和春庭，張育梅，及 利，楊立學*

(1.云南省怒江傈僳族自治州林業(yè)局，怒江 673100；2.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040)

?

高效液相色譜法測定土壤中2，4-二羥基苯甲酸含量

和春庭1，張育梅1，及 利2，楊立學2*

(1.云南省怒江傈僳族自治州林業(yè)局，怒江 673100；2.東北林業(yè)大學 林學院，哈爾濱 150040)

建立高效液相色譜法(HPLC)測定土壤中2，4-二羥基苯甲酸含量，分析4種不同土地利用方式土壤中2，4-二羥基苯甲酸的垂直分布趨勢。通過用乙酸乙酯水浴24 h提取2，4-二羥基苯甲酸，蒸干并溶解于色譜級甲醇中。以流動相為3%冰醋酸和甲醇(75：25)對樣品進行洗脫，流速1 mL/min，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測波長280 nm，柱溫25℃。結(jié)果表明：2，4-二羥基苯甲酸進樣濃度在80～800 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=13.315X-12.803(r2=0.999 9)；2，4-二羥基苯甲酸的重復性、精密度和穩(wěn)定性，相對標準偏差(RSD)結(jié)果分別為0.778%、1.623%和1.918%，平均加樣回收率為97.675%，RSD結(jié)果為0.771%(n=6)，均達到定性和定量分析的要求。應用高效液相色譜法測定2，4-二羥基苯甲酸含量操作簡便、快速、準確，天然次生林土壤中的2，4-二羥基苯甲酸含量大于其余3種土地利用方式的，且4種土地利用方式皆表現(xiàn)出隨著土層深度的增加，2，4-二羥基苯甲酸含量降低的趨勢。

高效液相色譜法；2，4-二羥基苯甲酸；土地利用方式

0 引 言

人類不同的生產(chǎn)、生活目的決定著土壤的不同利用方式[1]，而土地利用方式對土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分和微生物都有至關(guān)重要的影響[2-7]。在不同土地利用方式轉(zhuǎn)變過程中伴隨著酚酸物質(zhì)的積累，同時，由于不同土地利用方式條件下，地上植被的組成和類型不同以及土壤微生物對地表凋落物的分解作用，造成了不同土地利用方式土壤中酚酸物質(zhì)的差異。國內(nèi)外眾多學者研究表明，酚酸物質(zhì)與微生物關(guān)系密切[8-13]。2，4-二羥基苯甲酸是一種典型的植物次生代謝物質(zhì)，蘇金豹等通過室內(nèi)盆栽試驗向土壤中添加2，4-二羥基苯甲酸等物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)酚酸物質(zhì)對植物菌根侵染率和根系活力有顯著影響[14]。高效液相色譜法(HPLC)具有操作簡便、快速、準確等優(yōu)點，本研究采用HPLC測定土壤中2，4-二羥基苯甲酸含量，通過重復性、精密度、穩(wěn)定性和回收率等指標的評價，為該物質(zhì)在土壤中的含量測定提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與土壤樣品

(1)儀器。高效液相色譜儀(型號Agilent 1200)、電子天枰(型號AE240)、冷凍干燥機(型號FD-1A-50)和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(型號RE-52)。

(2)試劑。2，4-二羥基苯甲酸對照品(上海晶純試劑有限公司，歸一化法計算其純度≥98%)、甲醇，色譜純(美國Dikma公司)。

(3)樣品：土壤樣品于2014年7月采集于黑龍江省五常市山河屯林業(yè)局奮斗林場，分為天然次生林、落葉松人工林、玉米農(nóng)田地和撂荒地等4種不同土地利用方式。

2 色譜條件

流動相：3%冰醋酸∶甲醇=75∶25，流速：1 mL/min，檢測時間：15 min。色譜柱：Agilent ZORBAXSB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，檢測波長：280 nm，柱溫：25℃。在上述條件下，2，4-二羥基苯甲酸與樣品中其他色譜峰基本達到基線分離。2，4-二羥基苯甲酸的保留時間約為5.406 min，如圖1所示。

圖1 2，4-二羥基苯甲酸的保留時間Fig.1.Retention time of 2，4-dihydroxy benzoic acid

3 分析方法與結(jié)果

3.1 溶液的制備

(1)對照品溶液的制備。用天平精密稱取100 mg的2，4-二羥基苯甲酸對照品移入50 mL容量瓶中，加色譜級甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(每1 mL含2，4-二羥基苯甲酸2 mg)。

(2)樣品溶液的制備。將取回的土壤樣品凍干，用天平稱量10 g土移入250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，在90℃條件下連續(xù)水浴12 h，然后取出圓底燒瓶待冷卻后濾出乙酸乙酯與另一圓底燒瓶，重復上述步驟兩次，將混合后的乙酸乙酯在40℃的水溫中旋干蒸發(fā)，直至瓶底形成一層薄膜，瓶壁無液體成股流下，再加5 mL蒸餾水溶解，用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0。量取50 mL乙酸乙酯倒入125 mL分液漏斗，再將上述溶液倒入分液漏斗進行萃取，將得到的乙酸乙酯再次濃縮至干，加入2 mL色譜級甲醇，反復搖勻溶解薄膜，再用5 mL針筒吸出后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得到樣品溶液，并裝入進樣瓶。

3.2 標準曲線的制備

向25 mL容量瓶中分別加入1、2、4、6、8和10 mL的2，4-二羥基苯甲酸對照品貯備液，定容，得到濃度分別為80、160、320、480、640、800 μg/mL的對照品溶液(峰面積分別為1 068.536、2 132.92、4 195.824、6 369.36、8 549.248、10 628.336mAU)，充分搖勻后，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后分別裝入進樣瓶中備用。調(diào)整進樣器進樣量10 μL注入色譜儀，得進樣量X(μg/mL)與峰面積Y的線性方程(圖2)。結(jié)果表明，2，4-二羥基苯甲酸進樣量在80～800 μg/mL與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=13.315X-12.803，r2=0.999 9(n=6)。

3.3 重復性試驗

配制濃度為160 μg/mL 2，4-二羥基苯甲酸對照品溶液，調(diào)整進樣器進樣量10 μL，重復進樣5次，測得色譜峰的峰面積平均值為2 125.667mAU，RSD為0.778%，表明重復性良好，符合分析要求(表1)。

3.4 精密度試驗

精密稱取天然次生林0～5 cm層林地土樣品6份，按樣品測定法重復測定6次，測得2，4-二羥基苯甲酸含量的平均值為43.947 μg/g，RSD 為1.623%，顯示精密度良好，符合分析要求(表2)。

圖2 2，4-二羥基苯甲酸的HPLC進樣量 與峰面積之間的標準曲線Fig.2 Standard curves between the HPLC sample quantity and peak area of 2，4-dihydroxy benzoic acid

次 數(shù)峰面積/mAU峰面積均值/mAURSD/%12137.07222132.92032097.91242123.12052137.3122125.6670.778

表2 天然次生林0-5 cm土壤的2，4-二羥基 苯甲酸含量(n=6)Tab.2 2，4-dihydroxy benzoic acid content in 0-5 cm layer depth of natural secondary forest (n=6)

3.5 穩(wěn)定性試驗

取天然次生林林地土樣品溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h測定2，4-二羥基苯甲酸峰面積，計算峰面積的RSD為1.918%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 準確度實驗(加樣回收試驗)

分別精密稱取6份天然次生林林地土樣品10 g，精密加入160 μg 2，4-二羥基苯甲酸對照品，按樣品溶液制備及測定方法操作，進行高效液相色譜分析，其平均回收率為97.675%，RSD為0.771%，符合分析要求(表3)。

表3 回收率實驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Experimental results of the recovery rate(n=6)

3.7 樣品測定

分別準確稱取天然次生林、落葉松人工林、玉米農(nóng)田地和撂荒地土壤樣品和2，4-二羥基苯甲酸對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，計算含量(表4)。

4 討 論

4.1 不同溶劑的選擇

由于2，4-二羥基苯甲酸微溶于水，選擇色譜級甲醇作為樣品溶解劑，樣品溶解時最好超聲處理，以縮短溶解時間。

4.2 流動相的選擇

不同于其他文獻[15-19]，根據(jù)2，4-二羥基苯甲酸的性質(zhì)，本研究流動相中的水相選用加入刺激性氣味較小的酸性成分冰醋酸，作為離子抑制劑或反相離子對試劑有抑制樣品組分的解離，有改善峰形的作用。經(jīng)過預實驗考察，1%的冰醋酸拖尾明顯，2%冰醋酸的峰形與3%冰醋酸的相當，但采用3%冰醋酸水溶液的pH適合本研究所采用色譜柱的pH范圍，穩(wěn)定了流動相的pH。此故選擇甲醇作為有機相，3%冰醋酸作為水相。以流動相3%冰醋酸∶甲醇=75∶25、65∶35、55∶45分別測定2，4-二羥基苯甲酸對照品的峰值，發(fā)現(xiàn)流動相3%冰醋酸∶甲醇=75∶25的峰形較好，無明顯拖尾現(xiàn)象。

表4 不同土地利用方式土壤各土層中 2，4-二羥基苯甲酸的含量Tab.4 2，4-dihydroxy benzoic acid content in different soil layer in varies land uses

4.3 檢測波長的選擇

選用Waters二級管陣列檢測器進行檢測波長，發(fā)現(xiàn)檢測波長為280 nm時，分離度較好，2，4-二羥基苯甲酸有最大吸收，且基線較平穩(wěn)，峰形適宜，靈敏度高，無其他雜質(zhì)峰干擾。

5 結(jié) 論

采用HPLC法測定了4種不同土地利用方式土壤中的2，4-二羥基苯甲酸含量，試驗優(yōu)化反復對比多次后發(fā)現(xiàn)，采用3%冰醋酸∶甲醇=75∶25的流動相體系能使標準品與其他雜質(zhì)得到有效分離，且提取和測定過程中步驟簡便、省時，出峰時間適宜。該方法的線性范圍、精密度、準確度和回收率都能滿足4種不同土地利用方式土壤中2，4-二羥基苯甲酸的定性和定量分析要求。研究還發(fā)現(xiàn)，天然次生林的2，4-二羥基苯甲酸含量大于其余3種土地利用方式的，且4種土地利用方式皆表現(xiàn)出隨土層深度增加2，4-二羥基苯甲酸含量降低的趨勢。

[1]趙錦梅.不同土地利用方式對高寒地區(qū)水土保持生態(tài)服務功能的影響研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2010.

[2]傅伯杰，郭旭東.土地利用變化與土壤養(yǎng)分的變化——以河北省遵化縣為例[J].生態(tài)學報，2001，21(6)：926-931.

[3]郭旭東，傅伯杰，陳利頂.低山丘陵區(qū)土地利用方式對土壤質(zhì)量的影響[J].地理學報，2001，56(4)：447-455.

[4]Powers J S.Changes in soil carbon and nitrogen after contrasting land-use transitions in Northeastern Costa Rica[J].Ecosystems，2004，7(2)：134-146.

[5]Hamer U，Potthast K，Burneo J I，et al.Nutrient stocks and phosphorus fractions in mountain soils of Southern Ecuador after conversion of forest to pasture[J].Biogeochemistry，2013，112(1-3)：495-510.

[6]董田建，程 力，張學強.洪雅林場3種植被恢復模式下土壤埋化性質(zhì)的調(diào)查分析[J].四川林業(yè)科技，2015，36(1)：43-47.

[7]Kulmatiski A，Beard K H.Long-term plant growth legacies overwhelm short-term plant growth effects on soil microbial community structure [J].Soil Biology and Biochemistry，2011，43(4)：823-830.

[8]Murray A H，Iason G R，Stewart C.Effect of simple phenolic compounds of heather (Calluna vulgaris) on rumen microbial activity in vitro[J].Journal of Chemical Ecology，1996，22(8)：1493-1504.

[9]Blum U.Effects of microbial utilization of phenolic acids and their phenolic acid breakdown products on allelopathic interactions [J].Journal of Chemical Ecology，1998，24 (4)：685-708.

[10]Zhang J，Salahuddin，Ji L，et al.Effects of larch (Larixgmelinii) phenolic acids on manchurian ash (Fraxinusmandshurica) soil microbial community structure[J].Allelopathy Journal，2016，37(1)：123-135.

[11]Yang L X，Sun Y Z，Wang D L，et al.Spatial distribution of total phenols and soil microbial populations in Manchurian walnut (JuglansmandshuricaMaxim.) and its mixed-species plantations[J].Allelopathy Journal，2012，29(2)：263-270.

[12]周寶利，孫 巖，尹玉玲，等.苦參腐解物對酚酸類物質(zhì)脅迫下茄子生長和根際土壤微生物活性的影響[J].生態(tài)學雜志，2010，29(4)：735-740.

[13]母 容，潘開文，王進闖，等.阿魏酸、對羥基苯甲酸及其混合液對土壤氮及相關(guān)微生物的影響[J].生態(tài)學報，2011，31(3)：793-800.

[14]蘇金豹，王東亮，楊立學.落葉松四種根系分泌物對胡桃楸根系活力和菌根侵染率的影響[J].生態(tài)學雜志，2013，32(10)：2659-2664.

[15]王莉麗，宋 宇，劉連利，等.HPLC法快速測定軟飲料中苯甲酸，糖精鈉，山梨酸的含量[J].渤海大學學報：自然科學版，2007，28(2)：129-131.

[16]陳 瑩，莫連峰，唐 寧.HPLC法測定復方水楊酸冰片軟膏中水楊酸和苯甲酸的含量[J].中國藥品標準，2009，10(6)：465-467.

[17]張國躍，喬蓉霞，齊化元.HPLC法測定醬油中苯甲酸，山梨酸的含量及六省醬油樣品測定結(jié)果分析[J].中國醫(yī)藥科學，2011，1(8)：37-38.

[18]白 林，朱小潔.HPLC法同時測定四種復方制劑中苯甲酸和水楊酸的含量[J].解放軍藥學學報，2014，30(1)：66-69.

[19]黃 力，高 從，賴文紅，等.HPLC法測定三酸散中苯甲酸和水楊酸的含量[J].解放軍藥學學報，2014，30(1)：58-59.

Determination of 2，4-dihydroxy Benzoic AcidConcentration of Soil Using HPLC Method

He Chunting1，Zhang Yumei1，Ji Li2，Yang Lixue2*

(1.Nujiang Lisu Autonomous Prefecture，Yunnan province，F(xiàn)orestry Bureau，Nujiang 673100；2.Northeast Forestry University，College of Forestry，Harbin 150040)

The concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid was determined based on the established High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method and the amount of 2，4-dihydroxy benzoic acid was analyzed in 4 different land uses in the vertical distribution.The 2，4-dihydroxy benzoic acid in sample was extracted by 24 hours-water-bath heating with ethyl acetate，and then was evaporated and dissolved in chromatographic grade methanol.The sample elution was taken by the mobile phase which was composed of 3% glacial acetic acid and methanol (75∶25) with the flowing rate of 1 mL/min.The chromatographic column was Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm) while the detecting wavelength was 280 nm and the column temperature was 25℃.The result showed that a good linear relationship existed between the concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid and the peak area in the range of 80～800 μg/mL.The obtained linear regression equation wasY=13.315X-12.803 (r2=0.999 9).The relative standard deviation (RSD) of repeatability，precision and stability of 2，4-dihydroxy benzoic acid were 0.778%，1.623% and 1.918% respectively.The average recovery rate was 97.675% and the RSD was 0.771% (n=6)，all of which met the requirements of qualitative and quantitative analysis.The determination of 2，4-dihydroxy benzoic acid content using HPLC method was simple，rapid and accurate.The amount of the 2，4-dihydroxy benzoic acid in soil of natural secondary forest was found the greatest among 4 kinds of land.A uses and the concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid decreased with the depth of the soil.

HPLC；2，4-dihydroxy benzoic acid；Land uses

2016-06-06

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2572016EAJ1)；國家自然科學基金(31170583)

和春庭，高級工程師。研究方向：森林培育，森林生態(tài)學。

*通信作者：楊立學，博士，教授。研究方向：種苗生理生態(tài)、林木間的化感作用、人工林定向培育。E-mail：ylx_0813@163.com

和春庭，張育梅，及 利，等.高效液相色譜法測定土壤中2，4-二羥基苯甲酸含量[J].森林工程，2016，32(6)：34-37.

TS 47；O 657.72

A

1001-005X(2016)06-0034-04