蔣國(guó)民+王冬武+鄒利+何志剛+李紹明

摘要：以團(tuán)頭魴滅活精子為誘導(dǎo)，采用熱休克染色體加倍處理方法進(jìn)行錦鯉雌核發(fā)育。錦鯉卵為黏性卵，置于（20±1） ℃室內(nèi)平皿孵化，50 min后開始卵裂，6 h后出現(xiàn)囊胚期，18.67 h后出現(xiàn)原腸胚期，30 h后出現(xiàn)神經(jīng)胚期，39 h 后器官開始形成，約3 d后可以脫膜孵化，孵化率達(dá)68.5%。

關(guān)鍵詞：雌核發(fā)育；早期胚胎；錦鯉；熱休克；脫模；孵化率

中圖分類號(hào)： S961.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0248-03

錦鯉屬鯉形目鯉科鯉魚屬，原產(chǎn)于我國(guó)，后傳入日本[1]，其色彩鮮艷，神態(tài)雍容華貴，觀賞價(jià)值高，是一種高檔觀賞魚，也是一種高度雜合體，花色遺傳機(jī)制復(fù)雜。目前，大部分錦鯉品種主要是通過雜交以及長(zhǎng)期人工選育而得到的。可見，通過純系親本來揭示花色遺傳機(jī)制是目前錦鯉育種方面最亟待解決的問題。因此，雌核發(fā)育在錦鯉選育和親市品種開發(fā)研究方面具有重大意義[2]，它利用滅活的外源精子刺激卵子發(fā)育，再通過人工染色體加倍處理獲得雌核發(fā)育后代，能快速建立遺傳純系，加快發(fā)育速度[3]。目前，我國(guó)水產(chǎn)行業(yè)中鯉[4-5]、草魚[6]、白鯽[7]、虹鱒[8]等10多種魚類進(jìn)行雌核發(fā)育研究，但由于人工雌核發(fā)育的孵化率低，在生產(chǎn)上很難推廣。因此，本試驗(yàn)以錦鯉為母本，以滅活的團(tuán)頭魴精子為外源誘導(dǎo)精子，采用熱休克處理假受精卵，受精卵和孵化率分別可達(dá)56.54%、 68.71%，并定期觀察研究胚胎發(fā)育，為今后錦鯉人工雌核發(fā)育的推廣提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)魚 母本體質(zhì)健壯，腹部膨大，色澤鮮艷，成熟度一致的2+齡錦鯉，來自湖南省漁緣生物有限公司；父本為2+齡性成熟團(tuán)頭魴，來自湖南省漁緣生物有限公司。

1.1.2 藥品 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配制Hanks液，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。催產(chǎn)素于注射前配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 設(shè)備 Olympus顯微鏡及其攝像系統(tǒng)，紫外燈2個(gè)（30 W），燈架，搖床、紗布，溫度計(jì)，加熱棒，雞毛等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 催產(chǎn) 錦鯉親本進(jìn)行2針催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物注射時(shí)間與量根據(jù)當(dāng)時(shí)水溫、親本成熟度、方便操作等多因素來確定，團(tuán)頭魴注射1次，用量為錦鯉親本一半。錦鯉與團(tuán)頭魴分池養(yǎng)殖。

1.2.2 精子滅活[9] 人工擠出團(tuán)頭魴精子（擠之前必須用毛巾擦干凈魚身上的水，沿著胸鰭至泄殖腔輕輕擠壓），立刻加Hanks液，精子 ∶Hanks液=1 ∶4，然后充分搖勻，在培養(yǎng)皿上鋪成約1 mm的液層，放距紫外線15～20 cm處墊有冰板的搖床上處理10～20 min，顯微鏡下定期檢查精子活性。當(dāng)90%精子失去活性時(shí)就停止紫外照射，收集失活精子，貯存碎冰中備用。

1.2.3 雌核發(fā)育[10] （1）受精。撈取發(fā)情錦鯉親本，人工擠出成熟卵粒，快速加入失活精子，用干燥、潔凈的雞毛充分?jǐn)嚢瑁M(jìn)行干法人工假受精。

（2）熱休克。用22 ℃水盡量沖散卵粒，均勻黏附直徑為22 cm 的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，恒溫3 min，然后逐步進(jìn)入41 ℃水體，放置2 min，再逐步回到22 ℃，放置3 min，其后放置室內(nèi)孵化。

（3）胚胎發(fā)育觀察。孵化水溫和室溫維持在（20±1） ℃，孵化用水充分曝氣，每隔2～3 h換水1次，定期剔除死卵，定期用OLYMPUS顯微鏡觀察與攝像胚胎發(fā)育過程，并統(tǒng)計(jì)受精率和胚胎孵化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵裂

受精50 min后，胚盤開始出現(xiàn)第1次分裂，其卵裂速度很快，1 h內(nèi)完成16細(xì)胞期分裂，胚盤開始形成多層，卵裂球越來越小，規(guī)則地排列在胚盤表面，逐漸向胚盤外表推移，并集中在胚盤處形成較為明顯的隆起，形成多細(xì)胞期（圖1）。

2.2 囊胚期

受精6 h后，胚胎細(xì)胞界限開始模糊不清，胚盤在卵黃上呈高峰狀，出現(xiàn)早期囊胚（圖1），進(jìn)入高囊胚期；9.8 h后，細(xì)胞界限消失，囊胚細(xì)胞開始向下方擴(kuò)展，面積不斷擴(kuò)大，囊胚降低，囊胚細(xì)胞逐步平展于卵黃上，胚盤為弓形，形成低囊期。

2.3 原腸胚期

受精18.67 h后，胚層進(jìn)一步向植物極擴(kuò)張，約占整個(gè)胚胎的1/3（圖1）；受精20.17 h后，胚盤下包卵黃1/2，由于細(xì)胞的集中和內(nèi)卷后造成一環(huán)帶形的胚胎和一新月形的缺口，這就是背唇，即原腸期形成的開始（圖1）。21.33 h后，胚盤下包3/5，背唇處又內(nèi)卷及增生的細(xì)胞向中央伸展集中形成球胚盾，前端頭部隆起明顯，形成原腸晚期胚胎（圖1）。原腸期統(tǒng)計(jì)受精率為56.54%。

2.4 神經(jīng)胚期

受精后30 h，胚層細(xì)胞繼續(xù)下包4/5，受精35 h后，囊胚層完全包圍卵黃，胚孔閉合，胚體形成，呈弧形，胚盾中線形成神經(jīng)索，腦部逐漸膨大，出現(xiàn)2個(gè)收縮部分，腦分為前、中、后腦3部分，胚體上神經(jīng)溝兩側(cè)可見5～6對(duì)短柱狀體節(jié)，達(dá)到胚孔封閉期（圖1）。

2.5 器官形成期

受精39 h后，胚體前方兩側(cè)出現(xiàn)橢圓突起的眼泡原基，出現(xiàn)體節(jié)，并隨著時(shí)間的推遲，體節(jié)越來越明顯，受精49 h后，出現(xiàn)眼點(diǎn)，胚體后部肌肉可以輕微扭動(dòng)，可見神經(jīng)脊索（圖1）。受精52 h后，個(gè)別胚體心臟開始微弱跳動(dòng)（圖1）。

2.6 孵化期

受精70～80 h后，胚體活動(dòng)先明顯減弱，然后胚體尾部出現(xiàn)劇烈扭動(dòng)，甚至翻滾整個(gè)胚體，借助尾部擺動(dòng)的力量而沖破卵膜（圖1）。胚體有尾部先沖出卵膜的，也有頭部先沖出卵膜的，從卵膜破裂到胚體完全脫落需要5～10 h，并統(tǒng)計(jì)胚胎孵化率（為68.71%）。剛脫膜而出的魚苗，腹部帶有一橢圓形卵黃囊，2～3 d后消失，魚苗能平游（圖1）。

3 結(jié)論與討論

雌核發(fā)育主要是人工加倍染色體，采取阻止卵子的第2次成熟分裂，或卵子的第2次有絲分裂而使染色體加倍，不同階段染色體加倍處理的雌核發(fā)育后代基因純度不同[6]。熱休克是一種常用的染色體加倍處理方法，用于雌核發(fā)育研究的不多，并且不同魚類和不同染色體加倍處理階段，熱休克起始時(shí)間、所需強(qiáng)度、溫度等均有所不同，孵化率和成活率也較低[11-12]。本試驗(yàn)用遺傳失活的團(tuán)頭魴精子能有效啟動(dòng)錦鯉雌核發(fā)育，采用熱休克處理染色體加倍，較王云等學(xué)者研究結(jié)果[13]來看，可達(dá)到較高的受精卵和孵化率，表明此方法進(jìn)行錦鯉雌核發(fā)育是有效可行的。

試驗(yàn)過程中，胚胎發(fā)育時(shí)間同其他研究學(xué)者研究上有所差異，筆者認(rèn)為可能是有以下幾個(gè)原因造成的：第一，孵化水溫和室溫的差異導(dǎo)致胚胎發(fā)育速度有所改變。胚胎在培養(yǎng)皿發(fā)育過程中，水溫易受到環(huán)境的影響，所以孵化水溫較難控制。第二，雌核胚胎發(fā)育多放在室內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境光照度對(duì)其影響較大。第三，不同品種魚類的胚胎發(fā)育時(shí)間會(huì)有所不同。

團(tuán)頭魴屬鯉科鲌亞科魴屬，染色體數(shù)目2n=48[14]，錦鯉染色體數(shù)目為2n=100，兩者關(guān)系較遠(yuǎn)，外部形態(tài)差異大，理論上雜交個(gè)體不成活[15]。在該研究中，用未經(jīng)遺傳失活的團(tuán)頭魴精子與錦鯉人工受精，有雜交個(gè)體產(chǎn)生，體色黑，外部形態(tài)與團(tuán)頭魴相似，與劉靜霞等研究結(jié)果[16]相悖，其遠(yuǎn)緣雜交出現(xiàn)成活個(gè)體的機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]焦長(zhǎng)軍，侯景軍. 錦鯉的人工繁殖試驗(yàn)技術(shù)總結(jié)[J]. 黑龍江水產(chǎn)，2007（2）：25.

[2]Streisinger G，Walker C，Dower N，et al. Production of clones ofhomozygous diploid zebra fish （Brachydanio rerio）[J]. Nature，1981，291（5813）：293-296.

[3]攀連春. 雌核發(fā)育進(jìn)行銀鯽遺傳育種新進(jìn)展[J]. 生物學(xué)通報(bào)，1994，29（10）：4-6.

[4]Gomelsky B，Cherfas N，Ben-Dom N，et al. Color inheritance in omanmental（Koi）carp（Cyprinus carpio L.）inferred from color variability in normal and gynogenetic progenies[J]. Israeli Journal ofAquaculture-Bamidgeh，1996，48（4）：219-230.

[5]Gomelsky B，Cherfas N，Hulata G. Studies on the inheritance of black patch in omamental（koi）carp[J]. Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh，1998，50（3）：134-139.

[6]李冰霞，羅 琛. 熱休克法抑制第一次卵裂實(shí)現(xiàn)草魚雌核發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2003，27（2）：155-160.

[7]Sun Y D，Zhang C，Liu S J，et al. Induction of gynogenesis inJapanese crucian carp （Carassius cuvieri）[J]. Yi Chuan Xue Bao（Acta Genetica Sinica），2006，33（5）：405-412.

[8]Liu S J，Sun Y D，Zhang C，et al. Production of gynogennetic progeny from allotetraploid hybrids red crucian carp×common carp[J].Aquaculture，2004，236（1/2/3/4）：193-200.

[9]羅 琛，劉 筠. 人工誘導(dǎo)草魚和鯽魚雌核發(fā)育的研究[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，1991，14（2）：154-159.

[10]梁擁軍，孫向軍，史東杰，等. 用團(tuán)頭魴精子誘導(dǎo)紅白錦鯉雌核發(fā)育研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16262-16265，16270.

[11]程漢良，潘黔生，馬國(guó)文，等. 熱休克誘導(dǎo)鯽魚純合雌核發(fā)育二倍體的研究[J]. 水利漁業(yè)，2005，25（3）：25-27，81.

[12]李勝忠，陳 琳，杜勁松. 熱休克誘導(dǎo)虹鱒二倍體雌核發(fā)育[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，1997（05）：8-10.

[13]王 云，劉少軍，易 念，等. 雌核發(fā)育鯽鯉早期胚胎發(fā)育觀察[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（3）：58-61.

[14]李思發(fā). 中國(guó)主要淡水養(yǎng)殖魚類種質(zhì)研究[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998：189-193.

[15]劉靜霞，周 莉，魏麗華，等. 紅白錦鯉人工雌核發(fā)育純系的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2003，27（6）：557-562.