凡軍民+李靜+賈君+謝春芹+謝正林
摘要:分別采用熱水提取法、酶法、微波法、堿法4種不同方法提取草菇多糖,并對其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明:不同方法提取的草菇多糖對·OH、DPPH·都較強(qiáng)的清除作用;纖維素酶法、微波法是較佳的2種提取抗氧化草菇多糖的方法,其多糖均具有較強(qiáng)的抗氧化、還原能力。
關(guān)鍵詞:草菇;多糖;提取方法;抗氧化性
中圖分類號(hào): S646.1+30.1;O629.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2016)09-0323-03
草菇(Volvariella volvacea)菇肉脆嫩,味道鮮美,營養(yǎng)價(jià)值高,是食用菌中栽培方法最簡單、出菇最快、原料最豐富、最可口的食用菌之一。早在300年前,我國已經(jīng)進(jìn)行草菇的人工栽培,后由華僑傳到世界各國成為第3大栽培食用菌。我國草菇年產(chǎn)量高于3萬t,占全世界總產(chǎn)量的70%~80%,居世界之首,故國際上稱其為“中國蘑菇”[1]。
草菇中抗氧化活性成分已有一些報(bào)道[2-4],主要有總酚類、多糖類、三萜類、黃酮類化合物等。Cheung等采用3種不同方法評價(jià)草菇的甲醇提取物和水提取物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn),水提取物的抗氧化活性高于甲醇提取物,其抗氧化活性與總酚含量有關(guān)[3]。趙俊霞等用不同有機(jī)溶劑對草菇培養(yǎng)液及菌絲體中的代謝成分進(jìn)行分離提取,代謝提取物均有較高的 DPPH·清除率,即較高的抗氧化活性,其有效成分含有粗三萜、黃酮類物質(zhì)[4]。
本研究通過熱水提取法、酶法、微波法、堿法4種不同提取方法對草菇多糖進(jìn)行提取,并測定其體外抗氧化活性,探討不同提取方法對草菇多糖清除自由基能力的影響,旨在尋找最佳的提取方法,為草菇的精深加工提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
供試材料:草菇子實(shí)體,購于農(nóng)貿(mào)市場。
試劑:95%乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、維生素C、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、鄰苯三酚、無水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸(trichloroacetic acid,簡稱TCA)、氯化鐵、甲醇、氯化亞鐵、乙二胺四乙酸(EDTA),均為國產(chǎn)分析純;1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,美國Sigma公司),菲洛嗪(Ruibio進(jìn)口分裝)。
儀器:賽多利斯電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);TDL-5A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司);UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)(北京中教金源科技有限公司);LGJ-12普通型冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。
1.2 草菇多糖提取工藝流程
草菇→預(yù)處理→不同方法提取→減壓濃縮→乙醇沉淀→透析→冷凍干燥→草菇多糖。
1.3 草菇多糖提取方法
1.3.1 草菇的預(yù)處理 新鮮草菇子實(shí)體洗凈、去雜、切塊,置于105 ℃烘箱滅活10 min;65 ℃烘干、粉碎,得到草菇碎屑;95%乙醇室溫過夜,浸提3次,過濾,殘?jiān)胖糜陉帥鎏庯L(fēng)干待用。
1.3.2 熱水提取法 取預(yù)處理的草菇干制品,按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水,沸水提取1 h,過濾。按照“1.3.1”節(jié)中的步驟共提取2次,合并提取液。
1.3.3 酶法提取法 取預(yù)處理的草菇干制品,按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水,纖維素酶、蝸牛酶加入量為0.35%(質(zhì)量體積比),50 ℃提取90 min,升溫至90 ℃滅活酶,過濾,得提取液。
1.3.4 微波提取法 取預(yù)處理的草菇干制品,按料液比1 g ∶20 mL 加入蒸餾水,乳化10 min,微波處理功率為490 W,提取8 min,過濾。按照“1.3.1”節(jié)中的步驟共提取2次,合并提取液。
1.3.5 堿法提取 取水提后草菇殘?jiān)?,按照料液? g ∶10 mL 加入0.5 mol/L NaOH溶液,于4 ℃提取2次,每次4 h,過濾,濾液中加入3 mol/L HCl,調(diào)pH值至7.0。
1.3.6 提取多糖的濃縮干燥 將提取液于60 ℃減壓濃縮至原體積的1/10,4 000 r/min離心10 min,去除沉淀;在濃縮液中緩緩加入95%乙醇,使?jié)饪s液與乙醇體積比為1 ∶4;靜置過夜,離心,沉淀物用蒸餾水溶解,溶解液透析(分子截留量為10 ku),冷凍干燥,分別得到水提多糖WPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、微波提多糖MPF75、堿提多糖APF75。
1.4 草菇多糖的含量測定
多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法,參照2005年版《中華人民共和國藥典》。
1.5 抗氧化活性的測定
1.5.1 · OH清除活性的測定[5]分別吸取1.0 mL各濃度樣液,依次加入3.0 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、3.0 mL1 mmol/L H2O2溶液,靜置10 min。再加入3 mL 6 moL/L水楊酸溶液,37 ℃水浴30 min,在510 nm處測定吸光度D510 nm,以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式:
清除率=[1-(Di(510 nm)-Dj(510 nm))/D0(510 nm)]×100%。
式中:Di(510 nm)為不同多糖濃度下的吸收度;Dj(510 nm)為用蒸餾水代替水楊酸時(shí)測得的不同多糖濃度本底吸光度;D0(510 nm)為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行測3次,求清除率的平均值。
1.5.2 清除活性測定[6]取4.5 mL50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH值=8.2),加入1.0 mL各濃度樣液,25 ℃水浴20 min,立即加入0.4 mL于25 ℃預(yù)熱過的25 mmol/L鄰苯三酚溶液,25 ℃水浴5 min。加入1 mL 8 mmol/L HCl 終止反應(yīng),在320 nm處測定吸光度D320 nm,以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式:
清除率=[1-Di(320 nm)/D0(320nm)]×100%。
式中:Di(320 nm)為不同多糖濃度下的吸光度;D0(320 nm)為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行做3次,求清除率的平均值。
1.5.3 DPPH·清除活性測定[5]分別吸取4.0 mL各濃度樣液與0.2 mmol/L DPPH溶液,加入具塞試管中搖勻,黑暗條件下于37 ℃放置30 min,3 000 r/min離心10 min,取上清液于517 nm處測吸光度D517 nm,以維生素C作陽性對照。清除率計(jì)算公式:
清除率=[1-(Di(517 nm)-Dj(517 nm))/D0(517 nm)]×100%。
式中:Di(517 nm)為不同多糖濃度下的吸光度;Dj(517 nm)為用無水乙醇代替DPPH溶液時(shí)測得的不同多糖濃度本底吸光度;D0(517 nm)為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。每個(gè)濃度平行測3次,求清除率的平均值。
1.5.4 還原力測定[7]取2.5 mL各濃度樣液,各加入2.5 mL 0.2 moL/L磷酸鹽緩沖液(pH值6.6)、1%K3Fe(CN)6 溶液,混勻后于50 ℃水浴20 min。加入2.5 mL 10% 三氯乙酸溶液終止反應(yīng),3 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液,分別加入5.0 mL蒸餾水、1.0 mL 0.1% FeCl3,靜置10 min,在700 nm處測定吸光度D700nm,每個(gè)濃度平行測3次,以維生素C作陽性對照。
1.5.5 對金屬離子螯合活性測定[7]取1.0mL各濃度樣液,分別加入3.7 mL甲醇、0.1 mL 2 mmol/L FeCl2、0.2 mL5 mmol/L 菲洛嗪,25 ℃反應(yīng)10 min后,于562 nm處測定吸光度D562 nm,每個(gè)濃度平行測3次,以EDTA作為對照。金屬離子螯合力計(jì)算公式:
螯合力=[1-Di(562 nm)/D0(562 nm)]×100%。
式中:Di(562 nm)為不同多糖濃度下的吸光度;D0(562 nm)為用水代替多糖樣品時(shí)測得的空白對照吸光度。
1.5.6 半抑制質(zhì)量濃度IC50的計(jì)算 以多糖濃度為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo),繪制不同方法提取草菇多糖的清除率曲線。以縱坐標(biāo)的清除率50%作水平線,與清除率曲線相交點(diǎn),即為半抑制質(zhì)量濃度IC50。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同方法提取草菇多糖及其含量測定
提取結(jié)果表明,水提多糖WPF75、微波提多糖MPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、堿提多糖APF75V得率分別為16.92%、15.56%、22.57%、21.38%、1.92%,可見蝸牛酶提多糖SAPF75得率最高,纖維素酶提多糖CAPF75次之,堿提多糖APF75最低。酶能最大限度地釋放胞內(nèi)外游離、部分結(jié)合的多糖成分,因此含量最高;由于水提法的時(shí)間長、次數(shù)多,含量也較高。
2.2 不同方法提取草菇多糖對·OH清除作用的比較
由圖1可知,草菇多糖具有較強(qiáng)的清除·OH作用,在質(zhì)量濃度0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi),5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高;在質(zhì)量濃度0.1~1.0 mg/mL 范圍內(nèi),微波提多糖MPF75與纖維素酶提多糖CAPF75對·OH的清除率均大于陽性對照維生素C,且具有明顯的量效關(guān)系;微波提多糖MPF75、纖維素酶提多糖CAPF75半抑制質(zhì)量濃度IC50分別低于0.10、0.89 mg/mL,陽性對照維生素C的IC50為0.11 mg/mL;在質(zhì)量濃度1.0~5.0 mg/mL 范圍內(nèi),微波提多糖MPF75與纖維素酶提多糖CAPF75對·OH的清除率與陽性對照維生素C相當(dāng),對·OH 自由基的清除率為98.36%。
在質(zhì)量濃度0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi),堿提多糖APF75、水提多糖WPF75、蝸牛酶提多糖SAPF75半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為0.60、2.00、2.75 mg/mL,且具有明顯的量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度1.0~5.0 mg/mL范圍,草菇多糖對·OH的清除作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>堿提多糖APF75>水提多糖WPF75>蝸牛酶提多糖SAPF75。
結(jié)果表明,微波提多糖MPF75和纖維素酶提多糖CAPF75具有較強(qiáng)的清除·OH能力,其能力≥陽性對照維生素C。
2.3 不同方法提取草菇多糖對O-2· 清除活性的比較
由圖2可知,在不同方法提取草菇多糖對O-2· 的清除作用的比較中,只有纖維素酶提多糖CAPF75對O-2· 具有清除作用。蝸牛酶提多糖SAPF75、微波提多糖MPF75、堿提多糖APF75、水提多糖WPF75的清除活性均為0;在質(zhì)量濃度0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi),纖維素酶提多糖CAPF75對O-2· 的清除活性逐漸增強(qiáng),最大清除率為98.32%,且IC50為0.12 mg/mL。結(jié)果表明:僅纖維素酶提多糖CAPF75具有較強(qiáng)的清除O-2· 能力。
2.4 不同方法提取草菇多糖對DPPH·清除活性的比較
由圖3可知,草菇多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH·作用,在質(zhì)量濃度0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi),5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高,且具有明顯的量效關(guān)系;在質(zhì)量濃度0.1~1.0 mg/mL范圍內(nèi),草菇多糖清除DPPH·作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>纖維素酶提多糖CAPF75>水提多糖WPF75>微波提多糖MPF75;在質(zhì)量濃度1.0~5.0 mg/mL范圍內(nèi),草菇多糖對DPPH·的清除作用發(fā)生變化,其作用由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75>纖維素酶提多糖CAPF75>堿提多糖APF75>微波提多糖MPF75。蝸牛酶提多糖SAPF75、水提多糖WPF75、纖維素酶提多糖CAPF75、微波提多糖MPF75的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為0.100、0.460、0.463、0.464 mg/mL。
結(jié)果表明,5種不同方法提取草菇多糖均有較強(qiáng)的清除DPPH·能力,且質(zhì)量濃度越大,其清除率越高。
2.5 不同方法提取草菇多糖還原活性的比較
由圖4可知,草菇多糖具有一定的還原力,在質(zhì)量濃度0.1~1.0 mg/mL的范圍內(nèi),5種不同方法提取草菇多糖清除率隨著質(zhì)量濃度增加而提高,且具有明顯的量效關(guān)系,還原活性由大到小排序?yàn)殛栃詫φ站S生素C>纖維素酶提多糖CAPF75>微波提多糖MPF75>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75。在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí),堿提多糖APF75的還原活性也大于陽性對照維生素C。在質(zhì)量濃1.5~2.5mg/mL范圍內(nèi),5種不同方法提取草菇多糖還原力由強(qiáng)至弱排序?yàn)槔w維素酶提多糖CAPF75>微波提多糖MPF75>陽性對照維生素C>堿提多糖APF75>蝸牛酶提多糖SAPF75>水提多糖WPF75。可見草菇多糖的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關(guān)性,還原能力的高低可以間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱。
結(jié)果表明,纖維素酶提多糖CAPF75和微波提多糖MPF75具有較強(qiáng)的還原能力,反映其抗氧化能力較強(qiáng)。
2.6 不同方法提取草菇多糖金屬子螯合力的比較
由圖5可知,在質(zhì)量濃度為0.1~5.0 mg/mL范圍內(nèi),纖維素酶提多糖CAPF75與微波提多糖MPF75隨質(zhì)量濃度增加對金屬離子螯合力逐漸增加,最大螯合力分別為51.78%、52.77%;水提多糖WPF75與蝸牛酶提多糖SAPF75對金屬離子幾乎無螯合力。在質(zhì)量濃度0.1~2.5 mg/mL時(shí),堿提多糖APF75對金屬子螯合力有1個(gè)平峰,最大螯合力為21.59%。活性物質(zhì)的金屬離子螯合作用一方面可避免重金屬對生物體的危害,有利于人體的健康;另一方面又可螯合對人體重要的金屬離子(鐵、鋅等),可能對人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。
結(jié)果表明,通過控制纖維素酶提多糖CAPF75和微波提多糖MPF75濃度,能夠達(dá)到較理想的金屬離子螯合作用。
3 結(jié)論與討論
由結(jié)果可知,5種不同方法提取的草菇多糖在體外對·OH、DPPH·都有較強(qiáng)的清除作用,其中纖維素酶法和微波法是2種最佳的提取抗氧化多糖的方法,其多糖得率分別為21.38%、15.56%,均具有較強(qiáng)抗氧化能力、還原能力。草菇多糖能夠清除自由基,具有一定的抗氧化作用,有望被開發(fā)成為天然的抗氧化劑,極具開發(fā)潛力和市場前景。
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