李興佳 鄭全喜 陳國芳 茅曉東 劉超

·論著·

七葉皂苷鈉抑制人甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞株增殖作用的研究

李興佳 鄭全喜 陳國芳 茅曉東 劉超

目的研究七葉皂苷鈉對人甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞株增殖的潛在抑制作用及其分子機(jī)制。方法以不同濃度的七葉皂苷鈉(0，20，40，60，80 μmol/L)處理HTh74細(xì)胞48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；以不同濃度的七葉皂苷鈉(0，20，40，60，80 μmol/L)處理HTh74細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，噻唑藍(lán)比色(MTT)法檢測七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞株增殖的抑制效應(yīng)并計算細(xì)胞增殖率及半數(shù)抑制率(IC50)；以不同濃度的七葉皂苷鈉(0，5，10，15，20，25 μmol/L)處理HTh74細(xì)胞48 h后，Western印跡檢測七葉皂苷鈉引起的蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果七葉皂苷鈉作用后，細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮，且作用濃度越高細(xì)胞皺縮越明顯；MTT法結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞有顯著的生長抑制作用，呈現(xiàn)典型的時間與劑量依賴性，80 μmol/L七葉皂苷鈉作用24 h，對細(xì)胞的生長抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=111.4，P<0.01)，而40 μmol/L作用48 h及72 h時， 細(xì)胞生長均受到抑制(F=543.6，722.1，P<0.01)，并且48 h的IC50為69.4 μmol/L，72 h的IC50為32.5 μmol/L；七葉皂苷鈉作用48 h后Akt、p-Akt和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2的表達(dá)顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，低濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)七葉皂苷鈉處理時Akt和p-Akt的表達(dá)水平已開始降低(F=613.9，P<0.05)，而從15 μmol/L開始，CDK2表達(dá)的降低有統(tǒng)計學(xué)意義(F=208.9，208.3，P<0.05)。CDK1、CDK6、細(xì)胞周期蛋白D以及細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)在各處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論七葉皂苷鈉可抑制人甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞的增殖，可能是通過調(diào)節(jié)Akt、p-Akt以及CDK2等蛋白的表達(dá)實現(xiàn)的。

甲狀腺未分化癌；HTh74；七葉皂苷鈉；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

甲狀腺癌在病理學(xué)上共分為4種，分別是甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌，其中甲狀腺未分化癌的惡性程度最高、預(yù)后最差[1]。目前，臨床上針對分化型甲狀腺癌治療的手段主要為手術(shù)聯(lián)合放射性碘清掃；而對未分化癌的治療一直沒有非常有效的手段，未分化癌對放射性碘的治療不敏感，手術(shù)、化學(xué)治療效果也不盡如人意。因此，從中草藥中尋找甲狀腺未分化癌敏感的新化合物成為該領(lǐng)域的重要研究方向。

臨床上廣泛應(yīng)用的藥物七葉皂苷鈉，為七葉皂苷的鈉鹽化合物。七葉皂苷是從七葉樹的果實和干燥成熟種子(總稱婆羅子)中提取得到的總皂苷，屬于五環(huán)三菇皂苷，具有抗?jié)B出、增加靜脈張力、消腫、抗炎和改善血液循環(huán)的作用[2-4]。臨床上常用其鈉鹽作為抗炎和抗水腫藥物。與其他五環(huán)三菇皂苷類化合物相比，國內(nèi)、外對七葉皂苷的研究還處于初步階段，特別是有關(guān)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究比較匱乏[5]。因此，本研究采用人甲狀腺未分化癌HTh74作為研究對象，探討七葉皂苷鈉抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為中藥治療甲狀腺未分化癌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞株由德國Charite醫(yī)學(xué)院Derwahl教授贈送。

1.1.2 藥物 七葉皂苷鈉購于南京艾斯替么中藥研究所，室溫干燥保存。七葉皂苷鈉用DMEM溶解配制成20 mmol/L的貯存液，-20℃冰箱保存。

1.1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購于美國Invitrogen公司。噻唑藍(lán)為美國Sigma公司產(chǎn)品。蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)1、CDK2、CDK6、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D和cyclinE的一抗為美國Bioworld公司產(chǎn)品，GAPDH一抗購于南京康成生物公司。羊抗鼠-HRP標(biāo)記二抗、羊抗兔-HRP標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)條件 人甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞株在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的F-12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 不同濃度的七葉皂苷鈉(0，20，40，60，80 μmol/L)處理處于對數(shù)生長期的HTh74細(xì)胞，于48 h后觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，倒置顯微鏡拍攝(200×)。

1.2.3 細(xì)胞增殖分析 噻唑藍(lán)比色法分析七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞增殖的抑制作用。取對數(shù)生長期的HTh74細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個/孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔。去血清饑餓過夜后，分別加入含不同濃度七葉皂苷鈉(0，20，40，60，80 μmol/L)的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5 mg/ml的噻唑藍(lán)10 μl，37℃溫育4 h。吸除上清液，每孔加入100 μl二甲基亞砜，室溫震蕩溶解結(jié)晶10 min，于570 nm(吸收波長)和630 nm(參比波長)測吸光光度值。計算細(xì)胞增殖率及半數(shù)抑制率(IC50)。細(xì)胞增殖率=實驗組(A570nm-A630nm)/對照組(A570nm-A630nm)×100%。

1.2.4 Western印跡分析 對數(shù)生長期的HTh74細(xì)胞去血清饑餓12 h后，用不同濃度的七葉皂苷鈉(0，5，10，15，20，25 μmol/L)處理48 h，冰上裂解細(xì)胞提取總蛋白，Nanodrop 1000檢測蛋白濃度，用濃度為10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，上樣量為30 μg，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h后，ECL顯影曝光。Quantity one軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，比較經(jīng)不同濃度七葉皂苷鈉處理后，Akt、p-Akt，cyclinD、cyclinE以及CDK1、CDK2和CDK6表達(dá)水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞形態(tài)的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察到七葉皂苷鈉處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。20 μmol/L七葉皂苷鈉處理48 h后，細(xì)胞開始發(fā)生皺縮，并且有部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿；隨著七葉皂苷鈉處理濃度的增加，細(xì)胞的皺縮程度越來越嚴(yán)重，脫離培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)也逐漸增加，80 μmol/L時細(xì)胞已皺縮至圓形，幾乎無貼壁(圖1)。

2.2 七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞增殖的作用 噻唑藍(lán)比色法分析顯示，七葉皂苷鈉呈濃度、時間依賴性抑制HTh74細(xì)胞的增殖(圖2)。80 μmol/L七葉皂苷鈉作用24 h，對細(xì)胞的生長抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=111.4，P<0.01)，而40 μmol/L作用48 h及72 h時， 細(xì)胞生長均受到抑制(F=543.6，722.1，P均<0.01)，并且48 h、72 h的IC50分別為69.4 μmol/L和 32.5 μmol/L。

圖1 七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞形態(tài)的影響(萊卡倒置顯微鏡，200×)

注：與對照組相比，aP<0.01圖2 七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞Akt、p-Akt及cyclin表達(dá)的影響 七葉皂苷鈉處理HTh74細(xì)胞48 h后，Akt、p-Akt以及CDK2的表達(dá)水平均明顯降低，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，低濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)七葉皂苷鈉處理時Akt和p-Akt的表達(dá)水平已開始降低(P均<0.05)，而從15 μmol/L開始，CDK2表達(dá)的降低有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；而CDK1、CDK6、cyclinD和cyclinE的表達(dá)在各處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

3 討論

七葉皂苷是從婆羅子中提取得到的總皂苷。國內(nèi)、外對七葉皂苷的研究比較廣泛，但有關(guān)其抗腫瘤活性的報道較少。1986年Konoshima和Lee[6]首次報道七葉樹果實中的皂苷可抑制鼻咽癌KB細(xì)胞的增殖，半數(shù)有效量(ED50)為3.6 g/ml。近5年的研究表明，七葉皂苷鈉在體外對人鼻咽癌KB細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、小鼠白血病P388細(xì)胞及3種人結(jié)腸癌HeT-8、HT-29、HeT-116細(xì)胞均有生長抑制作用[7-13]。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)其能夠抑制小鼠宮頸癌U14、肝癌H22、肉瘤S180和白血病P388細(xì)胞生長[7-10]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉可降低大鼠變性隱窩病灶(一種結(jié)直腸癌癌前病變)的產(chǎn)生、雞胚絨毛尿囊膜血管的生成及內(nèi)皮細(xì)胞ECV340的增殖和遷移能力[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉對人甲狀腺未分化癌細(xì)胞HTh74的增殖具有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高，抑制作用逐漸增強，此外，這種抑制作用還呈現(xiàn)明顯的時間依賴性，48 h的IC50為69.4 μmol/L，72 h的IC50為32.5 μmol/L。

通過Western印跡檢測七葉皂苷鈉處理48 h后HTh74細(xì)胞中Akt、p-Akt以及多種cycline、CDK的表達(dá)水平，僅觀察到Akt、p-Akt和CDK2的降低，而其他CDK如CDK1和CDK6以及cyclin D和cyclin E的表達(dá)水平則沒有明顯變化。這些結(jié)果提示七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過抑制Akt表達(dá)和活性以及下調(diào)CDK2的表達(dá)來實現(xiàn)的。

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；Akt：蛋白激酶B；CDK：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶；Cyclin：細(xì)胞周期蛋白圖3 不同濃度七葉皂苷鈉處理HTh74細(xì)胞48 h后，Akt、p-Akt、CDK2、CDK1、CDK6、cyclin D以及cyclin E蛋白水平的變化

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為磷脂酰肌醇3激酶下游信號通路的分子，參與細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期等的調(diào)控[14]。磷脂酰肌醇3激酶/Akt信號通路的活化可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制多種原因?qū)е碌募?xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展以及參與血管形成等[15]。本研究中，七葉皂苷鈉作用于HTh74細(xì)胞后，Akt及p-Akt的表達(dá)水平均顯著降低，提示七葉皂苷鈉對HTh74細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過降低Akt的表達(dá)及抑制Akt的活化而實現(xiàn)的。

CDK也是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其催化活性通過正調(diào)節(jié)因子cyclin和負(fù)調(diào)節(jié)因子CDK抑制因子CDI的相互作用而進(jìn)行調(diào)節(jié)。Cyclin與CDK的絲氨酸/蘇氨酸特異的催化位點相互作用，不僅可以控制激酶的活性，還可以決定底物的特異性。早在20世紀(jì)80年代，CDK/cyclin復(fù)合物就被證實參與細(xì)胞周期調(diào)控。目前CDK家族至少有20余個成員被鑒定出來，每一種都有一個保守的催化核心區(qū)、一個cyclin結(jié)合區(qū)以及一個有活性的T環(huán)基序。與CDK家族不同，cyclin家族成員雖多，但分類標(biāo)準(zhǔn)非常單一，僅根據(jù)介導(dǎo)與CDK結(jié)合的周期蛋白框的不同而分類，包括cyclinA，B，C，D，E，F(xiàn)等，其周期蛋白框外的序列差異直接導(dǎo)致cyclin的調(diào)節(jié)差異及功能多樣性[16]。其中cyclinE與CDK2結(jié)合形成cyclin E-CDK2復(fù)合物，后者為細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物，其通過促進(jìn)Rb的磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)程的順利進(jìn)行[17]。本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠抑制甲狀腺未分化癌HTh74細(xì)胞中CDK2的表達(dá)，表明至少在HTh74細(xì)胞株中，七葉皂苷鈉有可能是通過降低CDK2的表達(dá)水平而將細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖的。

目前，關(guān)于七葉皂苷鈉與甲狀腺癌的研究尚屬空白領(lǐng)域，本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉能夠抑制甲狀腺未分化癌細(xì)胞HTh74的增殖，并且這種抑制作用可能是通過降低Akt、p-Akt以及CDK2的表達(dá)水平進(jìn)而影響其下游通路來實現(xiàn)的。這些結(jié)果為將七葉皂苷鈉作為治療甲狀腺未分化癌的潛在藥物提供了理論支持，但在臨床應(yīng)用之前還需要開展更多、更深入的研究。

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InhibitoryeffectsofsodiumaescinateoncellproliferationinhumananaplasticthyroidcarcinomacellHTh74

LiXingjia,ZhengQuanxi,ChenGuofang,MaoXiaodong，LiuChao.

JiangsuProvinceHospitalonIntegrationofChineseandWesternMedicineAffiliatedtoNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,JiangsuProvincialAcademyofChineseMedicine，KeyLaboratoryofTCMSyndrome&TreatmentofYingbingofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China

Correspondingauthor:LiuChao,Email:liuchao@nfmcn.com

ObjectiveTo investigate the potent inhibitory effects of sodium aescinate on human anaplastic thyroid cancer cell line HTh74 and its molecular mechanism.MethodsDifferent concentrations of sodium aescinate(0, 20, 40, 60, 80 μmol/L) were used to treat HTh74 cells for 48 h, and the morphological changes of cells were observed. After treated with different concentrations of sodium aescinate(0, 20, 40, 60, 80 μmol/L), 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)assay was used to detect the inhibitory effects of sodium aescinate on proliferation of HTh74 cells and cell proliferation rate, 50% inhibitory concentration(IC50)were calculated. After treated with different concentrations of sodium aescinate(0, 5, 10, 15, 20, 25 μmol/L), Western blotting was performed to detect the expression of protein kinase B(Akt), phosphorylated Akt (p-Akt) and cell cycle-related proteins.ResultsAfter treated with sodium aescinate, cells shrinked significantly in a dose dependent manner. MTT assay showed that sodium aescinate had obvious inhibitory effect on HTh74 cell growth in a time and dose dependent manner, when treated with 80 μmol/L sodium aescinate for 24 h, the inhibitory effects on the cell growth had statistical significance (F=111.4，P<0.01), while treated with 40 μmol/L for 48 h and 72 h, the cell growth was inhibited (F=543.6，722.1，allP<0.01), and the IC50was 69.4 μmol/L at 48 h and 32.5 μmol/L at 72 h. The expression of Akt, p-Akt and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) significantly decreased in a dose dependent manner after treated with sodium aescinate for 48 h. Compared with untreated cells, expression of Akt and p-Akt began to decrease when treated with low concentration (5 μmol/L and 10 μmol/L) of sodium aescinate (F=613.9，P<0.05),while expression of CDK2 decreased when treated with 15 μmol/L sodium aescinate (F=208.9, 208.3, allP<0.05). But the expression of CDK1,CDK6,cyclin D and cyclin E were not different among the groups (allP>0.05).ConclusionSodium aescinate can inhibit the proliferation of HTh74 cells, and the molecular mechanisms may be mediated by regulation of Akt, p-Akt and CDK2.

Anaplastic thyroid cancer; HTh74; Sodiun aescinate; Cell cycle; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.010

210028 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局癭病證治重點研究室

劉超，Email：liuchao@nfmcn.com

2015-07-09)