劉艷 田秀標(biāo) 韓穎 石節(jié)麗 徐福娟 高鵬飛 張秋羽 謝云

·論著·

血管緊張素1-7與糖尿病及糖尿病腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系的研究

劉艷 田秀標(biāo) 韓穎 石節(jié)麗 徐福娟 高鵬飛 張秋羽 謝云

目的調(diào)查糖尿病患者血管緊張素1-7(Ang1-7)水平和評價Ang1-7對糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。方法選取2014年12月至2015年6月于天津市海濱人民醫(yī)院未診斷為糖尿病的95名體檢人員為研究對象，所有受試者均進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗，根據(jù)血糖水平分為健康組(n=31)、血糖異常組(n=32)和糖尿病組(n=32)。檢測其體重、腰圍、血壓、肝功能、腎功能、Ang1-7、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)2等指標(biāo)。分析血糖與Ang1-7、ACE2的相關(guān)性。另外，選取10只150～200 g健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，通過腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型，全部成功，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法，分為糖尿病組和Ang1-7組，每組5只，分別皮下泵入生理鹽水和Ang1-7，另選取5只健康SD大鼠作為正常組。干預(yù)2周后處死所有大鼠，留取腎組織標(biāo)本，Western印跡和實時熒光定量PCR檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、轉(zhuǎn)錄活性因子4(ATF4)、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)水平。結(jié)果與健康組相比，血糖異常組和糖尿病組甘油三酯、ACE2、Ang1-7水平均升高；糖尿病組較健康組升高更明顯(F=5.57,6.12,5.44,P均<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示，糖尿病組、血糖異常組的空腹血糖、餐后血糖均與Ang1-7呈正相關(guān)(r=0.69，0.45，P均<0.01；r=0.54，0.52，P均<0.01)。與正常組相比，糖尿病組大鼠腎臟GRP78、ATF4和CHOP水平明顯升高；與糖尿病組相比，Ang1-7組GRP78、ATF4和CHOP水平明顯下降 (t=20.3，25.7，19.6，P均<0.05)。與同期正常組比較，糖尿病組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP的mRNA均顯著上調(diào)。與糖尿病組比較，Ang1-7組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP的mRNA的表達(dá)受到顯著抑制(t=15.1，11.6，12.3，P均<0.05)。結(jié)論Ang1-7水平隨著受試者血糖濃度的升高而升高，另外，Ang1-7可降低糖尿病大鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白水平。

血管緊張素1-7；糖尿??；糖尿病腎病；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平升高可增加胰島素抵抗，促進(jìn)胰島纖維化和凋亡[1-3]。而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)2可催化AngⅡ生成血管緊張素1-7(Ang1-7)。Ang1-7可通過與其特異性受體Mas結(jié)合，拮抗AngⅡ的縮血管效應(yīng)[1-2]。因此，ACE2/Ang1-7/Mas軸在拮抗RAAS中發(fā)揮重要作用，本研究擬調(diào)查不同血糖濃度人群體內(nèi)Ang1-7的水平。

糖尿病腎臟疾病是糖尿病的常見并發(fā)癥，RAAS的靶器官主要是腎臟，糖尿病時，AngⅡ可過度激活腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而Ang1-7對糖尿病腎小管上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，可抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、腎間質(zhì)纖維化等[4-5]。故推測外源性Ang1-7干預(yù)可能通過拮抗AngⅡ改善ERS，減少糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡。因此，本研究擬觀察外源性Ang1-7對糖尿病大鼠腎組織ERS的影響。

1 對象與方法

1.1 人群研究

1.1.1 研究對象 選取2014年12月至2015年6月于天津市海濱人民醫(yī)院體檢的未診斷糖尿病的人員為研究對象。根據(jù)2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(2010年版《中國2型糖尿病防治指南》)，將研究對象分為健康組31名，年齡(43.4±8.1)歲，血糖異常組32名，年齡(45.2±8.4)歲， 糖尿病組32例，年齡(46.6±6.1)歲[6]。血糖異常組包括空腹血糖受損(空腹血糖介于6.1～7.0 mmol/L)和餐后血糖調(diào)節(jié)受損(餐后2 h血糖介于7.8～11.1 mmol/L)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎功能異常；呼吸系統(tǒng)疾病；嚴(yán)重心、腦血管系統(tǒng)疾病及腫瘤放射治療、化學(xué)治療者；精神異常；妊娠期或哺乳期；正在參加其他類似研究項目者。本研究經(jīng)天津海濱人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均知情同意且自愿參加。

1.1.2 觀察指標(biāo) 問診3組患者的一般情況，包括性別、年齡、吸煙史、家族史等；測量身高、體重、腰圍、血壓等指標(biāo)?？崭? h以上，早上抽取靜脈血留取血樣后，行口服葡萄糖耐量試驗檢測空腹血糖(葡萄糖氧化酶法)、空腹胰島素(FINS，電化學(xué)發(fā)光法)，同時檢測總膽固醇和甘油三酯 (采用酶比色法)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和總膽固醇(化學(xué)沉淀法)、HbA1c(酶比色法)。采用ELISA檢測Ang1-7和ACE2水平。穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×FINS/22.5，當(dāng)HOMA-IR>2.8時判定存在胰島素抵抗。

1.2 動物實驗

1.2.1 分組及干預(yù) 選擇150～200 g健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠15只，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只給予腹腔注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH值4.5，濃度為2%，劑量100 mg/kg)制備糖尿病大鼠模型，2 d后尾靜脈采血測血糖，大于16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型，10只均成模，余下5只作為正常組注射相當(dāng)體積的檸檬酸緩沖液。將糖尿病大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組5只，Ang1-7組給予Ang1-7(576 ng/d)藥泵干預(yù)，糖尿病組泵入相當(dāng)體積生理鹽水，2周后處死所有大鼠，留取腎組織標(biāo)本。

1.2.2 Western印跡及實時熒光定量PCR法檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、轉(zhuǎn)錄活性因子4(ATF4)、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP) 腎組織蛋白提取、Western印跡等實驗技術(shù)流程見文獻(xiàn)[7]。實時熒光定量PCR法檢測GRP78、ATF4和CHOP mRNA的表達(dá)：采用Trizol、氯仿和異丙醇抽提大鼠腎組織總RNA，RNA的濃度由A260/A280比值和1%瓊脂糖凝膠電泳確定。按照日本TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系20 μl，條件為42℃ 10 min，30℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。GRP78、ATF4、CHOP和GAPDH引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1 各目的基因的引物序列及擴(kuò)增長度

注：GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；ATF4：轉(zhuǎn)錄活性因子4；CHOP：增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；GAPDH：甘油醛-3磷酸脫氫酶

采用美國Applied Biosystems公司PCR-System-9700進(jìn)行實時熒光定量PCR，反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性1 min，隨后 95℃ 5 s，60℃ 30 s反應(yīng)40個循環(huán)。按公式計算基因相對表達(dá)量2-△△Ct，再進(jìn)行各組間比較。

1.2.3 試劑 Ang1-7 ELISA試劑盒LSBIO公司，貨號LS-F25115，ACE2試劑盒(ORIGENE公司，貨號59272)；鏈脲佐菌素(Sigma公司，貨號S0130)；藥物Ang1-7(Sigma公司，貨號A9202)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0011)；一抗GRP78、ATF4和CHOP(Cell Signaling Technology公司，貨號分別為3177S，11815S，2895S)；β-actin(ABclonal公司，貨號AC004)。一抗用PBS按照1∶1 000稀釋。

2 結(jié)果

2.1 不同血糖濃度人群臨床資料和生化指標(biāo)比較

3組基線時年齡、性別、糖尿病家族史、高血壓病史、體重指數(shù)、體重、血壓、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和腎功能等的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。糖尿病組甘油三酯、ACE2、Ang1-7水平較健康組和血糖異常組明顯升高(P均<0.017)?？崭寡恰⒉秃笱桥cAng1-7相關(guān)(r=0.69， 0.45，P均<0.01)。血糖異常組空腹血糖、餐后血糖與Ang1-7亦相關(guān)(r=0.54，0.52，P均<0.01)，見表2。

2.2 Western印跡和實時熒光定量PCR分析大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP的表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，與正常組相比，糖尿病組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)量均明顯增加 (t=16.4，17.6，19.3，P均<0.05)；Ang1-7組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP蛋白表達(dá)量均較糖尿病組明顯降低 (t=20.3，25.7，19.6，P均<0.05)，見圖1。與正常組相比，糖尿病組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP的mRNA均顯著上調(diào)(t=15.7,20.3，19.1，P均<0.05)。與糖尿病組相比，Ang1-7組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP mRNA的表達(dá)受到顯著抑制(t=15.1，11.6，12.3，P均<0.05)，見圖2。

3 討論

RAAS在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。AngⅡ水平升高可促進(jìn)胰島細(xì)胞、腎組織、心肌等氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡，而ACE2能通過水解 AngⅡ生成 Ang1-7，Ang1-7可增強(qiáng)緩激肽作用以舒張血管，增加組織的血供，并促進(jìn)骨骼肌及脂肪組織攝取葡糖糖，從而減輕胰島素抵抗[7-8]。Ang1-7可通過與其特異性受體Mas結(jié)合，亦可通過抑制ACE活性減少AngⅡ生成，與AngⅡ受體競爭性結(jié)合，拮抗AngⅡ?qū)е碌目s血管效應(yīng)、胰島素抵抗、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、纖維化等不良作用[1-2]。

表2 3組受試者一般臨床資料及Ang1-7、ACE2水平比較

注：1 mmHg=0.133 kPa；BMI：體重指數(shù)；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；Cr：肌酐；BUN：尿素氮；UA：尿酸；TC；總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C:低密度脂蛋白-膽固醇；ACE2：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2；Ang1-7：血管緊張素1-7；FBG：空腹血糖；PPG：餐后血糖；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)；與健康組相比，aP<0.01； 與血糖異常組相比，bP<0.01

注：GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；ATF4：轉(zhuǎn)錄活性因子4；CHOP：增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；β-actin：β-肌動蛋白；Ang1-7：血管緊張素1-7；與正常組相比，aP<0.05；與糖尿病組相比，bP<0.05圖1 3組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP蛋白的表達(dá)

注：GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；ATF4：轉(zhuǎn)錄活性因子4；CHOP：增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；GAPDH：甘油醛-3磷酸脫氫酶；Ang1-7：血管緊張素1-7；與正常組相比，aP<0.05；與糖尿病組相比，bP<0.05圖2 3組大鼠腎組織GRP78、ATF4和CHOP mRNA的表達(dá)變化

本研究顯示，2型糖尿病患者血ACE2和Ang1-7水平較正常人升高，且與血糖水平呈正相關(guān)。王曉玉[9]研究顯示，糖尿病患者ACE2活性增強(qiáng)，可催化AngⅡ生成Ang1-7，從而降低AngⅡ和提高Ang1-7水平，進(jìn)而改善胰島血供。2型糖尿病大鼠模型胰島中ACE2的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，ACE2基因敲除動物模型空腹血糖升高、胰島素第一時相分泌減少和糖耐量異常[10-11]。因此，Ang1-7在糖尿病患者中水平升高是機(jī)體的自我保護(hù)作用，可減輕AngⅡ引起胰島損害和糖尿病并發(fā)癥[3-5]。在糖尿病心肌病患者中使用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類藥物后血清ACE2和Ang1-7水平均高于未使用ACEI和ARB的患者，其機(jī)制可能是ACEI和ARB類藥物直接抑制ACE-Ang Ⅱ-AngⅡ 1型受體軸的負(fù)性生物效應(yīng)，且通過增強(qiáng)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸的功能發(fā)揮積極的器官保護(hù)功能[12]。

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，RAAS在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。大鼠及小鼠研究顯示Ang1-7可通過結(jié)合Mas受體，拮抗AngⅡ，減弱胰島素抵抗，促進(jìn)脂聯(lián)素的表達(dá)，增加外周組織脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性，減輕胰島β細(xì)胞功能紊亂和胰島細(xì)胞凋亡[13-15]。糖尿病時，ERS度激活，高糖可促使GRP78通過活化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶上調(diào)ATF4，從而誘導(dǎo)CHOP表達(dá)，CHOP蛋白可削弱抗凋亡蛋白Bcl2的功能并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡介導(dǎo)因子Bax表達(dá)，GRP78、ATF4和CHOP水平升高與腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎組織損傷呈平行關(guān)系[4-5,16]。郝盼盼[12]使用外源性Ang1-7干預(yù)糖尿病大鼠，發(fā)現(xiàn)Ang1-7對糖尿病大鼠血脂和血糖水平無明顯影響，但可抑制糖尿病大鼠左心室心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕左室心肌肥厚和心功能障礙。徐春艷等[16]給予糖尿病大鼠AngⅡ1型受體阻滯劑可抑制腎組織ERS反應(yīng)，并能通過調(diào)節(jié)ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP、caspase-12和磷酸化c-Jun氨基末端激酶的表達(dá)，減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，減輕腎組織損害。Ang1-7可降低糖尿病大鼠胰腺組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，減弱胰島局部的氧化應(yīng)激水平，降低凋亡基因Bax mRNA表達(dá)及caspase-3的蛋白表達(dá)，增加抗凋亡基因Bcl2 mRNA的表達(dá)，減少胰島細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善胰島的形態(tài)和胰島素的分泌功能[7]。本研究表明，糖尿病大鼠腎臟ERS標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP等蛋白水平升高，給予Ang1-7干預(yù)后可從蛋白水平和基因水平降GRP78、ATF4、CHOP等表達(dá)，而CHOP可下調(diào)Bcl2和上調(diào)Bax的表達(dá)。因此，Ang1-7可增加腎組織在高糖時的抗凋亡能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)初診2型糖尿病患者血糖水平與Ang1-7水平呈正相關(guān)，且給予糖尿病大鼠Ang1-7可減輕腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激，有助于減輕高糖引起的腎臟病變，提示Ang1-7有望成為治療糖尿病腎病的潛在藥物。而本文不足之處在于，不能確定糖尿病患者經(jīng)過合理控制血糖后，其Ang1-7水平是否隨著血糖水平下降而降低；糖尿病腎臟疾病患者接受Ang1-7治療后腎功能是否改善，仍需要深入研究。

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Relationshipbetweenangiotensin1-7,diabetesandendoplasmicreticulumstressofdiabetickidney

LiuYan*,TianXiubiao,HanYing,ShiJieli,XuFujuan,GaoPengfei,ZhangQiuyu,XieYun.

*DepartmentofDiabeticNeurology,KeyLaboratoryofHormonesandDevelopment(MinistryofHealth),TheMetabolicDiseasesHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China

XieYun,Email:tjxieyun0108@sina.com

ObjectiveTo investigate the level of angiotensin 1-7(Ang1-7) in patients with diabetes, and to study the effects of Ang1-7 on endoplasmic reticulum (ER) stress in the kidney of diabetic rats.MethodsNinety-five subjects without diagnosed diabetes were screened in Tianjin Seaside People′s Hospital from December 2014 to June 2015. Oral glucose tolerance test was implemented. According to the level of blood glucose, subjects were divided into three groups: healthy group (n=31), impaired glucose group (n=32), and diabetes group (n=32). Body weight, waist circumference, blood pressure, liver function, renal function, Ang1-7, angiotensin-converting enzyme(ACE)2 and other indicators were detected. Relationship between blood glucose and Ang1-7 and ACE2 were analyzed. In addition, ten healthy male Sprague-Dawley (SD) rats (150-200 g) were chosen to induce diabetes through intraperitoneal injection of streptozotocin, and all succeeded. Ten diabetic rats were randomly divided into Ang1-7 group and diabetes group according to the random number method, and pumped into Ang1-7 or saline solution, respectively, with five rats in each group. Other five healthy SD rats were chosen as normal group. All rats were sacrificed after intervention for two weeks. Kidney specimens were used to test the level of ER stress proteins, including glucose-regulated protein(GRP)78, activity of transcription factor (ATF)4, enhancer binding protein homologous protein (CHOP), by Western Blotting and Real-time Quantitative PCR.ResultsCompared with healthy group, levels of triglycerides, ACE2, Ang1-7 in impaired glucose group and diabetes group were increased，especially the diabetes group(F=5.57,6.12,5.44, allP<0.01).Pearsoncorrelation analysis showed that fasting blood glucose and postprandial blood glucose in diabetes group and impaired glucose group were positive correlated with Ang1-7(r=0.69，0.45，allP<0.01；r=0.54，0.52，allP<0.01). Compared with normal group, levels of GRP78, ATF4, and CHOP were increased significantly in diabetes group; compared with diabetes group, levels of GRP78, ATF4, and CHOP were significantly reduced in Ang1-7 group(t=20.3, 25.7, 19.6, allP<0.05). Compared with normal group, mRNA levels of GRP78, ATF4, and CHOP were increased significantly in diabetes group; compared with diabetes group, levels of GRP78, ATF4, and CHOP were significantly reduced in Ang1-7 group (t=15.1, 11.6, 12.3, allP<0.05).ConclusionsThe level of Ang1-7 evelates with the increase of blood glucose concentration in subjects. Ang1-7 reduces ER stress in the kidney of diabetic rats.

Angiotensin 1-7; Diabetes mellitus; Diabetic kidney disease; Endoplasmic reticulum stress

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.03.04

300070 天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院糖尿病神經(jīng)內(nèi)科，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室(劉艷，謝云)；

300280 天津海濱人民醫(yī)院內(nèi)分泌科(劉艷，田秀標(biāo)，韓穎，石節(jié)麗，徐福娟，高鵬飛)，消化科(張秋羽)

謝云，Email: tjxieyun0108@sina.com

2015-09-26)