蘇輝 戴宜武 秦家振 白妙春 楊藝 徐如祥 (北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100700)

HER2基因的表達水平在膠質(zhì)母細胞瘤患者預后評價中的意義

蘇輝 戴宜武*秦家振 白妙春 楊藝 徐如祥
(北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100700)

目的研究表明人類表皮生長因子受體2(HER2)基因的異常表達與乳腺癌，胃癌等多種惡性腫瘤的進展相關，然而其與膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)的關系目前尚不清楚。方法利用腫瘤與癌癥基因圖譜計劃(TCGA)，腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(REMBRANT)和基因表達公共數(shù)據(jù)庫(GEO)中GSE7696隊列等中的GBM病例資料和芯片數(shù)據(jù)，通過生存分析和Cox回歸分析，研究人類表皮生長因子受體2(HER2)基因的mRNA表達與GBM患者生存時間(OS)的關系。結果在TCGA病例組(N=288)中，HER2基因高表達組患者的預后差于低表達組的患者，其中位OS分別為15.1個月(95%可信區(qū)間：13.6～16.6個月)和16.7個月(95%可信區(qū)間：13.0～20.5個月)，P=0.013；同樣地，在另外兩個驗證組的患者中，HER2基因高表達組的患者預后也差于低表達組，REMBRANT病例組的中位OS分別為12.0個月(95%可信區(qū)間：8.1～15.9個月)和17.5個月(95%可信區(qū)間：14.0～21.1個月)，P=0.002；而GSE7696病例組的中位OS則分別為11.4個月(95%可信區(qū)間：9.0～13.7個月)和15.7個月(95%可信區(qū)間：14.2～17.2個月)，P=0.044；多因素Cox回歸分析表明HER2基因的表達分組不是獨立的預后因素，其預后評價能力與年齡和MGMT甲基化分組因素有關。結論本研究一方面驗證了HER2基因的mRNA表達與GBM患者的臨床預后密切相關，另一方面為未來以HER2基因為基礎的GBM預后評價方式和個體化治療策略提供了臨床依據(jù)。

人類表皮生長因子受體2; 基因芯片; 膠質(zhì)母細胞瘤; 預后分析

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是臨床最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤。盡管臨床上采用以手術聯(lián)合放化療的綜合治療策略，GBM患者的臨床預后仍然很差[1]。既往研究證實，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)該家族中的EGFR基因可以通過擴增和過表達的方式影響GBM的疾病進展[2]。人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor-2, HER2)是與EGFR同家族的跨膜受體蛋白。研究表明，HER2可以通過激活下游多種信號通路影響細胞的增殖與凋亡[3]。HER2基因的表達水平與乳腺癌等多種惡性腫瘤的臨床預后密切相關[4]。然而，HER2基因與GBM患者的預后是否相關目前尚不清楚。本研究利用在線GBM樣本數(shù)據(jù)庫，研究并驗證HER2基因mRNA表達水平與GBM患者患者總生存期(overall survival, OS)的關系。

對象與方法

一、GBM病例數(shù)據(jù)庫

GBM病例的全基因組表達芯片數(shù)據(jù)和相對應的臨床數(shù)據(jù)，包括患者年齡，性別，OS，甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)甲基化狀態(tài)等，通過以下在線數(shù)據(jù)庫獲得：

癌癥和腫瘤基因圖譜計劃數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas, TCGA)：共288例GBM病例；所有病例均接受放療聯(lián)合替莫唑胺化療的輔助治療方案。腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(Repository of Molecular Brain Neoplasia Data, REMBRANT)：共187例GBM病例；輔助治療方案不詳?；虮磉_公共數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO)中的GSE7696系列：共70例GBM病例；其中43例采用放療聯(lián)合替莫唑胺化療，27例采用單純放射治療。本研究中，設TCGA病例組為試驗組，REMBRANT病例組和GSE7696病例組為驗證組。

二、HER2基因表達數(shù)據(jù)的處理

HER2基因的mRNA數(shù)據(jù)均來自各數(shù)據(jù)庫處理后的全基因組表達芯片(Aglient 244K G4502A microarray和Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)的數(shù)據(jù)。由于表達芯片中存在多個針對HER2基因的檢測探針，因此HER2基因的表達值由這些探針的平均值代表。為了消除不同芯片檢測平臺之間的系統(tǒng)誤差，不同數(shù)據(jù)庫來源的HER2基因表達數(shù)據(jù)通過標準化運算轉換為平均值為0，標準差為1的數(shù)據(jù)集[5]。

三、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。各病例組中年齡分布采用非配對t檢驗進行統(tǒng)計，其他臨床特征采用Fisher精確檢驗(兩組間)和卡方檢驗(多組間)進行統(tǒng)計分析。同時，為了便于研究，我們規(guī)定試驗組(TCGA病例組)GBM病例的HER2基因的中位表達值為分組界值(0.1409)，將所有數(shù)據(jù)庫病例劃分為HER2基因高表達組和低表達組。HER2基因mRNA表達水平與GBM患者預后的關系采用log-rank檢驗，Kaplan-Meier法以及Cox回歸模型進行分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、GBM病例的一般資料

本研究共納入545例來自TCGA數(shù)據(jù)庫(288例)，REMBRANT數(shù)據(jù)庫(187例)和GSE7696數(shù)據(jù)庫(70例)的GBM病例，其中男性319例，女性174例，另有52例不詳；358例患者有年齡記錄，平均年齡為(55.8±13.2)歲；295例患者有MGMT甲基化分組信息，其中MGMT超甲基化者141例，MGMT低甲基化者154例。

二、HER2基因mRNA表達與試驗組(TCGA病例組)預后的關系

288例試驗組(TCGA病例組)患者的HER2基因的中位表達值為0.1409。根據(jù)分組界值，試驗組的病例被平均分成HER2基因高表達組(144例)和低表達組(144例)。生存分析顯示HER2基因高表達組患者的中位OS短于低表達組患者，其中高表達組中位OS為15.1個月(95%可信區(qū)間：13.6～16.6個月)，低表達組中位OS為16.7個月(95%可信區(qū)間：13.0～20.5個月)，P=0.013(圖1)。

三、HER2基因mRNA表達與驗證組(REMBRANT和GSE7696病例組)預后的關系

為了減少假陽性結果的可能性，進一步驗證HER2基因表達與GBM預后的關系，我們分別將事先確定的HER2基因mRNA的分組界值帶到兩組獨立GBM病例組中進行驗證。與試驗組結果相似，在REMBRANT病例組中，101例HER2基因高表達者的中位OS(12.0個月；95%可信區(qū)間：8.1～15.9個月)短于86例低表達者(17.5個月；95%可信區(qū)間：14.0～21.1個月)，P=0.002(圖2A)。同樣地，在GSE7696病例組中，27例HER2基因高表達者的中位OS(11.4個月；95%可信區(qū)間：9.0～13.7個月)也短于43例低表達者(15.7個月；95%可信區(qū)間：14.2～17.2個月)，P=0.044(圖2B)。

圖1 HER2基因表達分組與TCGA病例組預后的關系

Fig 1 The prognostic value of HER2 gene expression groups in TCGA dataset

圖2 HER2基因表達分組與各數(shù)據(jù)庫中GBM患者OS的關系

Fig 2 The prognostic value of HER2 gene expression-based groups in each GBM dataset with respect to OS

A: REMBRANDT dataset; B: GSE7696 dataset.

表1 多因素Cox回歸分析結果

Tab 2 Results of multivariate Cox regression analysis

PrognosticfactorsHazardratio95%Confidenceinterval HER2mRNAexpressiongroups1．220．90～1．64 MGMTpromotermethylationstatus0．540．40～0．72a Ageoverorbelow65yearsold1．501．04～2．14b

aP<0.05,vsunmethylated;bP<0.05,vsbelow 65

四、HER2基因表達水平與患者年齡，MGMT甲基化狀態(tài)在預后評價中的關系

為了擴大樣本量，我們將三組GBM數(shù)據(jù)庫進行合并，用以研究HER2基因mRNA表達與其他預后因素的關系。多因素Cox回歸分析表明HER2基因表達分組并不是獨立于患者年齡和MGMT甲基化狀態(tài)的預后因素(表1)。

隨后，分層分析表明年齡因素和MGMT甲基化狀態(tài)影響HER2基因mRNA表達水平的預后評價作用，即HER2基因的mRNA表達對于65歲以下或MGMT超甲基化的患者具有預后評價作用，而對于65歲以上和MGMT低甲基化的患者則缺乏預后評價意義(圖3A～D)。

圖3 HER2基因表達分組與不同MGMT甲基化狀態(tài)或不同年齡的GBM患者OS的關系

Fig 3 The relationship between HER2 mRNA expression grouping and GBM patients with different MGMT methylation status or different age

A: The patients with MGMT unmethylated GBMs; B: The patients with MGMT methylated GBMs; C: The patients aged below 65 years old; D: The patients aged at or above 65 years old.

討 論

由于主要是因為GBM是一類異質(zhì)性很強的腫瘤，不同GBM樣本具有不同的病理特點和分子特征。因此，如何細化GBM患者的預后評價以及尋找有效的個體化治療靶點對于治療GBM具有十分重要的意義。研究證實，EGFR家族中EGFR基因是參與GBM病理過程的重要分子，其下游信號通路的失調(diào)會導致細胞異常增殖或凋亡[3]。該家族中另一個重要成員-HER2基因異常表達，同樣通過激活下游的生長調(diào)節(jié)通路，導致腫瘤細胞增殖凋亡的失衡，促進腫瘤的進展[2]。在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)通過抑制或封閉HER2基因及其下游的信號通路能夠很好的抑制或殺死腫瘤細胞，這些研究結果使得以HER2基因為靶向的腫瘤治療策略逐漸成為研究熱點[2]，并取得了很好的臨床效果[6]。然而，盡管研究證實HER2基因參與多種惡性腫瘤的發(fā)病并且作為治療靶點效果明顯，但其與GBM之間的關系目前尚不清楚。本試驗結果提示HER2基因高表達的GBM患者的OS較短于低表達的患者，這一結果在三組不同的病例組中均得到驗證。因此，我們認為，與其他惡性腫瘤相似，HER2基因的異常表達很可能參與了GBM的進展過程。臨床上針對GBM樣本檢測HER2基因表達可能有助于患者預后的評價。然而，多因素Cox回歸分析表明HER2基因的表達水平并不是獨立的預后因素，其預后評價作用一定程度上受患者年齡因素和MGMT甲基化狀態(tài)的影響。進一步的分層分析表明，在65歲以下或MGMT超甲基化的患者中，HER2基因的表達分組能夠區(qū)分不同預后的患者，但在65歲以上或MGMT低甲基化的患者人群中，HER2基因的表達分組無法區(qū)分不同預后的患者。綜合分析后我們認為，HER2基因表達聯(lián)合患者年齡或MGMT甲基化分組因素能夠進一步優(yōu)化GBM患者的預后評價。

GBM對于傳統(tǒng)治療手段缺乏良好的反應。盡管目前臨床上采用包括腫瘤切除、標準劑量放療(60 Gy)和替莫唑胺同步化療在內(nèi)的綜合治療策略，GBM患者的中位OS十分有限，只有12～15個月左右[1]。近些年來，以靶向藥物為主的治療策略逐漸成為了GBM的研究熱點[1]。然而，最新發(fā)表的 3期臨床試驗表明，現(xiàn)有的針對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GBM重要分子特征的靶向藥物，例如：針對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)通路的bevacizumab，針對整合素通路的cilengitde，針對EGFR通路的nimotuzumab的治療效果并不理想[7～10]。我們的研究提示HER2基因可能成為新的GBM治療靶點，為未來在GBM治療中采用HER2基因靶向治療提供了臨床依據(jù)。

1Yin AA, Cheng JX, Zhang X, et al. The treatment of glioblastomas: a systematic update on clinical Phase III trials [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2013, 87(3): 265-282.

2Arteaga CL, Engelman JA. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics [J]. Cancer Cell, 2014, 25(3): 282-303.

3Yarden Y, Pines G. The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology [J]. Nat Rev Cancer, 2012, 12(8): 553-563.

4Martin V, Cappuzzo F, Mazzucchelli L, et al. HER2 in solid tumors: more than 10 years under the microscope; where are we now? [J]. Future Oncol, 2014, 10(8): 1469-1486.

5Zhang XQ, Sun S, Lam KF, et al. A long non- coding RNA signature in glioblastoma multiforme predicts survival [J]. Neurobiol Dis, 2013, 58: 123-131.

6Kumler I, Tuxen MK, Nielsen DL. A systematic review of dual targeting in HER2-positive breast cancer [J]. Cancer Treat Rev, 2014, 40(2): 259-270.

7Chinot OL, Wick W, Mason W, et al. Bevacizumab plus radiotherapy- temozolomide for newly diagnosed glioblastoma [J]. N Engl J Med, 2014, 370(8): 709-722.

8Gilbert MR, Dignam JJ, Armstrong TS, et al. A randomized trial of bevacizumab for newly diagnosed glioblastoma [J]. N Engl J Med, 2014, 370(8): 699-708.

9Nabors LB, Mikkelsen T, Hegi ME, et al. A safety run-in and randomized phase 2 study of cilengitide combined with chemoradiation for newly diagnosed glioblastoma (NABTT 0306) [J]. Cancer, 2012, 118(22): 5601-5607.

10Solomon MT, Selva JC, Figueredo J, et al. Radiotherapy plus nimotuzumab or placebo in the treatment of high grade glioma patients: results from a randomized, double blind trial [J]. BMC Cancer, 2013, 13(1): 299-307.

SignificanceoftheexpressionofHER2geneintheprognosisevaluationofpatientswithglioblastoma

SUHui,DAIYiwu,QINJiazhen,BAIMiaochun,YANGYi,XURuxiang

DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedBayiBrainHospital,BeijingMilitaryGeneralHospital,Beijing100700, China

ObjectiveThe dysregulation of human epidermal growth factor receptor-2 (HER2) gene is involved in various malignant tumors including breast cancers and gastric cancers. However, the relationship between HER2 gene expression and glioblastoma (GBM) is not clear. The study aims to study the expression of HER2 gene in the evaluation of prognosis of patients with glioblastoma.MethodsGenome-wide gene expression data and corresponding patient's clinical data were downloaded from The Cancer Genome Atlas (TCGA), Repository for Molecular Brain Neoplasia Data (REMBRANDT), and Gene Expression Omnibus (GEO) with accession number of GSE7696, to investigate the prognostic value of HER2 mRNA expression in GBM patients using Kaplan-Meier method and multivariate Cox regression analysis.ResultsIn TCGA data-set (N=288), patients with higher HER2 expression were associated with shorter overall survival (OS) than patients with lower HER2 expression (median OS: 15.1 [95% confidence interval (CI) 13.6～16.6]vs. 16.7 [95% CI 13.0～20.5] months,P=0.013); similarly, in another two validation data-sets, patients in higher expression groups had shorter OS than those in lower expression groups (REMBRANT dataset: higher vs. lower, 12.0 [95% CI 8.1～15.9]vs. 17.5 [95% CI 14.0～21.1] months,P=0.002; GSE7696 dataset: highervs. lower, 11.4 [95% CI 9.0～13.7]vs. 15.7 [95% CI 14～2-17.2] months,P=0.044); HER2 mRNA expression was not an independent prognostic indictor, and its prognostic value was partly dependent on age and O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter methylation status.ConclusionThe present study indicates and validates the relationship between HER2 gene expression and GBM patients' OS. The study also provides the clinical evidence on HER2-based GBM subclassification and personalized medicine.

Human epidermal growth factor receptor-2; Gene expression microarray; Glioblastoma; Prognosis

1671-2897(2016)15-144-04

·論著·

R 739

A

國家自然科學基金資助項目(81271391)

蘇輝，醫(yī)師，碩士，E-mail: 370285suhui@163.com

*通訊作者： 戴宜武，教授、主任醫(yī)師，碩士與博士生導師，E-mail: dddyyywww@163.com

2015-07-02；

2015-08-30)