湯瑋娜 任壽安

·論著·

間歇低氧對(duì)大鼠胰島素抵抗及骨骼肌細(xì)胞GLUT4、Akt2的影響

湯瑋娜 任壽安

目的檢測(cè)不同間歇低氧暴露時(shí)間對(duì)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4與蛋白激酶B(PKB/Akt)2表達(dá)的影響，探討二者在間歇低氧導(dǎo)致胰島素抵抗中的作用。方法選取健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：常氧對(duì)照組(NC組)，間歇低氧2周組(IH2組)，間歇低氧4周組(IH4組)，間歇低氧6周組(IH6組)，間歇低氧8周組(IH8組)，每組8只。IH2組、IH4組、IH6組、IH8組每天給予8 h間歇低氧暴露(9:00～17:00),NC組室內(nèi)環(huán)境正常飼養(yǎng)。檢測(cè)各組空腹血糖和空腹胰島素水平，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠骨骼肌GLUT4及Akt2蛋白的表達(dá)，蛋白表達(dá)量用平均灰度值表示，并分析GLUT4與Akt2的相關(guān)性。結(jié)果與NC組相比，IH2組、IH4組、IH6組、IH8組空腹血糖、HOMA-IR升高，骨骼肌GLUT4與Akt2灰度值升高，并且隨間歇低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高明顯(F=87.67～288.63，P均<0.05)；與NC組相比，IH2組、IH4組、IH6組、IH8組空腹胰島素升高，其中IH2組、IH4組、IH6組，隨間歇低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高明顯，IH8組較IH6組下降(F=86.04，P<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示GLUT4與Akt2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.895，P<0.05)。結(jié)論隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)胰島素抵抗程度增加，GLUT4與Akt2蛋白表達(dá)水平下降，二者在間歇低氧導(dǎo)致胰島素抵抗的過程中起協(xié)同作用。

間歇低氧；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；蛋白激酶B2；胰島素抵抗

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是一種常見疾病，在中年男性人群中發(fā)病率為4%，女性為2%，且有逐漸升高的趨勢(shì)[1]。OSAHS是2型糖尿病(T2DM)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，中重度OSAHS患者具有更高的T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。間歇低氧是OSAHS重要的病理生理基礎(chǔ)，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗，從而發(fā)展為T2DM[3-4]。胰島素抵抗的特點(diǎn)之一是胰島素敏感組織對(duì)葡萄糖攝取、利用障礙，其中骨骼肌是胰島素作用的主要靶器官之一，對(duì)于維持血糖平衡起重要作用。而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)介導(dǎo)的葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)又是葡萄糖利用和存儲(chǔ)的主要限速步驟，蛋白激酶B(Akt)2是促進(jìn)GLUT4囊泡易位到胞膜的重要信號(hào)分子[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建不同暴露時(shí)間的間歇低氧大鼠模型，評(píng)估各實(shí)驗(yàn)組的胰島素抵抗水平，并檢測(cè)骨骼肌胰島素信號(hào)通路蛋白GLUT4與Akt2的變化，探討間歇低氧導(dǎo)致胰島素抵抗的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠40只[許可證號(hào)：SCXK(晉)2009-0001]，體重180～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)呼吸實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲食，室溫25℃。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組8只：常氧對(duì)照組(NC組)，間歇低氧2周組(IH2組)，間歇低氧4周組(IH4組)，間歇低氧6周組(IH6組)，間歇低氧8周組(IH8組)。

1.2 方法

1.2.1 間歇低氧模型建立 將間歇低氧組大鼠置于有機(jī)玻璃艙(65×50×45 cm3)內(nèi)，由單片機(jī)控制系統(tǒng)(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院與太原理工大學(xué)聯(lián)合研制)控制氣體輸入時(shí)間，先輸入氮?dú)?0 s，使低氧艙內(nèi)氧濃度由21%逐漸降至最低氧濃度8%，持續(xù)10 s后再通入氧氣40 s，使低氧艙內(nèi)濃度逐漸恢復(fù)至21%，整個(gè)循環(huán)共持續(xù)110 s，每天在間歇低氧艙內(nèi)飼養(yǎng)8 h(9:00～17:00)，分別于第2，4，6，8周后結(jié)束間歇低氧暴露。艙內(nèi)氧濃度由便攜式測(cè)氧儀(建德市新安江分析儀器二廠)實(shí)時(shí)監(jiān)控，艙內(nèi)CO2及水分由生石灰吸收。常氧對(duì)照組大鼠在室內(nèi)空氣環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 標(biāo)本采集 間歇低氧組大鼠分別于暴露第2，4，6，8周后禁飲食8 h，腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，將其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上仰臥位固定，鼠尾常規(guī)消毒，手術(shù)剪剪去 0.5 cm尾尖，醫(yī)用血糖試紙收集尾靜脈血用于檢測(cè)血糖值。然后沿腹中線剪開腹壁，暴露腹主動(dòng)脈，收集血液，離心機(jī)離心 5 min(3 000 r/min，r=190 mm)，取上清液-80℃保存，用于檢測(cè)胰島素含量。剝離大鼠腓腸肌浸于中性甲醛固定48 h后常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2.3 空腹血糖、空腹胰島素(FINS)測(cè)定及胰島素抵抗評(píng)估 空腹血糖由便攜式血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生醫(yī)療器械公司)直接測(cè)量；FINS用大鼠胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德試劑公司)采用雙抗酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×FINS/22，空腹血糖單位為mmol/L，F(xiàn)INS單位為μIU/L。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)GLUT4與Akt2 骨骼肌組織切片常規(guī)脫蠟至水化，枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)2 min，在3%過氧化氫甲醇液作用5 min，以清除內(nèi)源性過氧化酶；牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉15 min，滴加兔抗大鼠GLUT4、Akt2一抗(抗體濃度均為1∶100)，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，4℃冰箱過夜，PBS漂洗，按SABC試劑盒說明操作。DAB室溫顯色，PBS洗劑，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片。切片在顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus圖像軟件進(jìn)行灰度定量分析。

2 結(jié)果

2.1 間歇低氧對(duì)血清胰島素、血糖及胰島素抵抗的影響 與NC組相比，IH2組、IH4組、IH6組、IH8組在相應(yīng)的間歇低氧暴露終點(diǎn)時(shí)空腹血糖水平、HOMA-IR均升高，并且均隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(P均<0.05)；同時(shí)，F(xiàn)INS水平亦升高，其中在IH2組、IH4組、IH6組隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高明顯(P<0.05)，但I(xiàn)H8組較IH6組有所下降(P<0.05),見表1。

2.2 GLUT4與Akt2免疫組化結(jié)果 兩種蛋白均在骨骼肌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，顯微鏡下觀察為棕黃色顆粒，各組切片顯色見圖1(封3)。經(jīng)圖像掃描分析以灰度值代表蛋白表達(dá)含量，灰度值越大蛋白表達(dá)越少，反之亦然。結(jié)果顯示，與NC組相比各間歇低氧組GLUT4與Akt2平均灰度值升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著間歇低氧暴露時(shí)間的增加GLUT4與Akt2平均灰度值升高更顯著(P<0.05)，見表2。Pearson相關(guān)分析顯示GLUT4與Akt2平均灰度值呈正相關(guān)(r=0.895，P<0.05)。

注：NC：常氧對(duì)照組；IH2：間歇低氧2周組；IH4：間歇低氧4周組；IH6：間歇低氧6周組；IH8：間歇低氧8周組；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；Akt2：蛋白激酶B2圖1 大鼠骨骼肌細(xì)胞GLUT4、Akt2的表達(dá)(免疫組化染色，400×)

表1 各組血糖、胰島素及HOMA-IR的比較

注：NC組：常氧對(duì)照組；IH2組：間歇低氧2周組；IH4組：間歇低氧4周組；IH6組：間歇低氧6周組；IH8組：間歇低氧8周組；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素抵抗指數(shù)；與NC組相比，aP<0.01；與IH2組相比，bP<0.01；與IH4組相比，cP<0.01；與IH6組相比，dP<0.01；與IH4組相比，mP<0.05；與IH6組相比，nP<0.05

表2 各組大鼠骨骼肌GLUT4、Akt2

注：NC組：常氧對(duì)照組；IH2組：間歇低氧2周組；IH4組：間歇低氧4周組；IH6組：間歇低氧6周組；IH8組：間歇低氧8周組；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；Akt2：蛋白激酶B2；與NC組相比，aP<0.01；與IH2組相比，bP<0.01；與IH4組相比，cP<0.01；與IH6組相比，dP<0.01；與IH4組相比，mP<0.05；與IH6組相比，nP<0.05

3 討論

近年來(lái)OSAHS對(duì)T2DM的影響越來(lái)越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)T2DM發(fā)病率隨著OSAHS的嚴(yán)重程度升高而升高，呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)>30次/h組與AHI<5次/h組相比，發(fā)生T2DM的OR值可達(dá) 3.48，而AHI>15次/h組與AHI<5次/h組相比，OR值僅為2.30[7]。目前建立間歇低氧動(dòng)物模型是研究OSAHS與T2DM的主要研究模式，模型中間歇低氧循環(huán)周期多低于120 s/次以模擬重度OSAHS(AHI>30次/h)，大量研究證實(shí)在此重度間歇低氧動(dòng)物模型中可存在胰島素抵抗、糖代謝紊亂[8]。但鮮有文獻(xiàn)探討間歇低氧暴露時(shí)間對(duì)胰島素抵抗的累積作用。

在本研究中以兩周間歇低氧暴露為一個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間歇低氧能夠引起空腹血糖升高及胰島素抵抗增強(qiáng)，并且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)血糖升高明顯，胰島素抵抗增強(qiáng)明顯，可以推測(cè)間歇低氧的暴露時(shí)間是胰島素抵抗的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。亦有文獻(xiàn)報(bào)道2周的間歇低氧就足以引起產(chǎn)生胰島素抵抗[9]。提示臨床工作中應(yīng)對(duì)OSAHS患者進(jìn)行早期干預(yù)，及早阻斷間歇低氧的時(shí)間累積效應(yīng)。但是IH8組與IH6組相比，F(xiàn)INS水平并沒有相應(yīng)升高。這可能由于長(zhǎng)期的間歇低氧對(duì)胰島β細(xì)胞已產(chǎn)生了功能性甚至器質(zhì)性損害。根據(jù)血糖水平反饋的胰島素的分泌依賴于組織正常供氧，持續(xù)的低氧會(huì)引起胰島素分泌水平嚴(yán)重下降，在慢性間歇低氧小鼠中可以看到胰島β細(xì)胞的死亡及胰島素分泌水平的下降[10-11]。間歇低氧過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧簇也參與了胰腺的損傷[12]。由此推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間的間歇低氧暴露可能造成不可逆的胰島素分泌紊亂，這也提示在臨床工作中應(yīng)重視OSAHS合并糖尿病患者的間歇低氧的糾正，否則后期可能會(huì)加大血糖控制的難度。

那么間歇低氧是如何導(dǎo)致胰島素抵抗的呢？作為主要的胰島素敏感器官之一，骨骼肌負(fù)責(zé)80%～90%胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，破壞小鼠的GLUT4基因可導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗和糖耐量減低[13]。Carreras等[14]發(fā)現(xiàn)間歇低氧可以影響GLUT4由胞質(zhì)到胞膜的易位過程，使胞膜GLUT4含量下降，從而影響骨骼肌攝取葡萄糖，導(dǎo)致胰島素抵抗。另外有研究發(fā)現(xiàn)慢性間歇低氧暴露(10%～21%，8 h/d，4周)嚴(yán)重阻礙了Akt的磷酸化[15]。Akt包括3種亞型，其中Akt2在胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取過程中起作用。胰島素與細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合促使Akt2磷酸化，然后經(jīng)磷脂酰肌醇3激酶途徑激活GLUT4進(jìn)行葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此猜測(cè)GLUT4與Akt2在間歇低氧導(dǎo)致胰島素抵抗的過程中可能具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，GLUT4與Akt2蛋白表達(dá)水平在間歇低氧組均明顯下降(P<0.05)，并且隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)GLUT4、Akt2蛋白表達(dá)水平下降更為明顯，相關(guān)性分析顯示GLUT4的表達(dá)水平與Akt2的水平呈正相關(guān)(r=0.895，P<0.05)，提示間歇低氧可能通過下調(diào)GLUT4、Akt2的表達(dá)水平導(dǎo)致胰島素抵抗。但間歇低氧是分別直接作用于兩個(gè)受體，還是通過減少Akt2繼而引起GLUT4表達(dá)下調(diào)，或是通過降低GLUT4的表達(dá)進(jìn)一步引起Akt2的表達(dá)減少，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，間歇低氧可以導(dǎo)致胰島素抵抗，并且間歇暴露時(shí)間越長(zhǎng)胰島素抵抗越嚴(yán)重，這可能與間歇低氧降低了骨骼肌細(xì)胞GLUT4與Akt2的表達(dá)水平有關(guān)，二者在間歇低氧導(dǎo)致胰島素抵抗過程中具有相關(guān)性。通過干預(yù)GLUT4與Akt2的表達(dá)可能為OSAHS合并糖尿患者的治療的一個(gè)新思路。本研究以間歇低氧暴露時(shí)間為切點(diǎn)，研究間歇低氧對(duì)胰島素抵抗的影響，但是間歇低氧的其他特征如低氧嚴(yán)重程度(最低氧飽和度)、每個(gè)間歇低氧循環(huán)的時(shí)間、每天的間歇低氧循環(huán)次數(shù)及相關(guān)的二氧化碳水平等與胰島素抵抗的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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EffectsofintermittenthypoxiaoninsulinresistanceandexpressionofGLUT4andAkt2inskeletalmusclecellsofrats

TangWeina*,RenShou′an.

*ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

Correspondingauthor：RenShou′an，Email:renshouan@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of different time of exposure to intermittent hypoxia on the expression of glucose transporter (GLUT) 4 and protein kinase B(PKB/Akt)2, and their roles in insulin resistance induced by intermittent hypoxia．MethodsForty male Sprauge-Dawley rats were divided into 5 groups by random number table method:normal control group(NC group),group of intermittent hypoxia for 2 weeks (IH2 group),group of intermittent hypoxia for 4 weeks (IH4 group),group of intermittent hypoxia for 6 weeks (IH6 group) and group of intermittent hypoxia for 8 weeks(IH8 group), with 8 rats in each group. Rats in IH2 group, IH4 group, IH6 group and IH8 group were exposed to intermittent hypoxia each day, from 9 a.m. to 5 p.m.,while rats in NC group were exposed to room air. Fasting blood glucose and fasting blood insulin were measured，and homeostatic model assessment of insulin resistance index(HOMA-IR)was calculated. The expression of GLUT4 and Akt2 protein in muscles of rat were analyzed by immunohistochemistry and quantified by the average gray value. The correlation between GLUT4 and Akt2 was analyzed.ResultsCompared with NC group, fasting blood glucose，HOMA-IR, GLUT4 and Akt2 in IH2, IH4, IH6, IH8 group were higher, and were increased with the exposure time of intermittent hypoxia (F=87.67-288.63, allP<0.05). Compared with NC group, fasting insulin was elevated in IH2, IH4, IH6 and IH8 group, and was increased along with the duration of intermittent hypoxia and then decreased in IH8 group(F=86.04,P<0.01).Pearsoncorrelation analysis showed that the expression of GLUT4 was positively correlated with Akt2(r=0.895，P<0.05) .ConclusionThe degree of insulin resistance increases and the expression of GLUT4 and Akt2 decrease with duration of intermittent hypoxia.GLUT4 and Akt2 play synergistic effects in insulin resistance induced by intermittent hypoxia.

Intermittent hypoxia; Glucose transporter 4; Protein kinase B2; Insulin resistance

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013011048-4)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.009

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)(湯瑋娜)；030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科(任壽安)

任壽安，Email：renshouan@163.com

FundprogramNatural Science Foundation of Shanxi Province of China (2013011048-4)

2016-07-31)