賀昭忠 徐文斐 鄭淑芳 劉福生 (青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島 266003)

服用阿司匹林對腦出血周圍組織水腫影響的實驗研究

賀昭忠*徐文斐 鄭淑芳 劉福生
(青島大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 青島 266003)

目的探討長期服用阿司匹林是否對腦出血周圍組織水腫有一定的影響。方法Wistar大鼠70只，隨機分為三個組：阿司匹林預處理腦出血組、阿司匹林預處理假手術(shù)組及非阿司匹林預處理腦出血組。阿司匹林預處理腦出血組及非阿司匹林腦出血組各30只，阿司匹林預處理假手術(shù)組10只，每組分3 h，1 d，3 d，5 d，7 d五個時間點。在相應的時間點灌注取腦，測定出各組不同時間點腦出血周圍水腫組織中水通道蛋白(AQP4)的表達情況，并進行對比研究。結(jié)果①AQP4在各組各個時間點的表達分別是：阿司匹林(ASA)預處理腦出血組AQP4表達水平在腦出血后第三天達到最高峰，與未服用ASA腦出血組高峰期是一致的。②對ASA預處理腦出血組與非ASA預處理腦出血組大鼠血腫周圍水腫組織AQP4表達各時間點比較，無顯著差異。結(jié)論①長期服用阿司匹林腦出血后3 h血腫周圍組織出現(xiàn)水腫；②3 d后水腫達最高峰，水腫持續(xù)7 d，與未服用阿司匹林腦出血組織水腫程度表現(xiàn)是一致的；③長期服用阿司匹林對腦出血周圍水腫嚴重程度無顯著影響。

阿司匹林; 腦出血; 水通道蛋白4; 大鼠

長期服用阿司匹林腦出血患者死亡率及致殘率明顯高于未服用阿司匹林患者[1]，除了服用阿司匹林導致血腫較易擴大、易再出血等原因是否存在其他原因？腦出血患者死亡率及致殘率高主要與血腫對腦組織的直接破壞有關(guān)，腦出血后周圍組織水腫對腦組織的損害也影響患者的轉(zhuǎn)歸[2]。本實驗通過檢測水通道蛋白(aquaporin-4, AQP4)在服用阿司匹林大鼠腦出血周圍水腫組織表達情況并與未服用阿司匹林大鼠血腫周圍水腫腦組織表達對比研究，明確兩者間是否存在顯著差異。

材料與方法

一、實驗動物及分組

成年Wistar大鼠70只，體質(zhì)量250～300 g。隨機分為三組，A組：阿司匹林預處理腦出血組、阿司匹林預處理假手術(shù)組；B組：非阿司匹林預處理腦出血組。每組分3 h，1 d，3 d，5 d，7 d五個時間點，阿司匹林預處理腦出血組和非阿司匹林預處理腦出血組每時間點6只，阿司匹林預處理假手術(shù)組每個時間點2只。將阿司匹林泡騰片100 mg/片溶于40 ml 0.9%生理鹽水中，術(shù)前連續(xù)灌胃2 w，每天1次，A組劑量為10.5 mg/kg[3]，每7 d根據(jù)體重調(diào)整阿司匹林灌胃劑量，B組給予同等容量的生理鹽水灌胃。

二、動物模型的制備

大鼠腦出血模型制備：應用江灣I型鼠腦立體定向儀，制備大鼠腦出血模型。①大鼠灌胃3 w，稱取重量后，應用10%水合氯醛腹腔注射麻醉實驗大鼠(300 mg/kg)。②麻醉成功后的大鼠俯臥位固定在鼠腦立體定向儀上(圖1)，使前后囟在同一水平面上，頭部術(shù)區(qū)備皮，75%酒精消毒，在頭部正中線沿矢狀縫方向切開皮膚，長約3 cm，向兩側(cè)推開骨膜，雙氧水止血，顯露出前囟，前囟后0.2 mm，中線右側(cè)旁開3 mm，標記筆標記，應用牙科細鉆頭鉆孔，直徑約1 mm，垂直進針深度5.5 mm。在助手協(xié)助下，自大鼠尾動脈抽取不抗凝動脈血50 μl。③應用二次退針法，進針后先緩慢注射10 μl，停針2 min，后繼續(xù)緩慢注射剩余40 μl血液，停針5 min后，緩慢退針2 mm，停留10 min后，緩慢將針拔出，骨蠟封堵顱骨骨孔，縫合切口，術(shù)區(qū)酒精消毒，預防感染。④麻醉蘇醒后3 h，應用Longa評分法評價實驗大鼠的神經(jīng)功能缺失。1～3分的實驗大鼠納入為研究對象，腦組織切片血腫破入腦室、血液沿進針道反流等不符合條件的大鼠剔除，并隨機補充實驗大鼠。

三、標本的采集及處理

在相應的時間點，稱重后腹腔麻醉大鼠，仰臥固定于解剖板上，固定四肢，開胸充分暴露心臟，夾住腹主動脈，灌注針自左心室尖部插入送至主動脈內(nèi)妥善固定，剪開右心耳，0.9%生理鹽水快速由灌注針滴注，無血液流出后換4%多聚甲醛灌注。灌注完畢后斷頭取腦(圖2)，腦組織注血點前1 mm冠狀位切開腦組織，向后選取厚度為0.5 cm腦組織(圖3)用10%甲醛浸泡固定24 h，脫水，包埋，切片，用作HE染色及AQP4的測定。

四、統(tǒng)計學分析

圖1 大鼠固定于立體定向儀圖2 多聚甲醛灌注鼠腦圖3 大鼠腦組織血腫圖片

Fig 1 Wister rat was fixed on stereotaxic apparatus Fig 2 The Wister rat brain was irrigated with paraformaldehyde Fig 3 The picture of cerebral hemorrhagein in Wster rat

結(jié) 果

AQP4空白對照應用PBS代替一抗。免疫組織化學方法檢測顯示大鼠腦組織血腫周圍水腫帶中AQP4的表達結(jié)果：光鏡下，水腫帶的腦膠質(zhì)細胞包體及周圍神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣改變，細胞包膜上棕褐色深染，AQP4主要分布于星形膠質(zhì)細胞細胞包膜[4]。HE染色光鏡下，3 h時神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞體出現(xiàn)腫脹，3 d時，細胞腫脹達到高峰，水腫帶細胞胞體及周圍神經(jīng)纖維網(wǎng)出現(xiàn)大量空泡，血腫部位及其周圍腦組織出現(xiàn)炎性細胞增生，核分裂增強。阿司匹林(aspirin, ASA)預處理腦出血組及對照腦出血組中3 h腦組織水腫帶中AQP4表達均升高，在3 d時AQP4表達達到高峰，7 d后其AQP4表達水平仍高于ASA預處理假手術(shù)組(圖4，表1)。

一、ASA預處理組與非ASA預處理組比較

AQP4在ASA預處理組出血后3 h、1 d、3 d、5 d、7 d的表達與非ASA預處理組比較差異不明顯，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

二、ASA預處理組與ASA預處理假手術(shù)組比較

AQP4在ASA預處理組出血后3 h、1 d、3 d、5 d、7 d的表達與ASA預處理假手術(shù)組比較差異明顯，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Group3h24h3d5d7d ASA37．31±2．01a42．85±1．45a50．64±1．64a44．25±1．49a39．72±1．37a NOASA37．07±2．3742．65±1．7150．57±2．2444．10±1．8339．40±1．84 ASAoperated11．21±1．6511．21±1．6511．21±1．6511．21±1．6511．21±1．65

aP<0.05,vsASA operated group.

圖4 AQP4在服用阿司匹林及未服用阿司匹林大鼠腦出血周圍水腫組織不同時間點的表達(×400)

Fig 4 Immunohistochemical staining of AQP4 on edema brain after cerebral hemorrhage in rats with aspirin or without aspirin(×400)

A: The expression of AQP4 at 3 h after cerebral hemorrhage in ASA group; B: The expression at 1 d; C: The expression at 3 d; D: The expression at 5 d; E: The expression at 7 d; F: The expression of AQP4 at 3 h after cerebral hemorrhage in No ASA group; G: The expression at 1 d; H: The expression at 3 d; I: The expression at 5 d; J: The expression at 7 d.

討 論

阿司匹林(aspirin)又稱乙酰水楊酸，可使前列腺素(prostaglandin, PG)合成酶活性中心的絲氨酸乙?；Щ?，從而阻斷環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, cox)的催化位點與底物的結(jié)合，不可逆地抑制血小板環(huán)氧酶，其失活后不能重新生成，減少了血小板中血栓素A2生成，從而影響血小板的聚集及抗血栓形成，達到抗凝作用[5]。血小板的平均生命周期為7～10 d，其更新速度約為10%/d，每天服用1次阿司匹林即可達到有效濃度，維持抗血栓的作用[6]。 阿司匹林在心腦血管疾病一級和二級預防中的作用已達到廣泛認可[7]，隨著人民生活水平及文化程度的提高，許多中老年人長期服用小劑量的阿司匹林來預防心腦血管缺血性疾病一級和二級預防[8]。最近研究顯示長期服用阿司匹林其發(fā)生腦出血的風險較服用安慰劑增加25%，其嚴重的顱內(nèi)出血風險增加50%[9]。還顯示服用阿司匹林的患者在發(fā)生腦出血后，預后較非服用阿司匹林患者差[10]。

本實驗研究結(jié)果顯示：ASA預處理組的大鼠與非ASA預處理的大鼠在血腫周圍水腫帶中AQP4的表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明長期服用阿司匹林腦出血患者臨床治療效果差于未服用阿司匹林者主要是由于阿司匹林影響到了人體組織凝血機制，使得一旦出現(xiàn)腦出血，出血不易停止，腦出血的的量常常多于未服用阿司匹林者，而不是由于其周圍水腫嚴重于未服用者。另外，由于本實驗選用的動物數(shù)量較少，服用阿司匹林的時間不是太長，得出的結(jié)果還需選擇更多的實驗動物繼續(xù)研究。本實驗在服用ASA組與非ASA組中的大鼠其模型的出血量是一定的，這與自發(fā)性的高血壓腦出血有一定的差異。與臨床診療中，長期規(guī)律服用阿司匹林腦出血的患者通常較未應用阿司匹林的患者預后差[11]，可能與以下幾方面因素有關(guān)：①長期服用阿司匹林患者腦出血時，出血量常較未服用阿司匹林患者出血量大。②由于其血液凝固性差，發(fā)生再出血的概率較未服用阿司匹林患者高，預后差。③需要服用阿司匹林的患者可能患有更嚴重基礎疾病(如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓等)，無論其手術(shù)還是保守治療，其恢復較慢。④服用阿司匹林患者較未服用阿司匹林患者在需要手術(shù)治療時，由于服用阿司匹林抑制了血小板正常的功能，血液凝固性差，術(shù)中出血量大、止血困難，手術(shù)時間長，對腦組織損傷大。⑤腦出血對腦組織的損害除了出血造成腦組織的直接損害，還與血腫的占位效應有關(guān)，血腫造成了周圍腦組織微循環(huán)障礙，血-腦屏障受損，及血腫分解的活性物質(zhì)及炎性成分對腦組織的損害[12]。本實驗研究結(jié)果顯示：腦出血組大鼠血腫周圍腦水腫帶區(qū)域AQP4的表達在3 h時出現(xiàn)升高，在3 d時，其表達量達到高峰，隨后其表達降低，7 d時達到最低，但仍高于假手術(shù)組的大鼠。本實驗結(jié)果與以往研究結(jié)果相似。服用ASA組的大鼠與未服用ASA組的大鼠AQP4升高曲線大致相同，差異無統(tǒng)計學意義。

1Ren C, Guingab-Cagmat J, Kobeissy F, et al. A neuroproteomic and systems biology analysis of rat brain post intracerebral hemorrhagic stroke [J]. Brain Res Bull, 2014,102: 46-56.

2Wei P, You C, Jin H, et al. Correlation between serum IL-1beta level and cerebral edema extent in a hypertensive intracerebral hemorrhage rat model [J]. Neurol Res, 2014, 36(2): 170-175.

3Kang K, Kim YJ, Lee SH, et al. Lithium fails to enhance neurogenesis in subventricular zone and dentate subgranular zone after intracerebral hemorrhage in rats [J]. Neurol Res, 2014, 36(1): 79-85.

4Zhao R, Feng XY, Zhang M, et al. Progressive hemorrhagic transformation following dual antiplatelet therapy [J]. CNS Neurosci Ther, 2014, 20(1): 92-94.

5曲良鎖, 毛涌馨, 張文怡, 等. 長期服用阿司匹林的腦出血患者急癥手術(shù)治療 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 14(1): 33-36.

6Yamashiro K, Tanaka R, Okuma Y, et al. Associations of durations of antiplatelet use and vascular risk factors with the presence of cerebral microbleeds [J]. J Stroke Cereb, 2014, 23(3): 433-440.

7Palacio S, Hart RG, Pearce LA, et al. Effect of addition of clopidogrel to aspirin on mortality: systematic review of randomized trials [J]. Stroke, 2012, 43(8): 2157-2162.

8Al-Shahi Salman R, Dennis MS, et al. Antiplatelet therapy may be continued after intracerebral hemorrhage [J]. Stroke, 2014, 45(10): 3149-3150.

9李曉賓, 李傳玲, 董瑞國, 等. 實驗性出血性腦水腫水通道蛋白4表達與MRI變化的相關(guān)性研究 [J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學雜志, 2010, 9(10): 996-1000.

10Chiu CD, Chi CC, Shen CC, et al. Hyperglycemia exacerbates intracerbral hemorrhage via the downregulation of aquaporin 4: temporal assessmrnt with magnetic resonance imaging [J]. Stroke, 2013, 44(6): 1682-1689.

11Tang Y, Wu P, Su J, et al. Effects of Aquaporin-4 on edema formation following intracerebral hemorrhage [J]. Exp Neurol, 2010, 223(2): 485-495.

12Geng C, Ren C, Wang T, et al. Effect of ischemic postconditioning on an intracerebral hemorrhage stroke model in rats [J]. Neurol Res, 2012, 34(2): 143-148.

Effectofirrigationwithaspirinonexpressionofaquaporin-4inedemabrainaftercerebralhemorrhageinrats

HEZhaozhong,XUWenfei,ZHENGShufang,LIUFusheng

DepartmentofNeurosurgery,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003, China

ObjectiveThe effect of irrigated with aspirin on the expression of aquaporin-4 (AQP4) on edema brain after cerebral hemorrhage in rats was investigated.MethodsA total of 70 adult male Wistar rats were divided randomly into three groups: aspirin-irrigation group with 30 rats (ASA group), aspirin-irrigation and hemorrhage removal group with 30 rats (ASA operation group) and water-irrigation group with 10 rats (No ASA group). And the analysis was performed at 3 h, 1 d, 3 d, 5 d, and 7 d after cerebral hemorrhage. The expressions of AQP4 on edema brain after cerebral hemorrhage in rats in all groups were analyzed.ResultsThe expression of AQP4 peaked at 3 d after cerebral hemorrhage to ASA group, which was consistent with No ASA group. There was no significant difference in the expression of AQP4 at all the time points between ASA group and No ASA group (P>0.05).ConclusionThe brain edema appears at 3 h following cerebral hemorrhage in rats with aspirin irrigation, peaks at 3 d and lasts for 7 d. There is no difference between ASA and No ASA group. Aspirin irrigation has no effect on the brain edema after cerebral hemorrhage.

Aspirin; Cerebral hemorrhage; AQP4; Rat

1671-2897(2016)15-105-04

·腦血管疾病研究·

R 739.41

A

青島市科技局基金資助項目(12-1-4-2-20)

賀昭忠，教授、主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail: hezhaozhong1988@aliyun.com

*通訊作者： 賀昭忠，教授、主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail: hezhaozhong1988@aliyun.com

2015-11-01；

2015-12-30)