骨素合成酶(1—2 919 bp)基因的開放閱讀框內(nèi)，531(A→C)的突變導(dǎo)致氨基酸的變異(L→F)，其他均為同義突變。

2.5 血清型1型鑒定基因的克隆分析

按照1.6.2節(jié)操作分別純化GHaiNPm2012株和C48-1株的血清型1型PCR鑒定產(chǎn)物，并進行測序，2株P(guān)m測序結(jié)果完全一致(圖6)，同源性100%。BLAST同源性分析顯示，目前GenBank中尚無該序列的提交，僅與GenBank中昏睡嗜血桿菌序列(登錄號CP000947等)同源性最高(84%)。

圖6 GHaiNPm2012血清型1型測序結(jié)果Fig.6 The sequencing result of GHaiNPm2012 serotype 1-specific PCR products

3 討論

早期，我國關(guān)于禽霍亂的研究主要是在雞霍亂防控方面，隨著近些年我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，鵝霍亂診治相關(guān)報道不斷增加[3-4]，但主要是集中在傳統(tǒng)診治方面，在鵝源多殺性巴氏桿菌(Pm)的基礎(chǔ)性研究尤其是血清型檢測等方面并不深入，這可能是受到了規(guī)?；B(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展較晚、Pm血清型較多和血清學(xué)鑒定方法自身局限性的影響。本研究在剖檢基礎(chǔ)上，采用常規(guī)微生物學(xué)實驗技術(shù)和PCR技術(shù)，成功分離鑒定到1株高致病性，并具有較強耐藥性的鵝源多殺性巴氏桿菌多殺亞種菌株，深入進行了Pm莢膜型與血清型Ⅰ型的PCR鑒定，及其莢膜合成相關(guān)基因和血清型Ⅰ型鑒定基因的克隆分析，為鵝巴氏桿菌病的防控及相關(guān)研究提供了科學(xué)材料和參考。

目前，Pm血清型表示有2種方式：第1種是根據(jù)間接血凝試驗方法，將Pm分為A，B，C，D，E和F等6個莢膜血清型(群)，同時根據(jù)Pm菌體抗原不同又可以將同一莢膜群Pm分為不同菌體血清型[14]。因此，常用菌體抗原(O抗原，阿拉伯?dāng)?shù)字)：莢膜抗原(K抗原，大寫字母)來表示Pm的血清型。我國禽霍亂Pm主要屬于莢膜A型(群)，以5∶A和8∶A型為主[14]。第2種是用甲醛生理鹽水處理細菌后提取Pm菌體熱穩(wěn)定抗原，利用瓊脂擴散方法(AGP)將Pm分為16個不同血清型[14]，即用菌體熱穩(wěn)定抗原型來表示Pm血清型。這就避免了無莢膜Pm株莢膜型檢測困難、莢膜抗原制作過程復(fù)雜和普通菌體抗原有交叉反應(yīng)等弱點。我國禽Pm血清型調(diào)查結(jié)果顯示，我國流行的強毒禽霍亂Pm的血清型主要是血清型Ⅰ型[14]。有研究顯示，2種血清型表示方式間存在一定對應(yīng)關(guān)系，如Pm的5∶A型(X-73株、C48-1株)、8∶A型(P1059株)分別和血清型Ⅰ型(X-73株、C48-1株)、血清3型(P1059株)相對應(yīng)[15]。本研究采用PCR技術(shù)鑒定Pm分離菌株GHaiNPm2012為莢膜型A型，血清型1型菌株，與文獻[14]中2株鵝源Pm弱毒疫苗株P(guān)TR-780 (14型)、731(15型)的血清型不同。根據(jù)Pm參照菌株C48-1和P1059的PCR結(jié)果和文獻[15]推測，GHaiNPm2012株應(yīng)該是我國主要流行的Pm血清型(5∶A型)，但這與鵝場進行過疫苗接種(常用市售Pm滅活苗疫苗株為5∶A型)相矛盾。然而與國內(nèi)學(xué)者利用Pm自家苗進行免疫取得了理想的預(yù)防效果的報道[7]相一致的是，在進行確診后利用組織滅活苗(自家苗)和綜合措施對此次疫情進行了控制，并且隨后連續(xù)2 a使用該菌株制備的自家苗均有效預(yù)防了該病發(fā)生(未報道)。因此，筆者分析認(rèn)為鵝場發(fā)生鵝霍亂疫情前使用的滅活苗的疫苗株與GHaiNPm2012的血清型存在差異，考慮到血清型Ⅰ型菌株中可能有亞型存在[14]，GHaiNPm2012的血清型更可能是血清型Ⅰ型菌株中的亞型，這一點還有待進一步血清學(xué)研究證實。

本研究在病原菌分離鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，GHaiNPm2012菌株在血清平板菌落帶藍綠色熒光(Fg)，同時發(fā)酵蕈糖和山梨醇，屬于多殺亞種Pm，符合主要針對家畜致病的Pm特征[16]，如果排除畜源Pm感染鵝的可能，就提示著該株禽源Pm可能出現(xiàn)了培養(yǎng)特性、生化特征等性狀的改變，這也可能與本次疫情發(fā)生的免疫失敗有著一定的關(guān)聯(lián)，因為Pm的一些基因表達可能存在一定的宿主特異性[17]。本研究通過雛鵝致病性試驗確定了疫情的病原為GHaiNPm2012，并測定了其對試驗小鼠的MLD為5 cfu，試驗中25 cfu·mL-1攻菌組小鼠死亡2只，可能與組內(nèi)小鼠個體差異有關(guān)，也可能與細菌濃度太低、混合不勻，導(dǎo)致注射菌量差異有關(guān)，但通過多次重復(fù)，50 cfu·mL-1(10 cfu)組小鼠都在48 h全部致死，表明了GHaiNPm2012菌株具有極強的致病性。同時，對作為Pm重要毒力因子的莢膜的合成相關(guān)酶基因hyaD-hyaC進行了克隆分析，結(jié)果擴增出包含軟骨素合成酶(1—2 919 bp)與UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(2 983—4 155 bp)2個開放閱讀框(ORFs) 全長4 155 bp的序列，與GenBank已提交基因同源性高達99%，遺傳相對穩(wěn)定，但MegAlign分析發(fā)現(xiàn)GHaiNPm2012擴增的DNA序列新出現(xiàn)了5處點突變，全部位于軟骨素合成酶(1—2 919 bp)基因ORF內(nèi)，除第531(A→C)位突變外，其他4處均為同義突變。這也可能與GHaiNPm2012菌株在長期宿主適應(yīng)中一些性狀改變具有一定相關(guān)性。另外，藥敏試驗顯示，GHaiNPm2012出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性，對復(fù)方新諾明、鏈霉素、強力霉素、慶大霉素、復(fù)方阿莫西林等10種以上受試藥物耐受，僅對氟苯尼考、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻吩和頭孢唑肟等5種藥物敏感，這點在Pm病防治過程中應(yīng)該引起重視，一定要科學(xué)合理用藥。

值得一提的是，本研究在國內(nèi)首次采用PCR方法[12]對GHaiNPm2012血清型(菌體熱抗原)Ⅰ型鑒定后克隆了其擴增靶基因片段，測序后BLAST分析未檢測到擴增的303 bp基因片段與GenBank中已提交Pm序列的同源性，與巴氏桿菌科相關(guān)的昏睡嗜血桿菌序列(登錄號CP000947等)同源性最高的也僅有84%，其具體原因尚有待探究。同時試驗中設(shè)立的對照菌株C48-1(Ⅰ型)和P1059(3型)擴增結(jié)果與報道的血清型相符合，且GHaiNPm2012株和C48-1株的血清型Ⅰ型PCR鑒定產(chǎn)物測序結(jié)果完全一致，表明研究中進行Pm血清Ⅰ型鑒定的PCR方法還是比較可靠的，這也為國內(nèi)進行鵝Pm的血清型分析等相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Isolation， identification of a virulent strain goosePasteurellamultocidaand gene cloning of its serotype associated genes

YANG Ze-xiao1，2， LIU Chang-yu1， WANG Yin1，2， YAO Xue-ping1， WU Xu-long1， WANG Bo1， LI Gui-li1， MENG Zheng-qun1， LIU Ya-dong1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Wenjiang611130，China)

Goose pasteurellosis， caused by the bacteriumPasteurellamultocida(Pm)， was a major infectious disease of goose in China in recent years. To identify the pathogen of goose disease in a goose-breeding farm， the causes of epidemic situation were investigated. A gram-negative bacillus was isolated and purified from the livers and hearts samples of the sick geese that preliminary diagnosed as pasteurellosis based on clinical symptoms and pathological changes， and it was identified as goosePasteurellamultocidaby morphological and cultured characteristics， biochemical tests， animal pathogenic tests， drug sensitivity tests， species and serotype PCRs and so on. Then its serotype associated genes for serotype PCRs were cloned and analysed. The results showed that the goose Pm isolate had typical morphology and biochemical characteristics ofP.multocidasubsp.multocida， and it belonged to capsular type A and serotype Ⅰ. This Pm isolate had a strong pathogenicity， and its minimus lethal dose (MLD) to mice was 5 cfu. Drug sensitivity tests showed that this isolate was only sensitive to cefatrizine， cefalotin， ceftazidime， ceftizoxime and florfenicol. A capsular biosynthesis associated genehyaD-hyaCabout 4 155 bp in this isolated Pm strain was amplified and sequenced， which shared a 99% homology with the published gene sequences. The serotype Ⅰ PCR target gene fragments about 303 bp of this goose Pm strain and the

train C48-1 were purified and sequenced， the sequencing results were exactly the same. All these results indicated that the goose Pm isolate which had a strong pathogenic and belonged to capsular type A and serotype Ⅰ， was the pathogen of goose disease to be diagnosed. And the amplifiedhyaD-hyaCgene sequences and serotype Ⅰ PCR target gene fragments of this Pm isolate both exhibited relative stability.

goose;Pasteurellamultocida; serotype; PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.06

2015-11-05

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計劃項目(00270401)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B04)

楊澤曉(1980—)，男，河南南陽人，博士，副教授，從事動物疫病防治與獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究。E-mail：yzxyang2003@126.com

S852.61+2

A

1004-1524(2016)06-0935-09

楊澤曉，劉常鈺，王印，等. 一株鵝源多殺性巴氏桿菌強毒株的分離鑒定及其血清型鑒定相關(guān)基因的克隆[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(6): 935-943.