王 丹，曹思碩，康 樺，杜 軍，匡 榮*，李敏杰*

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004；2.安利(中國)研發(fā)中心有限公司，上海 201203)

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銀杏蓯蓉配方急性毒性和亞慢性毒性實驗研究

王 丹1，曹思碩2，康 樺1，杜 軍2，匡 榮1*，李敏杰2*

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004；2.安利(中國)研發(fā)中心有限公司，上海 201203)

目的 觀察銀杏蓯蓉配方的毒性。方法 按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》2003年版中的相關規(guī)定，進行銀杏蓯蓉片的急性毒性實驗和90d喂養(yǎng)實驗。結果 銀杏蓯蓉配方的大鼠最大耐受劑量(MTD)大于15g·kg-1·bw-1，屬無毒級；將受試物摻入飼料中，自由攝取連續(xù)90d，大鼠體質量和食物利用率均無異常改變，各項血常規(guī)和生化指標均在本實驗室正常指標值范圍內，高劑量組和對照組動物各臟器的病理組織檢查亦未見明顯病變，未觀察到有害作用(NOAEL)，劑量為0.7g·kg-1·bw-1。結論 可以判斷銀杏蓯蓉配方為無毒物，未見急性毒性和亞慢性毒性。

銀杏蓯蓉配方；急性毒性實驗；喂養(yǎng)實驗

銀杏葉有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘和化濁降脂的功效，常用于淤血阻絡、胸痹心痛、中風偏癱、肺虛咳喘及高脂血癥的治療[1-2]。肉蓯蓉具有補腎陽、益精血和潤腸通便的功效，常用于治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力及腸燥便秘等癥[1，3]。由上述兩味中藥提取物制成的銀杏蓯蓉配方是輔助改善記憶的功能性保健食品。通過前一階段的實驗對管花肉蓯蓉提取物急性毒性、遺傳毒性和亞慢性毒性進行了研究，為其開發(fā)成為新資源食品和功能性食品所需的安全性評價提供了依據[4]。本研究旨在評價銀杏蓯蓉配方產品的綜合安全性，為該品種的上市銷售提供安全性保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器TD12001A型電子天平(上海華耀電子衡器有限公司)；ADVIA120血液分析儀(德國拜爾公司)；7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 樣品 銀杏蓯蓉配方供試樣品為棕色粉末，主要成分為肉蓯蓉提取物和銀杏葉提取物。標志性成分含量：每100g樣品含松果菊苷 7.55g和總黃酮醇苷 2.85g。

1.3 動物SD大鼠及飼料均由浙江省實驗動物中心提供，等級為清潔級。實驗動物生產許可證號為SCXK(浙)2008-0033；使用許可證號為SYXK(浙)2008-0117。動物體質量依照各項實驗要求而定。動物飼養(yǎng)溫度為21～25 ℃，相對濕度為50%～70%。

2 方法

2.1 大鼠最大耐受量實驗結果 選用SD大鼠20只，雌雄各10只，雌性體質量為182.7～200.2g，雄性體質量為189.4～220.0g，灌胃前16h禁食不禁水。配制好的最大受試物質量濃度為750mg·mL-1，實驗第1天以10mL·kg-1給大鼠灌胃2次，2次總劑量為15g·kg-1·bw-1。在首次給予受試物前、給予受試物后7和14d測定體質量，灌胃當天進行觀察并連續(xù)觀察14d，每天記錄動物的一般癥狀、中毒癥狀及死亡數，并于實驗結束時進行病理學檢查。

2.2 大鼠90d喂養(yǎng)實驗 選SD大鼠80只，雌雄各40只，體質量70～90g，隨機分為4組，即對照組以及低、中、高3個劑量組，每組雌雄各10只。按照人體日推薦劑量(420mg·d-1)分別擴大25，50和100倍設置0.175，0.35和0.70g·kg-1·bw-13個劑量組和1個陰性對照組。各組大鼠連續(xù)灌胃90d，實驗期間所有動物單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。大鼠連續(xù)觀察90d，每天觀察記錄動物的活動和生長情況等，每周記錄體質量和進食質量并計算食物利用率，在實驗中期(45d)和結束(90d)時對雌雄大鼠分別禁食，腹主動脈取血進行血液生化檢查，對每只大鼠進行臟器大體觀察，同時取肝、腎、脾、睪丸/卵巢稱定質量并計算臟器體質量比，并取肝、腎、脾、胃、腸、睪丸/卵巢進行病理組織學檢查，如石蠟切片，H-E染色和光鏡檢查。

2.3 統(tǒng)計處理方法 大鼠的急性毒性實驗不進行統(tǒng)計學計算處理，只列出方案中觀察項目的觀察數據和測定數據的平均值及標準差。大鼠90d喂養(yǎng)實驗中，對于體質量、攝食量、血液學檢查指標、血清生化檢查指標、臟器質量和臟器系數的統(tǒng)計，用DASver1.0軟件進行統(tǒng)計分析。分析時，先對數據進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進行總體比較，發(fā)現差異再用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數間的兩兩比較；若方差不齊，則對原始數據進行適當的變量轉換，滿足方差齊性檢驗后，用轉換后的數據進行統(tǒng)計；若變量轉換后仍未達到方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計，發(fā)現總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane′sT2 檢驗進行兩兩比較。

3 結果

3.1 大鼠最大耐受量實驗結果 在14d觀察期內，大鼠全部存活，無異常反應，活動、飲食、糞便均正常，體質量均增加，肉眼未見毒性反應，也無動物死亡。處死動物后進行解剖，尸檢肉眼觀察組織器官均未發(fā)現異常。MTD值大于15g·kg-1·bw-1，按照急性毒性分級標準評價，銀杏蓯蓉配方屬無毒級。

3.2 大鼠90d喂養(yǎng)實驗結果

3.2.1 動物一般情況 實驗期間，各組大鼠均未見異常癥狀和體征，也無死亡。

3.2.2 銀杏蓯蓉配方對大鼠體質量總增質量、總攝食量和總食物利用率的影響 實驗結束后，3個劑量組大鼠體質量總增質量、總攝食量和總食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 銀杏蓯蓉配方對總食物利用率的影響

Tab.1 Total food utilization influenced by Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=10)

3.2.3 銀杏蓯蓉配方對大鼠血液學指標的影響 實驗中期雌性大鼠中劑量組白細胞計數(WBC)、低劑量組血紅蛋白(Hgb)與陰性對照組比較有所增加(P<0.05)。其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表2。雄性大鼠高劑量組及低劑量組嗜中性細胞比率(%)與陰性對照組比較有所增加(P<0.05)；3個劑量組淋巴細胞比率(%)與陰性對照組比較均有所降低(P<0.05)；中劑量組與低劑量組單核細胞比率(%)與陰性對照組比較均有所增加(P<0.05)；中劑量組嗜酸性細胞比率(%)與陰性對照組比較均有所降低(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表3。

表2 銀杏蓯蓉配方對雌性大鼠血常規(guī)的影響

Tab.2 Hematological data in female rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

實驗結束,雌性大鼠各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表2。實驗結束，雄性大鼠低劑量組白細胞計數(WBC)與陰性對照組比較有所增加(P<0.01)。其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表3。

表3 銀杏蓯蓉配方對雄性大鼠血常規(guī)的影響

Tab.3 Hematological data in male rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2.4 對大鼠血液生化指標的影響 實驗中期，雌性大鼠高劑量組與中劑量組的總蛋白高于對照組(P<0.05)；低劑量組總膽固醇低于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表4。雄性大鼠低劑量組的肌酐低于對照組(P<0.05)；3個劑量組的谷草轉氨酶均高于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表5。

實驗結束，雌性大鼠高劑量組與低劑量組的三酰甘油均高于對照組(P<0.05)；高劑量組的肌酐低于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表4。雄性大鼠各劑量組與對照組比較，各指標差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表5。

表4 銀杏蓯蓉配方對雌性大鼠血清生化指標的影響

Tab.4 Serum biochemical data in female rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2.5 銀杏蓯蓉配方對大鼠臟器體質量比的影響 實驗中期，雄性大鼠高劑量組肝臟體質量比大于對照組(P<0.05)；中劑量組睪丸體質量比小于對照組(P<0.05)；其余各組各臟器體質量比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義。實驗結束，雌性大鼠高劑量組與中劑量組肝臟體質量比均明顯大于對照組(P<0.05)；其余各組各臟器體質量比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義，結果見表6。

表5 銀杏蓯蓉配方對雄性大鼠血清生化指標的影響

Tab.5 Serum biochemical data in male rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

表6 銀杏蓯蓉配方對大鼠臟器體質量比的影響

Tab.6 Relative organ weights influenced by Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

3.2.6 病理組織學檢查結果 各組動物的肝、脾、腎、睪丸、卵巢、胃和腸道等臟器，肉眼觀察均未見明顯異常。肝、脾、腎、胃、腸、睪丸和卵巢的病理組織學切片鏡下檢查結果表明，各劑量組與對照組上述臟器均未見明顯病變。

4 討論

由于在預實驗中未觀察到銀杏蓯蓉配方的LD50，所以采用最大給藥劑量實驗來考察動物的急性毒性情況。用15g·kg-1·bw-1的劑量(相當于推薦人日攝入量的2 143倍)灌胃SD大鼠，首次給藥后觀察14d，期間未發(fā)現任何不良反應，實驗結束后尸檢各臟器均未見明顯異常。故銀杏蓯蓉配方大鼠MTD>15g·kg-1·bw-1，按照急性毒性分級標準[5]進行評價，本產品屬無毒級。上述實驗結果與之前管花肉蓯蓉提取物急性毒性研究數據(MTD>15g·kg-1·bw-1)吻合[4]。據文獻報道，肉蓯蓉提取物小鼠灌胃最大耐受劑量為40g·kg-1[6]，而銀杏提取物小鼠灌胃的LD50為7.7g·kg-1·bw-1[7]。綜上所述，無論從文獻數據還是研究結果來看，銀杏蓯蓉配方都不會產生急性毒性。

管花肉蓯蓉提取物對大鼠90d喂養(yǎng)實驗的NOAEL值為4.5g·kg-1·bw-1[4]。銀杏提取物的文獻數據表明，將100～1 600g·kg-1·bw-1銀杏提取物連續(xù)灌胃小鼠或大鼠27周，未發(fā)現任何不良反應[8]。故本研究按照人臨床用量的25，50和100倍喂養(yǎng)大鼠90d，雖然各劑量組均有個別的血常規(guī)和血液生化指標與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，但其值均在本實驗室正常指標值范圍內，不具有生物學意義。發(fā)現有部分給藥劑量組的臟器體質量比與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義，但相關血液學及病理切片觀察均未發(fā)現病理改變，因此不認為該變化與毒性作用相關。病理組織學檢查結果表明，高劑量組與對照組各臟器均未見明顯病變。實驗結果表明，本實驗條件下，3個劑量組各項指標均未見明顯毒性反應，NOAEL值>700g·kg-1·bw-1。另外有多項評價肉蓯蓉毒性的文章也同樣證實了肉蓯蓉的安全性，小鼠30d喂養(yǎng)實驗表明，肉蓯蓉劑量為 0.650，0.975和1.300g·kg-1時，即相當于人體接觸劑量的50，75和100倍時，無毒性反應[6]。文獻報道的慢性毒性實驗也表明肉蓯蓉是安全的[9]。生殖與發(fā)育毒性實驗表明，肉蓯蓉安全(50g·kg-1)，遺傳毒性實驗研究表明20g·kg-1肉蓯蓉無遺傳毒性[10]。臨床試驗結果表明，肉蓯蓉相關制劑安全有效[11-13]。銀杏葉提取物在世界范圍內被廣泛應用及研究。1 225g·kg-1·bw-1銀杏提取物對小鼠無生殖發(fā)育毒性[14]。240mg·d-1銀杏提取物在治療眩暈病人12周的臨床試驗中表現出很好的耐受性[15]。經過以上實驗數據分析及歷史文獻的比對，可證實銀杏蓯蓉配方產品安全可靠。參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版[M] 一部. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:126.

[2] 王飛娟.銀杏葉中黃酮類化合物的研究進展[J].西北藥學雜志， 2010，25(2):155-156.

[3] 羅尚鳳，黃仲達.肉蓯蓉的成分及藥理學研究概況[J].西北藥學雜志，1990，5(1):47.

[4] 李敏杰，田峰，杜軍.管花肉蓯蓉提取物急性毒性、遺傳毒性及亞慢性毒性試驗研究[J].毒理學雜志，2013，27(5):400-403.

[5] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003年版)[S].北京: 國家食品藥品監(jiān)督管理局，2003：22-34.

[6] 何偉，舒小奮，宗桂珍，等.肉蓯蓉炮制前后補腎壯陽作用的研究 [J].中國中藥雜志，1996，21(9):534-537.

[7]ZoёGardner，MichaelMcGuffin.AHPABotanicalSafetyHandbook[EB/OL].SilverSpring，MD：AmericanHerbalProductsAssociation， 2013 [2014-09-19].https://bsh.ahpa.org/ArticleDescription.aspx?article_id=233.

[8]RiderCV，NyskaA，CoraMC.ToxicityandcarcinogenicitystudiesofGinkgo bilobaextractinratandmouse:liver,thyroid,andnosearetargets[J].ToxicolPathol，2014，42(5):830-843.

[9] 趙玉珍，陶上乘.蓯蓉酒一般毒理學研究[J].寧夏醫(yī)學雜志， 1993，15(6): 342-344.

[10]胡余明，胡怡秀，劉秀英，等.蓯蓉總苷急性、亞急性及遺傳毒性實驗研究[J].實用預防醫(yī)學，2006，13(5):1176-1180.

[11]吳松鷹，方素欽，梁暉.蓯蓉總甙膠囊治療髓海不足型血管性癡呆的隨機雙盲對照研究[J].福建中醫(yī)藥，2004，35(4): 3-4.

[12]苑斌，趙衛(wèi)生，陳娟，等.蓯蓉總苷膠囊治療癡呆的神經精神癥狀的隨機對照雙盲臨床試驗[J].中國現代藥物應用，2009，3(18): 30-32.

[13]王晴.肉蓯蓉總苷膠囊治療阿爾茨海默病的臨床研究[J].海峽藥學，2009，21(3): 103-104.

[14]KochE，N?ldnerM，LeuschnerJ.ReproductiveanddevelopmentaltoxicityoftheGinkgo bilobaspecialextractEGb761?inmice[J].Phytomedicine， 2013， 21(1):90-97.

[15]SokolovaL，HoerrR，MishchenkoT.TreatmentofVertigo:Arandomized，double-blindtrialcomparingefficacyandsafetyofGinkgo bilobaextractEGb761andbetahistine[J].IntJOtolaryngol，2014:682439.

Acute and sub-chronic toxicity of Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula on rats

WANGDan1，CAOSishuo2，KANGHua1，DUJun2，KUANGRong1*，LIMinjie2*

(1.ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl，Hangzhou310004，China；2.Amway(China)R&DCenterCompanyLimited，Shanghai201203，China)

ObjectiveTostudythetoxicityofGinkgo bilobaandCistanche tubulosaformula.MethodsTheacutetestand90dfeedingtestwereappliedandanalyzedinratsinaccordancewithProceduresandMethodsforToxicologicalAssessmentofFoodSafety.ResultsItsacutetoxicitytestshowedthatthemaximumtolerateddose(MTD)wasgreaterthan15g·kg-1·bw-1.The90dfeedingtestshowedthatbodyweightandfoodutilizationrateweresimilarineachgroup；theparametersofbloodroutineexaminationandbiochemicalindexwereinnormalrange；theformuladidnotcausesignificantpathologicalchangesintheorgansofhighdosagegroupandcontrolgroup.Thenoobservedadverseeffectlevel(NOAEL)wasestimatedas0.7g·kg-1·bw-1.ConclusionGinkgo bilobaandCistanche tubulosaformulaisanon-toxicproductandhasnosub-chronictoxicityaswell.

Ginkgo bilobaandCistanche tubulosaformula；acutetoxicitytest；feedingtest

王丹，女，副主任藥師

*通信作者：匡榮，男，主任藥師;李敏杰，女，博士

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.015

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A

2016-02-10)