魏 嵐 趙曉彬

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

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胚胎腦組織成體神經(jīng)干細(xì)胞的體外增殖分化及凋亡

魏 嵐 趙曉彬1

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

目的 觀察小鼠胚胎成體神經(jīng)干細(xì)胞(NSCS)體外增殖分化，探討G蛋白偶聯(lián)受體5(GRK5)與NSCS凋亡的關(guān)系。方法 分離孕14～16 d小鼠胚胎腦組織，體外培養(yǎng)NSCS，采用免疫熒光法對(duì)NSCS及其分化的細(xì)胞進(jìn)行Nestin、β-Tublin和GFAP染色鑒定。聯(lián)合RNA干擾沉默GRK5基因，以及PKA激動(dòng)劑forskolin干預(yù)NSCS，采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCS細(xì)胞凋亡比例。結(jié)果 體外分離培養(yǎng)的小鼠胚胎腦組織可形成典型的神經(jīng)球并傳代，細(xì)胞表達(dá)Nestin蛋白后可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。GRK5 siRNA組早期凋亡細(xì)胞比例明顯高于control siRNA對(duì)照組(P<0.01)；盡管GRK5 siRNA+PKA激活組早期凋亡細(xì)胞比例明顯低于GRK5 siRNA組(P<0.05)，但早期凋亡細(xì)胞比例仍明顯高于PKA激活組(P<0.01)。結(jié)論 小鼠胚胎NSCS可在體外適宜條件下大量增殖，具有多向分化潛能；GRK5基因高表達(dá)可有效抑制NSCS早期凋亡。

神經(jīng)肝細(xì)胞；凋亡

成體神經(jīng)干細(xì)胞(NSCS)具有高度的更新、分化能力，NSCS移植為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的途徑。研究顯示，多種凋亡因子的介導(dǎo)可促使NSCS細(xì)胞凋亡，有關(guān)NSCS細(xì)胞凋亡的研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔1〕。PKA作為cAMP水平的感受器，是cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶，對(duì)維持細(xì)胞存活具有重要作用〔2〕。G蛋白偶聯(lián)受體(GRK)5可脫敏抑制M2受體活性〔3〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，M2信號(hào)途徑能夠降低cAMP水平并下調(diào)PKA活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕。目前關(guān)于GRK5抑制NSCS凋亡方面的研究報(bào)道十分少見(jiàn)。本次研究分離并體外培養(yǎng)小鼠胚胎NSCS，觀察GRK5基因沉默與NSCS凋亡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 雌性ICR小鼠，孕14～16 d，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。主要試劑：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(上海達(dá)豪生物科技有限公司)；B27復(fù)合物、BFGF、EGF、胎牛血清(美國(guó)Sigma公司)；多聚賴(lài)氨酸(深圳安泰生物科技有限公司)；鼠抗人巢蛋白單克隆抗體、小鼠單克隆β-Tublin 內(nèi)參抗體、鼠抗人膠原纖維酸性蛋白、GRK5抗體(上海酶聯(lián)生物研究所)；forskolin TM，RNAiMAX(美國(guó)Sigma公司)；雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)。

1.2 NSCS培養(yǎng)及檢測(cè)

1.2.1 取材及分離細(xì)胞 將小鼠斷髓處死后，放入75%乙醇溶液中消毒3 min，開(kāi)腹暴露子宮。無(wú)菌條件下將胎鼠取出，分離腦組織，置于盛有D-Hank液的培養(yǎng)皿中清洗干凈。在顯微鏡下分離腦組織表面的血管和蛛網(wǎng)膜。將腦組織轉(zhuǎn)入盛有DMEM無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液的青霉素小瓶中，剪碎至直徑為1 mm3的正方體小塊，加入胰蛋白酶1 ml，37℃條件下消化10 min，加入含胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。過(guò)200目篩，制備N(xiāo)SCS懸液。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) ①原代細(xì)胞培養(yǎng)：1 000 r/min離心細(xì)胞懸液10 min，棄上清，加入含2% B27復(fù)合物的DMEM無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，其中BFGF、EGF各20 ng/ml，細(xì)胞液密度調(diào)整至5×105個(gè)/ml，置于CO2孵箱中培養(yǎng)1 w。②傳代培養(yǎng)：從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吸出細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml DMEM 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶消化10 min終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含2% B27復(fù)合物的DMEM無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞液密度調(diào)整至5×105個(gè)/ml，置于CO2孵箱中培養(yǎng)1 w。

1.2.3 細(xì)胞誘導(dǎo)分化及檢測(cè) 將傳代培養(yǎng)成的克隆球接種在多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理的24孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h后取部分克隆球表達(dá)的干細(xì)胞行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色；另取部分克隆球加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)，1 w后分別行β-Tublin免疫細(xì)胞化學(xué)染色和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.3 GRK5抗NSCS凋亡研究方法

1.3.1 GRK5 siRNA 將克隆球接種在多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入DMEM 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取5 μl RNAiMAX、20 μmol/L的siRNA分別加入100 μl opti-MEM培養(yǎng)基中靜置10 min，兩者混合后再靜置10 min，加入細(xì)胞中混勻。Western印跡檢測(cè)siRNA干擾率。GRK5 siRNA和control siRNA均由上海博光生物科技有限公司合成。

1.3.2 分組 按照RNA沉默GRK5，以及PKA激動(dòng)劑forskolin干預(yù)，分為4組：control siRNA 處理的對(duì)照組、control siRNA+ forskolin的PKA激活組、GRK5 siRNA組、GRK5 siRNA組+ forskolin的GRK5 siRNA+PKA激活組。

1.3.3 NSCS凋亡檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光，Annexin V陽(yáng)性 /PI陰性為早期凋亡細(xì)胞。使用IPP圖像分析軟件測(cè)定選擇區(qū)域中Annexin V陽(yáng)性 /PI陰性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其占該區(qū)域總細(xì)胞數(shù)的比例。每份標(biāo)本測(cè)定3個(gè)區(qū)域，每組檢測(cè)5個(gè)標(biāo)本。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS15.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 NSCS體外生長(zhǎng)情況 DMEM無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BFGF、EGF和B27復(fù)合物條件下，培養(yǎng)24 h后觀察可見(jiàn)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，聚集成團(tuán)，團(tuán)塊周邊細(xì)胞折光性良好；48 h后發(fā)展為數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成的大小不一的細(xì)胞球，折光性良好，形態(tài)規(guī)則；1 w后細(xì)胞球大小基本一致，折光性明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

圖1 NSCS體外培養(yǎng)24 h(×100)

2.2 NSCS的Nestin、β-Tublin、GFAP表達(dá)情況 免疫熒光染色法檢測(cè)傳代NSCS克隆球表達(dá)的干細(xì)胞均呈Nestin陽(yáng)性，見(jiàn)圖2A。NSCS單細(xì)胞懸液免疫熒光染色檢測(cè)顯示β-Tublin、GFAP均為陽(yáng)性，見(jiàn)圖2B、2C。

A：NSCS克隆球表達(dá)的干細(xì)胞Nestin表達(dá)；B：NSCS單細(xì)胞懸液β-Tublin表達(dá)；C：NSCS單細(xì)胞懸液GFAP表達(dá)圖2 NSCS免疫熒光染色(×400)

2.3 RNA干擾沉默GRK5基因表達(dá) GRK5基因沉默后NSCS中的GRK5蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)NSCS中的GRK5蛋白表達(dá)量

2.4 各組NSCS早期凋亡情況比較 GRK5基因沉默后的GRK5 siRNA組、GRK5 siRNA+PKA激活組表達(dá)早期凋亡細(xì)胞分別為(39.6±2.8)%、(30.1±1.5)%，見(jiàn)圖4C、4D；對(duì)照組、PKA激活組表達(dá)早期凋亡細(xì)胞分別為(3.9±0.5)%、(3.0±0.5)%，見(jiàn)圖4A、4B。GRK5 siRNA組早期凋亡細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；盡管GRK5 siRNA+PKA激活組早期凋亡細(xì)胞比例明顯低于GRK5 siRNA組(P<0.05)，但其早期凋亡細(xì)胞比例仍明顯高于PKA激活組(P<0.01)。

A：對(duì)照組；B：PKA激活組；C：GRK5 siRNA組；D：GRK5 siRNA+PKA激活組圖4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)4組NSCS早期凋亡情況

3 討 論

NSCS具有自我更新能力，能夠分裂成與自身完全相同的子代細(xì)胞，體外環(huán)境下NSCS經(jīng)多次傳代后形成的子代仍與其自身完全相同。NSCS同時(shí)具有多向分化潛能，能夠分化為神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞這三種重要的神經(jīng)細(xì)胞。本次研究選用了胎齡14～16 d的胎鼠為研究材料，從胚胎發(fā)育過(guò)程來(lái)看，發(fā)育早期階段易獲得神經(jīng)干細(xì)胞且其自身特征在體外培養(yǎng)時(shí)可保持較長(zhǎng)時(shí)間，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，胎齡小于11 d的胚胎在具體操作時(shí)分離中樞神經(jīng)系統(tǒng)較為困難，同時(shí)NSCS體外培養(yǎng)所必需的FGF受體表達(dá)峰值在胚胎發(fā)育中期出現(xiàn)，因此選擇胎齡14～16 d的胚胎。本次研究中分離出的小鼠腦組織克隆球表達(dá)的肝細(xì)胞特征性標(biāo)記物Nestin表達(dá)陽(yáng)性，去除生長(zhǎng)因子，加血清培養(yǎng)后克隆球逐漸貼壁分化，培養(yǎng)1 w后免疫熒光染色顯示，神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-Tublin和星狀膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP表達(dá)均為陽(yáng)性，說(shuō)明胎齡14～16 d的胎鼠腦組織分離、培養(yǎng)的細(xì)胞具有NSCS基本屬性。

多種細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，其分子機(jī)制尚未完全明確。研究顯示，PKA可通過(guò)磷酸化bcl-2抗體、激活P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等機(jī)制調(diào)節(jié)bcl-2活性，從而影響caspase-3表達(dá)〔5〕。最新研究顯示，M2信號(hào)途徑能夠降低cAMP水平，下調(diào)PKA活性，加速細(xì)胞凋亡，而GRK5能夠抑制突觸前M2受體活性，因此可推測(cè)GRK5與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔6〕。本次研究顯示，GRK5基因沉默后NSCS凋亡細(xì)胞比例明顯增加，同時(shí)還能夠抑制PKA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的激活作用，減弱其抗凋亡作用。提示PKA激動(dòng)劑forskolin無(wú)法完全糾正GRK5基因沉默引發(fā)的PKA活性抑制，GRK5 siRNA+PKA激活組中仍可觀察到大量的Annexin V陽(yáng)性 /PI陰性細(xì)胞；推測(cè)GRK5存在上調(diào)PKA基因表達(dá)之外的途徑抑制NSCS細(xì)胞凋亡，GRK5抗NSCS凋亡的作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。

1 Lu HX，Yang ZQ，Jiao Q,etal.Low concentration of serum helps to maintain the characteristics of NSCs/NPCs on alkalitreated phbhhx film in vitro〔J〕.Neurol Res，2014；36(3)：207-14.

2 宋 杰.低劑量BDE-209單獨(dú)和與BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的影響〔D〕.廣州：廣州醫(yī)學(xué)院，2012.

3 Liu Q，F(xiàn)an X，Zhu J，etal.Co-culturing improves the OGD-injured neuron repairing and NSCs differentiation via Notch pathway activation〔J〕.Neurosci Lett，2014；559：1-6.

4 Tao J，Chen B，Gao Y，etal.Electroacupuncture enhances hippocampal NSCs proliferation in cerebral ischemia-reperfusion injured rats via activation of notch signaling pathway〔J〕.Int J Neurosci，2014；124(3)：204-12.

5 宋旭東.神經(jīng)干細(xì)胞與替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠生存狀況影響的研究〔D〕.瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院，2014.

6 Jiao Q，Xie WL，Wang YY，etal.Spatial relationship between NSCs/NPCs and microvessels in rat brain along prenatal and postnatal development〔J〕.Int J Dev Neurosci，2013；31(4)：280-5.

〔2016-04-25修回〕

(編輯 郭 菁)

1 河北省人民醫(yī)院眼科

魏 嵐(1976-)，女，碩士，副研究員，副教授，主要從事環(huán)境毒理學(xué)、組織形態(tài)學(xué)研究。

R74

A

1005-9202(2016)19-4717-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.020