劉澤靜，薛生玲，夏 雪，田玉肖，張 芬，陳 清，湯浩茹，孫 勃

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都611130)

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魚腥草不同部位生物活性物質(zhì)和抗氧化能力分析

劉澤靜，薛生玲，夏 雪，田玉肖，張 芬，陳 清，湯浩茹，孫 勃*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都611130)

為了全面了解魚腥草的營養(yǎng)價值，以其葉片、地上莖和根狀莖為材料，對不同部位的色度、生物活性物質(zhì)和抗氧化能力進行分析。結(jié)果表明：不同部位間的色度、生物活性物質(zhì)含量及抗氧化能力存在顯著差異。葉片正面和地上莖a*值低，b*值高，而葉片背面恰好相反，根狀莖亮度值L*最高。葉綠素、類胡蘿卜素、維生素C、花青素、原花青素、類黃酮和總酚含量與抗氧化能力在部位分布上呈現(xiàn)葉片>地上莖>根狀莖的趨勢。相關(guān)性分析表明，7種生物活性物質(zhì)與抗氧化能力間均呈極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，且亞鐵還原能力法(FRAP)對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均高于總抗氧化能力檢測法(ABTS)(原花青素除外)。進一步與8種常見蔬菜進行比較發(fā)現(xiàn)，魚腥草，特別是葉片部分，含有更為豐富的生物活性物質(zhì)和較高的抗氧化能力，開發(fā)潛力巨大。

魚腥草；不同部位；生物活性物質(zhì)；抗氧化能力

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)又名蕺菜、折耳根、朱碧蓮等，屬三白草科蕺菜屬多年生草本植物[1]，主要生長在中國西南地區(qū)陰冷潮濕的山區(qū)，是當(dāng)?shù)爻Ｒ姷囊环N野生蔬菜，也是衛(wèi)生部確定的藥食兩用植物資源之一[2]。魚腥草全株均可入藥， 《本草綱目》認(rèn)為魚腥草具有“散熱毒癰腫，斷疾解毒”的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實魚腥草對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、流感等均有明顯的抑制作用，還有利尿、抗過敏、鎮(zhèn)咳、止血等功效[1，3]。同時，魚腥草也有很高的食用價值，其葉片、地上莖和根狀莖均可作為食用部位。魚腥草富含維生素C、蛋白質(zhì)、可溶性糖等多種營養(yǎng)成分[1-2，4]，此外，黃酮類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)也廣泛存在于魚腥草中，既影響其風(fēng)味，同時也與保健功能密切相關(guān)，因此是一種營養(yǎng)價值極高的野生蔬菜。

隨著生活水平和健康意識的日益提高，人們對于蔬菜品質(zhì)的認(rèn)識已經(jīng)逐漸從外觀和常規(guī)營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)移到具有抗氧化和抗癌等保健功效的生物活性物質(zhì)[5-10]。目前，國內(nèi)外對魚腥草的營養(yǎng)品質(zhì)和保健價值的研究還較少，現(xiàn)有的研究多是以根狀莖為研究對象[1，4]，并且多局限于常規(guī)營養(yǎng)成分或單一活性物質(zhì)的分析[2，4]，對于魚腥草不同部位的生物活性物質(zhì)和抗氧化能力等的分析鮮有報道。為了系統(tǒng)了解其營養(yǎng)價值，本試驗以魚腥草的不同部位為對象，分析其主要色度、生物活性物質(zhì)含量與抗氧化能力的差異，以期為魚腥草資源開發(fā)和人們?nèi)粘Ｉ攀程峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2013年12月購于雅安雨城區(qū)田貿(mào)農(nóng)產(chǎn)品種植有限公司，挑選處于收獲期的生長健壯，無病蟲害及機械損傷的整株魚腥草4 kg，1 kg作為1個重復(fù)，共4個重復(fù)，迅速運回實驗室。在實驗室中，將魚腥草表面進行清洗擦干，按照葉片、地上莖和根狀莖等3個部位進行分割取樣，各部分樣品分別混勻后用于生物活性物質(zhì)與抗氧化能力的測定。

1.2 測定方法

1.2.1 顏色測定

采用柯尼卡CR-10色差儀對魚腥草葉片正面、背面、地上莖和根狀莖進行測色，測定時將樣品對準(zhǔn)色差儀的集光孔后進行讀數(shù)，記錄其CIE色度系統(tǒng)的明度值(L*)、紅/綠值(a*)、黃/藍值(b*)、飽和度值(C*)值。其中，L*值從0至100表示亮度逐漸增加，a*值從小到大表示紅色增強、綠色減退，b*值從小到大表示黃色增強、藍色減退，C*代表色飽和度[11]。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素和維生素C含量測定

葉綠素和類胡蘿卜素用乙醇溶液提取，分光光度法測定，維生素C含量參照國標(biāo)GB 6195—1986，采用2，6-二氯靛酚滴定法測定。

1.2.3 花青素含量測定

準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品，加入20 mL的含有l(wèi)%鹽酸的甲醇溶液在4 ℃條件下浸提24 h，將提取液稀釋后，在535 nm下測定其吸光度，計算樣品花青素含量[12]。

1.2.4 原花青素含量測定

稱取1.0 g樣品置入50 mL離心管中，室溫條件加入20 mL提取液[V(丙酮)∶V(去離子水)∶V(醋酸)=150∶49∶1]，振蕩1 h。5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清作為原花青素提取液。在酶標(biāo)板上每孔加入DMACA溶液210 μL，樣品70 μL，640 nm下進行吸光度掃描，以原花青素B2為標(biāo)準(zhǔn)品繪制回歸曲線，進而計算各樣品中原花青素的含量[13]。

1.2.5 類黃酮含量測定

稱取1.0 g樣品置入80%丙酮溶液中，室溫下抽提1 h后，4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min，收集上清作為類黃酮提取液。在酶標(biāo)板上每孔分別加入上清液30 μL，95%乙醇90 μL，10%三氯化鋁6 μL，1 mol·L-1醋酸鉀6 μL和去離子水168 μL，室溫反應(yīng)40 min。用酶標(biāo)儀測定415 nm下的吸光度，計算類黃酮含量，以mg·kg-1的槲皮素為單位[14]。

1.2.6 總酚含量測定

將1.0 g樣品在乙醇溶液中充分研磨后定容至25 mL，水浴1 h，7 000 r·min-1離心10 min，吸取上清作為總酚提取液。取提取液0.3 mL分別加入0.2 mol·L-1福林酚溶劑1.5 mL和碳酸鈉溶液1.2 mL，室溫下避光靜置2 h，在760 nm下測量吸光值。用不同濃度的沒食子酸標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總酚的含量[7]。

1.2.7 亞鐵還原能力(FRAP)法測定抗氧化能力

將1.0 g樣品在乙醇溶液中研磨后水浴1 h，7 000 r·min-1離心10 min，吸取上清作為提取液。提取液中加入FRAP工作液(pH 3.6的醋酸緩沖溶液250 mL中加入10 mmol·L-1TPTZ溶液10 mL，20 mmol·L-1三氯化鐵溶液10 mL)2.7 mL，37 ℃水浴10 min，593 nm波長測吸光值。以硫酸亞鐵溶液作為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的抗氧化能力[15]。

1.2.8 總抗氧化能力檢測(ABTS)法測定抗氧化能力

將樣品在乙醇溶液中研磨后水浴1 h，5 000 r·min-1離心10 min，吸取上清作為提取液。在酶標(biāo)板上每孔加入上清液6 μL和ABTS工作液320 μL，室溫反應(yīng)30 s，734 nm下進行吸光度掃描，每3 min掃描記錄1次，共30 min，計算樣品的抗氧化能力[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以4次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件進行，差異顯著性分析和相關(guān)性分析采用SPSS 18.0軟件進行。熱圖分析采用TIGR Mev 4.1軟件完成[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 顏色參數(shù)分析

本試驗中魚腥草葉片正面、背面、地上莖和根狀莖從外觀上呈現(xiàn)綠色、紫紅色、綠紫色和乳白色，進一步采用色差儀對其顏色參數(shù)進行測定。結(jié)果如表1所示：根狀莖亮度值L*最高，顯著高于其他部位，約為其他部位的2倍；葉片正面的a*值最小，其次是地上莖，兩者均小于0，呈現(xiàn)較為明顯的綠色，根狀莖a*值接近于0，呈白色，而葉片背面a*值最高，呈現(xiàn)較強的紅色色度；b*值趨勢與a*值恰好相反，葉片背面的藍色色度最深，其次是根狀莖，葉片正面和地上莖最高，黃度最高；色飽和度C*值趨勢與b*值基本一致。

表1 魚腥草不同部位CIE色度測定值

Table 1 The CIE values in different tissues ofHouttuyniacordata

部位L*a*b*C*葉片正面34.96b-8.10d17.78ab19.58a葉片背面32.36b13.00a6.92c14.92b地上莖33.38b-3.07c20.35a20.63a根狀莖62.13a-0.60b16.75b16.75b

注：同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 生物活性物質(zhì)含量分析

本試驗對魚腥草不同部位中主要生物活性物質(zhì)的含量進行了分析。結(jié)果表明：魚腥草生物活性物質(zhì)含量非常豐富，如葉片中的維生素C、花青素、類黃酮、總酚含量分別高達1 178.7 mg·kg-1，324.6 mg·kg-1，1 977.6 mg·kg-1和4 570.2 mg·kg-1。如表2所示：7種生物活性物質(zhì)的含量在魚腥草植株形態(tài)學(xué)從上到下呈現(xiàn)下降趨勢，在不同部位間存在顯著差異，葉片中的各項生物活性物質(zhì)含量最為豐富，其次是地上莖，根狀莖中含量最低。此外，不同生物活性物質(zhì)在部位間含量差異倍數(shù)也明顯不同，類黃酮在葉片中的含量達到根狀莖的30.95倍，差異倍數(shù)最大，而總酚含量在葉片與根狀莖中相差不足4倍，差異倍數(shù)最小。

各生物活性物質(zhì)在不同部位中的分布情況可以分為3種類型。第1類為維生素C、花青素和總酚，其特點為3個部位間均存在顯著差異；第2類為葉綠素、類胡蘿卜素和類黃酮，其特點為葉片中的含量顯著地高于地上莖和根狀莖，但后兩者間無顯著差異；第3類為原花青素，其特點為葉片和地上莖含量顯著高于根狀莖，但葉片與地上莖間差異不顯著。

2.3 抗氧化能力分析

魚腥草的抗氧化能力采用FRAP法和ABTS法進行測定分析。結(jié)果如表2：魚腥草不同部位間的抗氧化能力存在明顯差異。采用FRAP法測定，結(jié)果表明：葉片的抗氧化能力最強，達到103.6 mmol·kg-1，根狀莖最弱，僅為19.6 mmol·kg-1，葉片抗氧化能力是根狀莖的5.29倍，且不同部位間均差異顯著。采用ABTS法測定，結(jié)果表明：葉片和地上莖的ABTS清除率較高，分別達到74.46%和71.41%，兩者間無顯著差異，根狀莖最低，僅為50.42%，約為葉片含量的2/3。

表2 魚腥草不同部位生物活性物質(zhì)含量與抗氧化能力

Table 2 The contents of bioactive compounds and antioxidant capacity in different tissues ofHouttuyniacordata

部位葉綠素/(mg·kg-1)類胡蘿卜素/(mg·kg-1)維生素C/(mg·kg-1)花青素/(mg·kg-1)原花青素/(mg·kg-1)類黃酮/(mg·kg-1)總酚/(mg·kg-1)FRAP/(mmol·kg-1)ABTS/%葉片654.0a164.8a1178.7a324.6a4807.0a1977.6a4570.2a103.6a74.46a地上莖80.3b29.5b461.0b51.0b4661.1a194.9b2278.7b51.3b71.41a根狀莖41.9b8.9b175.2c17.2c1184.0b63.9b1158.5c19.6c50.42b

2.4 相關(guān)性分析

魚腥草生物活性物質(zhì)與抗氧化能力間的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。所有相關(guān)系數(shù)均為正值，其中葉綠素和類胡蘿卜素的相關(guān)系數(shù)最高，達到0.994。絕大多數(shù)相關(guān)系數(shù)均呈顯著或極顯著水平，僅有的幾個無顯著相關(guān)系數(shù)均與原花青素有關(guān)。FRAP法和ABTS法測定抗氧化能力間相關(guān)系數(shù)為0.825，呈極顯著正相關(guān)，此外，2種方法與各項生物活性物質(zhì)均呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。FRAP法測定對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均大于0.800，均呈極顯著相關(guān)性(原花青素除外)，其中與維生素C相關(guān)系數(shù)最高，達到0.955。值得注意的是，除原花青素外，F(xiàn)RAP法則定與各項生物活性物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均高于ABTS法。

2.5 與常見蔬菜比較分析

為了進一步揭示魚腥草的營養(yǎng)價值，我們將文獻中報道的番茄[18-19]、白菜[18]、結(jié)球甘藍[18，20]、青花菜[21]、蘿卜[22]、胡蘿卜[18-19]、洋蔥[18]和辣椒[18-19，23]等8種常見蔬菜的生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力與魚腥草的進行比較，并以熱圖形式直觀反映(圖1)。結(jié)果表明，不同蔬菜中的生物活性物質(zhì)及抗氧化能力存在明顯差異。辣椒中類胡蘿卜素含量最高，其次是魚腥草葉片、結(jié)球甘藍、胡蘿卜和青花菜，其余幾種蔬菜的含量較低；青花菜、魚腥草葉片和辣椒中維生素C含量較高，其次是魚腥草地上莖和胡蘿卜，其余幾種蔬菜的含量較低；白菜、結(jié)球甘藍、青花菜和魚腥草葉片中葉綠素含量較高，其余幾種蔬菜的含量較低；魚腥草葉片中類黃酮含量最高，其次是白菜、洋蔥、青花菜、辣椒和魚腥草地上莖，其余幾種蔬菜的含量較低；魚腥草三部位中原花青素含量較高，其他蔬菜含量都較低；魚腥草中總酚含量和FRAP值最高，其次是白菜、青花菜和洋蔥，其余幾種蔬菜較低。

表3 魚腥草生物活性物質(zhì)與抗氧化能力間的相關(guān)性

Table 3 Analysis of correlation coefficients among 7 bioactive compounds and 2 antioxidant capacity indexes inHouttuyniacordata

指標(biāo)葉綠素類胡蘿卜素維生素C花青素原花青素類黃酮總酚FRAP值類胡蘿卜素0.994**維生素C0.889**0.874**花青素0.976**0.964**0.948**原花青素0.5480.596*0.579*0.530類黃酮0.928**0.915**0.919**0.978**0.449總酚0.933**0.943**0.929**0.924**0.668*0.857**FRAP值0.880**0.870**0.955**0.927**0.640*0.915**0.906**ABTS值0.616*0.648*0.727**0.629*0.823**0.580*0.799**0.825**

注: *和**分別表示差異達0.05顯著水平和0.01極顯著水平。

每行中顏色由淺到深表示含量從低到高，純白色單元格表示未見文獻報道圖1 魚腥草與幾種常見蔬菜生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力熱圖Fig.1 Heatmap of antioxidant capacity and bioactive compounds in Houttuynia cordata and several common vegetables

3 討論

本試驗測定了魚腥草不同部位的生物活性物質(zhì)含量與抗氧化能力，并與8種常見蔬菜進行了比較。結(jié)果表明，與8種常見蔬菜相比，魚腥草的原花青素、類黃酮和總酚等生物活性物質(zhì)含量極高，并具有很強的抗氧化能力。研究表明，蔬菜不同部位或組織間的生物活性物質(zhì)和抗氧化能力存在明顯差異。本試驗中魚腥草3個部位間在生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力上均存在明顯差異，葉片中的各項生物活性物質(zhì)(原花青素除外)含量及FRAP值均顯著高于地上莖和根狀莖，而原花青素和ABTS值在葉片和地上莖之間無顯著差異。類似的結(jié)果在其他蔬菜中也有報道，如青花菜花球中的可溶性蛋白、還原糖和可溶性固形物含量顯著高于葉片、莖和根系等器官[21]，而同為蕓薹屬蔬菜的青花菜、花椰菜和芥藍等，其葉片的維生素C、葉綠素、類胡蘿卜素和總酚等生物活性物質(zhì)的含量和抗氧化能力均顯著高于花球(花薹)和莖等器官[21，24-25]。

魚腥草因其葉片正面碧色，背面朱色，喜生于陰涼潮濕之地，因此又名“朱碧蓮”。本試驗中對魚腥草不同部位的CIE色度進行了測定，結(jié)果表明葉片正面a*值最小，b*值很高，呈現(xiàn)明顯的綠色和黃色，而葉背正好相反，呈現(xiàn)明顯的紅色和藍色，這種顏色的區(qū)別是由植物內(nèi)部的色素分布不同造成的。不同色素呈現(xiàn)的顏色也不相同，如葉綠素呈現(xiàn)綠色，類胡蘿卜素種類較多，葉片中的類胡蘿卜素以葉黃素和β-胡蘿卜素為主，顏色多為黃色[26]，而花青素根據(jù)種類及環(huán)境的pH值不同，呈現(xiàn)紅色、藍色、紫色等多種顏色[27]。表2結(jié)果表明葉片中含有豐富的葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等有色色素，結(jié)合色度結(jié)果，推測葉片正面葉綠素和類胡蘿卜素含量豐富，葉片背面則富集了花青素，除葉片外，地上莖也積累了較多有色色素。這種分布特點很可能是為了滿足植物生長發(fā)育中的需要及對環(huán)境脅迫適應(yīng)性的體現(xiàn)。葉片正面積累較多的葉綠素和類胡蘿卜素可以保證植物的光合作用，為植株提供能量，葉片背面積累花青素，用以幫助植物適應(yīng)不良環(huán)境?；ㄇ嗨亍⒃ㄇ嗨?、類黃酮和總酚等物質(zhì)已被證明能夠參與植物對病蟲害等生物脅迫和低溫、水分等非生物脅迫的抗性反應(yīng)[6，8，13，27]。而魚腥草的生長環(huán)境陰涼潮濕，易產(chǎn)生各種生物和非生物脅迫，因此，地上部積累較多的生物活性物質(zhì)既是環(huán)境條件的誘導(dǎo)所致，也是一種抗逆表現(xiàn)。

近年來，隨著人們對飲食健康的日益關(guān)注，抗氧化性已成為評價蔬菜內(nèi)在品質(zhì)的一項重要指標(biāo)?？茖W(xué)研究證明，葉綠素、類胡蘿卜素、維生素C、花青素、原花青素、類黃酮和總酚等生物活性物質(zhì)均具有較強的抗氧化性[5-8，13，27]，而抗氧化能力是反映樣品所有抗氧化物綜合效果的指標(biāo)。本試驗中采用的FRAP法和ABTS法是果蔬類生物樣品總抗氧化能力測定中常用的2種方法，其中FRAP法具有原理明確、操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、反應(yīng)時間短等優(yōu)點；ABTS法具有快速簡便、與抗氧化劑的生物活性相關(guān)性強等優(yōu)點[28]。本試驗測定的7項生物活性物質(zhì)含量均與2種抗氧化能力指標(biāo)FRAP值及ABTS值間呈極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系(表3)，結(jié)合前人關(guān)于抗氧化方面的文獻報道結(jié)果，表明本試驗中的7項生物活性物質(zhì)均對魚腥草的抗氧化能力有貢獻。進一步比較2種方法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABTS值與原花青素的分布趨勢相似，相關(guān)系數(shù)也很高，推測原花青素可能對ABTS值貢獻較大，而除原花青素外，F(xiàn)RAP值與各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均高于ABTS值，這種現(xiàn)象在其他果蔬中也有報道[22，28]，造成這種現(xiàn)象的原因可能是2種方法抗氧化的作用原理及果蔬種類不同。這一結(jié)果也表明，F(xiàn)RAP法更適用于魚腥草抗氧化能力測定。

魚腥草是我國西南地區(qū)常見的極具特色的野生蔬菜。本研究表明，魚腥草含有豐富的生物活性物質(zhì)和抗氧化能力，在部位分布上呈現(xiàn)形態(tài)學(xué)從上到下含量逐漸下降的趨勢，即葉片>地上莖>根狀莖。相關(guān)性分析結(jié)果表明，7種生物活性物質(zhì)有助于提高魚腥草的抗氧化能力，而且FRAP法可能更適合用于魚腥草的抗氧化能力測定。通過與8種常見蔬菜的比較發(fā)現(xiàn)，魚腥草，特別是魚腥草葉片部分，含有更為豐富的多種生物活性物質(zhì)和較高的抗氧化能力，是人們?nèi)粘Ｉ攀硵z取維生素C等活性物質(zhì)的可靠來源。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Analysis of bioactive compounds and antioxidant capacities inHouttuyniacordata

LIU Ze-jing， XUE Sheng-ling， XIA Xue， TIAN Yu-xiao， ZHANG Fen， CHEN Qing， TANG Hao-ru， SUN Bo*

(CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In order to understand the nutritional values ofHouttuyniacordata， the CIE color values， bioactive compounds contents and antioxidant capacities among different organs (leaves， stems and rhizomes) inHouttuyniacordatawere investigated in the present study. The results showed that significant differences were found among different tissues. The adaxial leaf surface and stems owned lowera*value and higherb*value， while the abaxial leaf surface was on the contrary， and the rhizomes had the highestL*value. The levels of chlorophyll， carotenoids， vitamin C， anthocyanins， proanthocyanidins， flavonoids， total phenolics and antioxidant capacities were followed as the trends of leaves> stems > rhizomes. Moreover， significant or extremely significant(P<0.05) positive correlations were found between antioxidant capacities and each bioactive compound. In addition， all the correlation coefficients associated with FRAP were higher than the corresponding values with ABTS， except proanthocyanidins. Then the levels of bioactive compounds and antioxidant capacities were compared betweenHouttuyniacordatawith eight kinds of common vegetables. The results showed thatHouttuyniacordata， especially leaves， contained more abundant bioactive compounds and antioxidant capacity， indicatingHouttuyniacordatahas great potential for development of functional vegetable.

Houttuyniacordata; different tissues; bioactive compounds; antioxidant capacities

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.14

2015-10-09

四川省教育廳重點項目(14ZA0016)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科質(zhì)量工程項目(04052109)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科論文培育計劃項目(06309007)

劉澤靜(1984—)，女，四川攀枝花人，碩士，講師，從事園藝植物遺傳育種研究。E-mail：liuzejing@sicau.edu.cn

*通信作者，孫勃，E-mail：14099@sicau.edu.cn

S647

A

1004-1524(2016)06-0992-07

劉澤靜，薛生玲，夏雪，等. 魚腥草不同部位生物活性物質(zhì)和抗氧化能力分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(6)： 992-998.