閆志豐 李三中 董秋峰 陳曉燕 李娟 霍軍麗 高大寬 甄海寧 費(fèi)舟(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科, 陜西 西安 710032)

人巨細(xì)胞病毒感染在顱咽管瘤中的表達(dá)及意義

閆志豐 李三中 董秋峰 陳曉燕 李娟 霍軍麗 高大寬 甄海寧*費(fèi)舟*
(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科, 陜西 西安 710032)

目的檢測人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染在顱咽管瘤組織中的表達(dá)，探討HCMV感染與顱咽管瘤發(fā)生的病因?qū)W關(guān)系。方法采用免疫組化方法檢測HCMV立刻早期蛋白1-72(IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(pp65)抗原在89例顱咽管瘤組織及10例正常腦組織中的表達(dá)情況。結(jié)果在顱咽管瘤組織中HCMV IE1-72和pp65抗原表達(dá)陽性率分別為77.5%和84.3%，而在正常腦組織中兩抗原均為陰性，IE1-72和pp65抗原表達(dá)陽性率在顱咽管瘤組織和正常腦組織間均有顯著性差異(P=0.000，P=0.000)。IE1-72抗原在牙釉質(zhì)型和鱗狀乳頭型顱咽管瘤組織中陽性率分別為83.6%和67.6%，pp65抗原分別為89.1%和76.5%；兩抗原在牙釉質(zhì)型顱咽管瘤組織中的陽性率均略高于鱗狀乳頭型，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.135，P=0.197)。結(jié)論HCMV IE1-72和pp65抗原在顱咽管瘤組織中均有高表達(dá)，而在正常腦組織中無表達(dá)，HCMV感染及其抗原表達(dá)可能與顱咽管瘤的發(fā)生有一定關(guān)系，其致病機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

人巨細(xì)胞病毒; 顱咽管瘤; 免疫組化; 立刻早期蛋白1-72; 磷酸化糖蛋白65

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是最大的β皰疹病毒，在人群中普遍感染，其可通過垂直和水平途徑進(jìn)行傳播。近年來資料顯示HCMV在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等人類多種類型腫瘤中都有較高的感染率和抗原表達(dá)陽性率[1～4]，提示HCMV可能是導(dǎo)致人類某些類型腫瘤形成和發(fā)展的一個(gè)重要病因。顱咽管瘤是兒童和青少年常見的顱內(nèi)先天性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的4%。目前對(duì)于顱咽管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，HCMV感染是否與其發(fā)生有關(guān)，國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。本文采用免疫組化方法檢測了HCMV立刻早期蛋白1-72(immediate early protein 1-72, IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(phosphorylated glycoprotein 65, pp65)兩種抗原在顱咽管瘤組織中的表達(dá)情況，旨在探討HCMV感染及其抗原表達(dá)與顱咽管瘤發(fā)生可能存在的病因?qū)W關(guān)系。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

連續(xù)收取2006年6月至2010年12月西京醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除且經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的顱咽管瘤組織89例，其中男49例、女40例(男女比例為1 ∶0.82)，平均年齡31.69歲；牙釉質(zhì)型顱咽管瘤55例、鱗狀乳頭型34例。另收取10例來自高血壓腦出血手術(shù)皮層造瘺獲到的正常人腦組織。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，厚4 μm，貼于涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxy silane, APES)防脫片膠的載玻片，置于58℃ 6 h烤片后備用。

二、免疫組化

1.試劑：HCMV IE1-72和pp65單克隆抗體分別購自美國的Millipore公司和英國的Leica公司。EnVision試劑盒購自丹麥的DAKO公司。

2.染色步驟：采用聚合物-過氧化物酶(polymer-peroxidase, PP)免疫組化兩步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水沖洗后置于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)緩沖液(pH 9.0)中高壓熱修復(fù)2 min 15 sec，自然冷卻至室溫。取出玻片，蒸餾水沖洗后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)振洗3次，每次5 min。用3% H2O2于室溫下孵育10 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。用動(dòng)物血清工作液于室溫下孵育1 h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。去除血清滴加一抗(IE1-72和pp65抗體分別按1 ∶100和1 ∶50稀釋)，4℃冰箱孵育過夜。PBS振洗3次，每次5 min，滴加EnVision復(fù)合物液，于室溫下孵育40 min。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。以高表達(dá)HCMV IE1-72和pp65的直腸癌組織作為陽性對(duì)照(圖1, 2)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照(圖7)。

三、結(jié)果判定

HCMV IE1-72和pp65抗原免疫組化陽性為胞漿和(或)胞核呈棕黃色染色，在×400高倍視野下觀察，每例組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用目鏡網(wǎng)格測微尺計(jì)數(shù)細(xì)胞。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，抗原陽性率在顱咽管瘤與正常腦組織之間、不同病理類型之間以及患者性別之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，抗原表達(dá)與患者年齡之間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HCMV抗原在顱咽管瘤和正常人腦組織中的表達(dá)

HCMV IE1-72和pp65抗原在顱咽管瘤胞漿和胞核中都有著色，陽性細(xì)胞在腫瘤組織上皮細(xì)胞中分布不均勻(圖3～6)。顱咽管瘤組織中HCMV IE1-72和pp65抗原陽性率分別為77.5%和84.3%，而正常人腦組織全為陰性(圖8)。HCMV IE1-72和pp65抗原表達(dá)陽性率在顱咽管瘤組織和正常人腦組織之間均有顯著性差異(χ2=22.045，P=0.000；χ2=30.324，P=0.000)。

二、HCMV抗原表達(dá)與顱咽管瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

HCMV IE1-72在牙釉質(zhì)型(圖3)和鱗狀乳頭型(圖4)顱咽管瘤組織中陽性率分別為83.6%和67.6%，pp65在牙釉質(zhì)型(圖5)和鱗狀乳頭型(圖6)顱咽管瘤組織中陽性率分別為89.1%和76.5%；兩抗原在牙釉質(zhì)型顱咽管瘤組織中的陽性率均略高于鱗狀乳頭型，但均無顯著性差異(χ2=2.234，P=0.135；χ2=1.662，P=0.197)。IE1-72和pp65兩抗原陽性率在男女性別間均無顯著性差異(χ2=0.595，P=0.440；χ2=0.215，P=0.643)，IE1-72和pp65兩抗原表達(dá)與患者年齡亦無明顯相關(guān)性(r=0.009，P=0.930；r=0.056，P=0.599)。

圖1 HCMV IE1-72在陽性對(duì)照直腸癌組織中強(qiáng)表達(dá)(DAB, ×400)

Fig 1 Strong expression of HCMV IE1-72 in positive control rectal cancer tissue (DAB, ×400)

圖2 HCMV pp65在陽性對(duì)照直腸癌組織中強(qiáng)表達(dá)(DAB, ×200)

Fig 2 Strong expression of HCMV pp65 in positive control rectal cancer tissue (DAB, ×200)

圖3 HCMV IE1-72在牙釉質(zhì)型顱咽管瘤中呈陽性表達(dá)(DAB, ×400)

Fig 3 Positive expression of HCMV IE1-72 in adamantinomatous type craniopharyngioma (DAB, ×400)

圖4 HCMV IE1-72在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中呈陽性表達(dá)(DAB，×400)

Fig 4 Positive expression of IE1-72 in papillary type craniopharyngioma (DAB, ×400)

圖5 HCMV pp65在牙釉質(zhì)型顱咽管瘤中呈陽性表達(dá)(DAB，×400)

Fig 5 Positive expression of HCMV pp65 in adamantinomatous type craniopharyngioma (DAB, ×400)

圖6 HCMV pp65在鱗狀乳頭型顱咽管瘤中呈陽性表達(dá)(DAB，×400)

Fig 6 Positive expression of HCMV pp65 in papillary type craniopharyngioma (DAB, ×400)

圖7 顱咽管瘤陰性對(duì)照(DAB，×400)

Fig 7 Negative control of craniopharyngioma (DAB, ×400)

圖8 HCMV抗原在正常腦組織中無表達(dá)(DAB，×400)

Fig 8 No expression of HCMV antigens in normal brain tissue (DAB, ×400)

討 論

HCMV是最大的β皰疹病毒，具有種屬特異性，在人群中的感染率高達(dá)60%～90%，女性感染率顯著高于男性，其可通過垂直和水平途徑進(jìn)行傳播[5]。人被HCMV感染后一般無明顯癥狀，形成潛在感染，當(dāng)免疫功能降低時(shí)能再次激活，可導(dǎo)致人多種器官的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，甚至致死[6,7]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HCMV感染存在于人類多種類型腫瘤組織中，并與腫瘤的惡性程度有正相關(guān)性。Cobbs等在WHO Ⅱ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中采用免疫組化方法檢測HCMV IE1-72和pp65抗原，結(jié)果顯示二者表達(dá)陽性率均為100%，而在正常人腦組織中二者表達(dá)均為陰性[8]。Harkins等在結(jié)直腸癌和腸息肉組織中檢測IE1-72和pp65抗原，結(jié)果結(jié)直腸癌組織中兩抗原陽性率分別為80%和92%，腸息肉組織分別為82%和78%[4]；該作者也在乳腺癌上皮組織中檢測了HCMV多種抗原的表達(dá)，其中IE1-72陽性率為93%，正常乳腺上皮組織陽性率為63%，IE1-72陽性率在乳腺癌上皮組織和正常乳腺上皮組織中存在顯著差異[2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Cobbs等發(fā)現(xiàn)感染鼠巨細(xì)胞病毒后鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞染色質(zhì)呈紡錘體形狀，增生活躍[9]，且小鼠的生存率明顯降低；最新的臨床對(duì)照試驗(yàn)也顯示HCMV感染能降低膠質(zhì)瘤患者預(yù)后生存率[10]。以上結(jié)果提示HCMV長期感染可能與人某些贅生物及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展甚至預(yù)后有關(guān)，但不同類型腫瘤間HCMV感染和抗原表達(dá)陽性率有所不同，提示HCMV感染和抗原表達(dá)可能與腫瘤的生長部位和組織類型有關(guān)。

顱咽管瘤是兒童和青少年常見的顱內(nèi)先天性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的4%。顱咽管瘤臨床表現(xiàn)通常復(fù)雜而嚴(yán)重，治療很棘手，手術(shù)往往難以徹底切除，放化療效果有限，腫瘤復(fù)發(fā)率高[11]，預(yù)后差[12]。目前有關(guān)顱咽管瘤的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，這也是臨床上缺乏有效防治方法的一個(gè)重要因素。HCMV感染是否與顱咽管瘤的發(fā)生有關(guān)，國內(nèi)外尚未見有關(guān)研究報(bào)道。本研究采用免疫組化方法檢測HCMV IE1-72和pp65抗原在89例顱咽管瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示IE1-72和pp65兩抗原在顱咽管瘤組織中均有較高表達(dá)，而二者在10例正常人腦組織中均無表達(dá)，HCMV IE1-72和pp65抗原陽性率均顯著高于正常腦組織，提示HCMV感染及抗原表達(dá)可能與顱咽管瘤的發(fā)生有一定關(guān)系，HCMV可能是顱咽管瘤發(fā)生的一個(gè)重要病因。已知HCMV可通過垂直傳播途徑由母體感染胎兒，在胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中HCMV有可能導(dǎo)致胎兒顱頰囊前壁的顱咽管鱗狀上皮細(xì)胞退化不完全，并促進(jìn)其生長和變異，從而逐漸形成顱咽管瘤。在顱咽管瘤兩病理分型間，IE1-72和pp65抗原在牙釉質(zhì)型中陽性率均略高于鱗狀乳頭型，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，這可能與本組樣本量較小有關(guān)，但仍提示HCMV感染可能與顱咽管瘤的不同病理組織類型發(fā)生有關(guān)。本組IE1-72和pp65抗原表達(dá)陽性率在男女性別間無顯著差異，二者表達(dá)與患者年齡也無明顯相關(guān)性，提示不同性別和不同年齡的顱咽管瘤患者有著相似的HCMV感染率。

研究表明HCMV感染后其短獨(dú)特序列(short unique, US)US2、US3、US6、US11和長獨(dú)特序列(long unique, UL)UL111基因編碼的相應(yīng)蛋白，能減少Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)的表達(dá)，并競爭性結(jié)合自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK)的免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄體受體(leukocyte Ig-like receptor 1/ Ig-like transcript 2, LIR1/ILT2)，保護(hù)已感染細(xì)胞免于NK細(xì)胞的殺傷作用；UL111A能降低樹突狀細(xì)胞識(shí)別、吞噬和呈遞抗原及激活T細(xì)胞的作用，顯著地抑制機(jī)體的細(xì)胞-體液免疫；UL112可通過下調(diào)NK細(xì)胞膜上MHCⅠ類相關(guān)分子B的表達(dá)，抑制活化型受體(natural-killer group2 member D, NKG2D)及其配體的表達(dá)和識(shí)別功能，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的免疫功能[13]，形成免疫逃避機(jī)制和持續(xù)感染。

最新研究結(jié)果認(rèn)為HCMV持續(xù)感染可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Michaelis等研究認(rèn)為HCMV IE1和IE2抗原能抑制或阻斷腺病毒E1A蛋白和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNF-α)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及Fas介導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。而且HCMV感染能降低黏附因子CD56的表達(dá)量并激活整合素β1α5，使腫瘤細(xì)胞間和腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附性降低及內(nèi)皮細(xì)胞破裂死亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[15]。HCMV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后IE1蛋白和UL28聯(lián)合作用通過結(jié)合整合素β1和β3及表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受體的表達(dá)，調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB, NF-κB)和活化蛋白(activator protein-1, AP-1)誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)表達(dá)，促進(jìn)微血管生成，并改變微血管表型[16]，增加血管壁的通透性并造成血管壁損傷，利于腫瘤細(xì)胞的穿透和黏附。

總之，本研究證實(shí)HCMV抗原在顱咽管瘤組織中有較高的表達(dá)陽性率，而在正常腦組織中無表達(dá)，提示HCMV感染可能與人顱咽管瘤的發(fā)生有一定關(guān)系，但其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

1Scheurer ME, Bondy ML, Aldape KD, et al. Detection of human cytomegalovirus in different histological types of gliomas [J]. Acta Neuropathol, 2008, 116(1): 79- 86.

2Harkins LE, Matlaf LA, Soroceanu L, et al. Detection of human cytomegalovirus in normal and neoplastic breast epithelium [J]. Herpesviridae, 2010, 1(1): 8.

3Samanta M, Harkins LE, Klemm K, et al. High prevalence of human cytomegalovirus in prostatic intraepithelial neoplasia and prostatic carcinoma [J]. J Urol, 2003, 170(3): 998-1002.

4Harkins L, Volk AL, Samanta M, et al. Specific localisation of human cytomegalovirus nucleic acids and proteins in human colorectal cancer [J]. Lancet, 2002, 360(9345): 1557-1563.

5Lübeck PR, Doerr HW, Rabenau HF. Epidemiology of human cytomegalovirus (HCMV) in an urban region of Germany: what has changed ? [J]. Med Microbiol Immunol, 2010, 199(1): 53-60.

6Soroceanu L, Cobbs CS. Is HCMV a tumor promoter ? [J]. Virus Res, 2011, 157(2): 193-203.

7S?derberg-Nauclér C. HCMV microinfections in inflammatory diseases and cancer [J]. J Clin Virol, 2008, 41(3): 218-223.

8Cobbs CS, Harkins L, Samanta G, et al. Human cytomegalovirusinfection and expression in human malignant gliomal [J]. Cancer Res, 2002, 62(12): 3347- 3350.

9Cobbs CS. Evolving evidence implicates cytomegalovirus as a promoter of malignant glioma pathogenesis [J]. Herpesviridae, 2011, 2(1): 10.

10Rahbar A, Stragliotto G, Orrego A, et al. Low levels of Human cytomegalovirus infection in glioblastoma multiforme associates with patient survival; -a case-control study [J]. Herpesviridae, 2012, 3: 3.

11石祥恩. 復(fù)發(fā)性顱咽管瘤的治療 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2003, 2(2): 185-186.

12陳禮剛, 李定君, 董勁虎, 等. 兒童顱咽管瘤圍手術(shù)期內(nèi)分泌和水電解質(zhì)紊亂的臨床研究 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2008, 7(4): 346-349.

13Tomasec P, Wang EC, Groh V, et al. Adenovirus vector delivery stimulates natural killer cell recognition [J]. J Gen Virol, 2007, 88(4): 1103-1108.

14Michaelis M, Doerr HW, Cinatl J. The story of human cytomegalovirus and cancer: Increasing evidence and open questions [J]. Neoplasia, 2009, 11(1): 1-9.

15Utama B, Shen YH, Mitchell BM, et al. Mechanisms for human cytomegalovirus-induced cytoplasmic P53 sequestration in endothelial cells [J]. J Cell Sci, 2006, 119(Pt 12): 2457-2467.

16Maussang D, Verzijl D, van Walsum M, et al. Human cytomegalovirus-encoded chemokine receptor US28 promotes tumorigenesis [J]. Proc Natl Acad Sci, 2006, 103(35): 13068-13073.

Infectionandexpressionofhumancytomegalovirusincraniopharyngiomasanditssignificance

YANZhifeng,LISanzhong,DONGQiufeng,CHENXiaoyan,LIJuan,HUOJunli,GAODakuan,ZHENHaining,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe infection and expression of human cytomegalovirus (HCMV) in craniopharyngioma tissues are detected to investigate the etiological relation between HCMV infection and craniopharyngioma formation.MethodsExpressions of immediate early protein 1-72 (IE1-72) and phosphorylated glycoprotein 65 (pp65) antigens of HCMV were examined by immunohistochemistry method in 89 cases of craniopharyngioma and 10 cases of normal brain tissues.ResultsThe positive rates of HCMV IE1-72 and pp65 expression were 77.5% and 84.3% in craniopharyngiomas, respectively, but not in normal brain tissues; there were significant differences in the positive expression rates of HCMV IE1-72 and pp65 antigen between craniopharyngiomas and normal brain tissues (P=0.000,P=0.000). The positive rates of IE1-72 in adamantinomatous type and papillary type of craniopharyngiomas were 83.6% and 67.6% respectively, while that of pp65 was 89.1% and 76.5%, respectively; although positive expression rates of IE1-72 and pp65 in adamantinomatous type were a little higher than that in papillary type, there was no significant difference for both two groups (P=0.135,P=0.197).ConclusionBoth HCMV IE1-72 and pp65 are highly expressed in craniopharyngiomas, while no expression of them is found in normal brain tissues, which implies HCMV infection and expression may be associated with craniopharyngioma formation, and the related pathogenic mechanism need research further.

Human cytomegalovirus (HCMV); Craniopharyngioma; Immunohistochemistry; Immediate early protein 1-72 (IE1-72); Phosphorylated glycoprotein 65 (pp65)

1671-2897(2016)15-148-04

·論著·

R 446.5

A

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院學(xué)科助推計(jì)劃創(chuàng)新人才基金資助項(xiàng)目(XJZT08R09)

閆志豐，碩士研究生，E-mail：yanzf515@163.com

*通訊作者： 甄海寧，副教授、副主任醫(yī)師，E-mail：zhenhn@fmmu.edu.cn；費(fèi)舟，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2012-10-24；

2012-12-17)