彭程 張磊 饒維 費舟 (第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710032)

·腦血管疾病研究·

線粒體分裂抑制劑通過抑制自噬加重OGD/R損傷

彭程 張磊 饒維 費舟*
(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，陜西 西安 710032)

目的探討線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)處理對原代培養(yǎng)的皮層神經元缺血再灌注損傷的作用及其機制研究。方法在原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經元上建立氧糖剝奪/復氧復糖(OGD/R)模型模擬體內缺血再灌注損傷，根據再灌注時間長短檢測自噬的發(fā)生情況，并進一步選取自噬發(fā)生最明顯的時間點。然后分別采用自噬抑制劑-3-MA、自噬激動劑-雷帕霉素(rapamycin)、Mdivi-1以及聯(lián)合rapamycin和Mdivi-1進行干預，分別從mRNA以及蛋白水平檢測自噬相關分子的改變，并同時檢測神經元損傷情況。結果OGD/R處理后，神經元自噬隨再灌注時間增長而上調，在OGD 2 h/R 24 h時，Beclin 1以及微管相關輕鏈蛋白3 II/I(LC3 II/I)比值均達峰值(P<0.001，P<0.01)。細胞活力結果顯示，rapamycin可減輕OGD/R損傷(P<0.01)，Mdivi-1則會加重OGD/R損傷(P<0.05)，但rapamycin可通過增加自噬來減輕Mdivi-1造成的損傷(P<0.05)。蛋白檢測結果顯示，OGD/R處理后，Mdivi-1可明顯降低神經元細胞內Beclin 1和LC3 II的表達(P<0.05)。結論Mdivi-1可能通過抑制自噬的發(fā)生，從而加重神經元OGD/R損傷。

腦缺血再灌注損傷; 線粒體分裂; 自噬

線粒體作為細胞的能量工廠，在機體生理以及病理條件下都發(fā)揮著至關重要的作用。其一直處于不斷分裂以及融合的動態(tài)平衡之中，而這種平衡一旦失調就會引起線粒體形態(tài)以及功能的損傷，從而導致機體發(fā)生各種病理性改變[1]。目前已有文獻研究表明，線粒體的動態(tài)平衡失調在腦缺血再灌注I/R損傷中發(fā)揮重要作用，但其具體的調控機制仍不明確。近來，自噬作為神經退行性疾病中的研究熱點，不但被證實在腦I/R損傷中具有一定的保護性作用，而且大量研究發(fā)現(xiàn)其與線粒體分裂過程密切相關[2]。自噬是通過自噬小體-自噬溶酶體系統(tǒng)對自身細胞內異常的細胞器和代謝產物進行吞噬降解的生理過程，對維持細胞生長以及機體發(fā)育具有重要作用，并被認為是細胞進行自我保護的一種重要機制[3]。為進一步研究線粒體動態(tài)平衡在腦I/R損傷中的具體作用機制，本次研究利用小鼠的原代神經元細胞建立氧糖剝奪后再復氧模型(oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)，采用線粒體分裂抑制劑進行干預，并進一步結合自噬相關抑制劑和激動劑，分別提取RNA和蛋白質，檢測Beclin 1、 微管相關輕鏈蛋白3 II (microtubule-associated protein light chain 3 II, LC3 II) 等自噬相關分子的表達改變，進而通過研究自噬探討線粒體分裂在腦I/R損傷中過程發(fā)揮的作用，闡明自噬是否可作為線粒體動態(tài)平衡與腦I/R損傷的研究橋梁。

材料與方法

一、主要試劑及抗體

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、雙抗(100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)、改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)、無糖培養(yǎng)基(Gibco)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)、雷帕霉素(rapamycin)、Mdivi-1(Sigma)；兔源性LC3 II抗體、兔源性Beclin 1抗體、鼠源性β-actin抗體(cell signaling technology)；Trizol、RNA反轉錄試劑盒、實時定量 PCR試劑盒(Takara)；Cell counting kit-8(上海生工)。

二、小鼠原代皮層神經元培養(yǎng)

冰上頸椎脫臼處死孕15 d左右的C57BL/6小鼠，分離、剪開子宮，取出胎鼠并放于空培養(yǎng)皿中。顯微鏡下取胎鼠腦皮層組織，置于含有預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)的小培養(yǎng)皿中，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min后終止消化。玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養(yǎng)基稀釋成5×105/mm3的密度接種到經多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，孵育4～6 h后，顯微鏡下觀察神經元貼壁后，改用含B27和谷氨酰胺的Neurobasal繼續(xù)培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。以后每3 d半量換液一次，培養(yǎng)10～12 d左右，待神經元成熟后用于實驗。整個過程中注意不用劇烈晃動神經元，否則可能造成軸突斷裂，影響神經元狀態(tài)。

三、OGD/R模型的制備

取成熟的原代神經元，將培養(yǎng)液更換為無糖培養(yǎng)基。將細胞置于缺氧孵箱中，通入5% CO2和95% N2的混合氣，使孵箱內氧濃度低于1%。培養(yǎng)2 h后，將培養(yǎng)基換為含B27和谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)液，再置于正常孵箱內孵育不同指定時間。

四、細胞活力檢測(cell counting kit-8, CCK-8)

同時種植于兩個96孔板培養(yǎng)的神經元一板為OGD/R(-)組，另一板為OGD/R(+)組。按指定分組加入相應藥物，藥物濃度如下：Mdivi-1 (100 μM)、3-MA (10 mM)、rapamycin (100 nM)。OGD 2 h后加入相應藥物，再進行復氧(R)。復氧24 h后，每100 μl培養(yǎng)基中加入10 μl CCK-8工作液。2～4 h后，酶標儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度值。按照公式計算神經元細胞活力：細胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)× 100 %。

五、實時定量 PCR檢測

按照Trizol RNA提取試劑盒說明書，提取神經元細胞總RNA，并用紫外分光光度儀測量RNA濃度。以總RNA為模板，按照說明書步驟逆轉錄為合成cDNA，再以cDNA為模板按Tap酶說明書進行PCR擴增。引物均由Takara設計合成，Map1lc3上游引物：5-GCG CTT GCA GCT CAA TGC TA-3，下游引物：5-GTA CAC TTT CGG AGA TGG GAG TGG-3；Beclin 1上游引物：5-GGG TCA CCA TCC AGG AAC TCA-3，下游引物：5-CAC CAT CCT GGC GAG TTT CA-3；GAPDH上游引物：5-GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG-3，下游引物：5-GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG-3。結果以GAPDH為內參進行比較，計算各個基因mRNA水平的改變。

六、蛋白質免疫印跡檢測(Western blot)

輕輕吸凈培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，并用PBS洗1～2遍，然后加入混有1%蛋白酶抑制劑的裂解液充分裂解細胞，12 000 r/min離心25 min后吸上清。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量后于12% SDS凝膠上電泳分離，上樣量為20 μg，再轉印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，然后分別用LC3 II一抗 (1 ∶1 000 )、Beclin 1 (1 ∶2 000) 一抗和β-actin(1 ∶5 000)一抗4℃孵育過夜。用含0.1%Tween20的PBS充分洗膜，然后二抗室溫孵育1 h，再用PBS充分洗膜，最后用增強的化學發(fā)光液發(fā)光。用Gel-pro分析軟件進行分析各個條帶的灰度值，并以β-actin作為內參進行比較，得出各個基因蛋白水平的改變。

七、統(tǒng)計學處理

數(shù)據均采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據均以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用LSD-t檢驗。所有數(shù)據比較，P< 0.05認為有統(tǒng)計學差異。

結 果

一、在原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經元中，OGD/R處理后自噬發(fā)生上調

原代培養(yǎng)的小鼠腦皮層神經元OGD/R處理后，觀察到的結果與國外學者研究相一致，發(fā)現(xiàn)原代神經元內Beclin 1蛋白表達水平隨復氧處理的時間延長而顯著升高，在本研究中復氧時長最長觀察到24 h，此時Beclin 1蛋白水平升高至峰值(P<0.001)(圖1 A, B)[4]。同樣，在OGD/R處理下，LC3 II/I比值在復氧6 h 后開始顯著升高，并在12 h和24 h 時達到峰值(P<0.01)(圖1 A, C)。進一步通過實時定量 PCR檢測Beclin 1和Map1lc3在mRNA水平的改變，發(fā)現(xiàn)兩者的變化趨勢與各自蛋白表達的變化趨勢基本一致，也均有顯著改變(圖1 D, E)。結果提示，OGD/R處理后，神經元自噬上調。

圖1 Western blot和RT-PCR檢測OGD/R后自噬相關分子表達

Fig 1 Autophagy related molecules were detected by Western blot and RT-PCR

A: Beclin 1, LC3 II/I and β-actin were detected by Western blot; B: Quantity of Beclin 1 detected by Western blot (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001,dP<0.001, all of themvsnormal group); C: Quantity of LC3 II/I detected by Western blot (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.01, all of themvsnormal group); D: Quantity of Beclin 1 detected by RT-PCR (aP<0.05,bP<0.05,cP<0.01,dP<0.01,eP<0.01, all of themvsnormal group); E: Quantity of Map1lc3 detected by RT-PCR (aP<0.05,bP<0.01,cP<0.01, all of themvsnormal group).

圖2 檢測各不同處理組的細胞活力和Mdivi-1對自噬相關分子的影響

Fig 2 Detection of cellular vitality in all groups and role of Mdivi-1 on autophagy related molecules

A: Cellular vitality in different groups were detected by CCK-8 (aP<0.01, Mdivi-1(-): NvsOGD/R;bP<0.01, Mdivi-1(-): OGD/RvsOGD/R-Rapa;cP<0.05, Mdivi-1(-): OGD/RvsOGD/R-3-MA;dP<0.05, OGD/R: Mdivi-1(-)vsMdivi-1(+);eP<0.05, Mdivi-1(+): OGD/RvsOGD/R-Rapa); B: Beclin 1 and LC3 II/I were detected by Western blot after treatment of Mdivi-1 and OGD/R；C: Quantity of Beclin 1 detected by Western blot (aP<0.001, N-ConvsN-OGD/R;bP<0.05, OGD/RvsOGD/R-Mdivi-1); D: Quantity of LC3 II/I detected by Western blot (aP<0.01, NvsOGD/R;bP<0.05, OGD/RvsOGD/R-Mdivi-1).

二、線粒體分裂抑制劑通過抑制自噬發(fā)生，進而加重OGD/R損傷

Mdivi-1是線粒體分裂抑制劑，它抑制了線粒體分裂蛋白(dynamin-related protein 1, Drp1)向線粒體遷移，從而抑制了Drp1介導的線粒體分裂功能。在本研究中，選取自噬最為活躍的時間點OGD 2 h/R 24 h作為OGD/R的處理條件，觀察研究神經元損傷情況以及Mdivi-1對其影響。CCK-8結果顯示：OGD/R處理后，神經元細胞活力下調(P<0.01)，在添加自噬抑制劑3-MA后，細胞活力下調更為明顯(P<0.05)；然而當自噬激動劑rapamycin存在時，細胞活力有明顯改善(P<0.01)。采用Mdivi-1干預后，結果顯示：OGD/R處理后，添加Mdivi-1組神經元活力較未添加Mdivi-1組明顯下調(P<0.05)；但是研究發(fā)現(xiàn)，在添加rapamycin后，Mdivi-1組細胞活力上調(P<0.05)。上述結果提示，OGD/R處理后，Mdivi-1對神經元活力的影響與3-MA相似，同時其對細胞活力的影響可被rapamycin改善。

為進一步研究Mdivi-1是否通過影響自噬進而參與OGD/R損傷機制，利用Western blot檢測了其對自噬相關分子的影響。結果顯示：在OGD/R損傷中，Mdivi-1可明顯降低Beclin 1(P<0.05, 圖2 B,C)和LC3 II的表達(P<0.05, 圖2 B,D)。上述Western和CCK-8結果共同提示，OGD/R處理后，Mdivi-1可通過降低自噬從而加重損傷。

討 論

自噬是目前在退行性疾病中較為熱門的研究方向，其與阿爾茨海默病 (Alzheimer disease)、帕金森病(Parkinson's disease)以及腦缺血疾病的關系已有國內外文章相繼報道[5]。目前，多數(shù)研究認為自噬是維持細胞正常狀態(tài)的生理過程，但在一些外界刺激的作用下，自噬也會通過清除細胞內受損的細胞器或一些多余的代謝產物對細胞起到一定保護作用[6]。體內和體外的研究均表明，在腦I/R損傷中，細胞會啟動自噬清除機制，從而減輕損傷[7]。線粒體在I/R損傷以及自噬中都發(fā)揮重要作用，而近來有學者發(fā)現(xiàn)，線粒體也可介導自噬(線粒體自噬，mitophagy)，其在自噬中占有很大比重，尤其是在缺血缺氧的病理疾病中，線粒體自噬發(fā)揮著重要作用[3]。然而，線粒體不僅能介導誘發(fā)線粒體自噬過程，而且其內的特定分子還可參與自噬體膜的形成，從而促進自噬發(fā)生[8]。無論是線粒體介導的線粒體自噬還是線粒體參與形成的自噬，兩者均與線粒體的正常功能密切相關。而線粒體的融合與分裂的動態(tài)平衡則是維持線粒體功能的基本過程，一旦這種平衡發(fā)生紊亂，線粒體功能就會受損，那么與線粒體相關的各種生理或病理進程都將受到影響[9]。線粒體的融合與分裂是兩個相反的過程，而本研究的主要關注點是線粒體分裂相關過程。Mdivi-1是一種特異性的線粒體分裂抑制劑，其作用靶點就是調控線粒體分裂的重要蛋白-Drp1[10]。J Grohm等提出Mdivi-1可以減少OGD/R引起的凋亡，從而起到神經保護性作用[11]。這一結果與本研究并不矛盾，在上述研究與本研究中，Mdivi-1的使用時間和濃度有顯著區(qū)別。Ikeda, Y等證實：長時間、高濃度量Mdivi-1可抑制Drp1向線粒體遷移，從而抑制線粒體分裂，其所起作用與Drp1敲除相似[2]。所以在本研究中，為了有效達到抑制Drp1的效果，從而使用的是較高濃度的Mdivi-1。

本研究在原代培養(yǎng)的神經元OGD/R模型中，通過聯(lián)合Mdivi-1與自噬抑制劑/激動劑進行干預，探討自噬在Mdivi-1與OGD/R損傷中的機制。結果提示，首先證實在OGD 2 h/R 24 h處理條件下，自噬上調且對神經元I/R損傷起適應性保護作用；結合模型進一步觀察到100 μM的Mdivi-1可加重神經元OGD/R損傷，其機制可能為抑制了Drp1向線粒體轉運，使線粒體分裂功能受損，進而抑制了自噬的發(fā)生，加重I/R損傷。因此，在OGD/R處理后，抑制線粒體分裂可通過抑制自噬發(fā)生，從而加重OGD/R損傷，為預防I/R損傷的進一步損傷提供了新靶點。

1Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy [J]. Autophagy, 2012, 8(4): 445-544.

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MitochondrialfissioninhibitoraggravatesOGD/R-inducedinjurythroughinhibitionofautophagy

PENGCheng,ZHANGLei,RAOWei,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe objective of the research is to study the roles and mechanisms of mitochondrial fission inhibitor (Mdivi-1) in primary cultured cortex neurons of mice after Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion (OGD/R) injury.MethodsOccurrence of autophagy was detected after establishing OGD/R model in primary cultured cortex neurons. The mRNA and protein levels of autophagy-related genes were detected accompanied treatment with autophagy inhibitor (3-MA), autophagy agonist (rapamycin) and Mdivi-1. Moreover, the neural injury was measured.ResultsFollowing OGD/R treatment, autophagy was increased dependent on reperfusion times. And both levels of Beclin 1 and Microtubule-associated protein light chain 3 II (LC3 II) peaked at 24 h (P<0.001,P<0.01). Results of cell counting kit-8 (CCK-8) after OGD/R treatment showed that Mdivi-1 could aggravate the injury (P<0.05), however, rapamycin could reduce not only the OGD/R injury (P<0.01), but also the aggravating damage induced by Mdivi-1 (P<0.05). Furthermore, Mdivi-1 significantly reduced the levels of Beclin 1 and LC3 II following OGD/R injury (P<0.05).ConclusionMdivi-1 could aggravate the injury induced by OGD/R through inhibiting the occurrence of autophagy.

Cerebral ischemia/reperfusion injury; Mitochondrial fission; Autophagy

1671-2897(2016)15-101-04

R 651.15

A

國家自然科學基金資助項目(81430043)

彭程，醫(yī)師，博士研究生，E-mail: doctorpc@163.com

*通訊作者： 費舟，教授、主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2015-09-14；

2015-12-20)