許曉義 武蕾蕾 李 麗 張曉莉 關(guān)利新 遲硯軍 宋高臣

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

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半枝蓮多糖對(duì)H22荷瘤小鼠組織蛋白質(zhì)的影響

許曉義 武蕾蕾 李 麗 張曉莉 關(guān)利新 遲硯軍1宋高臣

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 比較半枝蓮多糖(SBPS)對(duì)H22荷瘤小鼠組織蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜的影響。方法 建立H22荷瘤小鼠動(dòng)物模型，分別取H22荷瘤小鼠和SBPS組小鼠瘤組織，利用雙向電泳技術(shù)分離兩組瘤組織的蛋白質(zhì)，獲得圖譜后通過ImageMaster 5.0軟件分析兩組蛋白表達(dá)的差異性。結(jié)果 兩組差異明顯的蛋白點(diǎn)有14個(gè)，其中SBPS組6個(gè)點(diǎn)高表達(dá)，8個(gè)低表達(dá)；14個(gè)點(diǎn)僅在荷瘤組表達(dá)，12個(gè)點(diǎn)在SBPS組特異表達(dá)。結(jié)論 SBPS可以通過調(diào)節(jié)H22肝癌瘤組織中部分蛋白質(zhì)的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的治療作用。

半枝蓮多糖；肝癌

半枝蓮多糖(SBPS)是中藥半枝蓮重要的化學(xué)組分，具有提高免疫力以及一定的抗腫瘤作用，并對(duì)抗腫瘤藥物起到增效減毒作用〔1,2〕。本文擬利用雙向凝膠電泳技術(shù)，探討SBPS治療肝癌在蛋白質(zhì)組水平的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與廇株 昆明種小鼠20只，18～22 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠轉(zhuǎn)移性腹水型肝癌細(xì)胞株H22由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所引進(jìn)。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 SBPS(寧波德康生物制品有限公司)，AgNO3(和光純業(yè)工業(yè)株式會(huì)社)，IPG Buffer(GE)，Tris(Sigma)，DTT(Sigma)，固相pH梯度干膠條(GE)，Ettan DALT twelve電泳系統(tǒng)(GE)，IPGphor3等電聚焦儀(GE)，ImageMaster 5.0分析軟件(GE)等。

1.3 方法

1.3.1 H22荷瘤小鼠模型建立 無菌條件下抽取接種第6～7天生長良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌細(xì)胞數(shù)>97%)，無菌生理鹽水1∶3稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度約2×107個(gè)/ml，0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)大于95%，小鼠右前肢腋部皮下接種0.2 ml/只制備實(shí)體瘤模型。設(shè)立荷瘤組與SBPS組，每組10只，SBPS組在接種6 h后每天腹腔注射SBPS 100 mg/kg，荷瘤組給等體積生理鹽水，同條件飼養(yǎng)。

1.3.2 組織收集及樣品處理 將各組小鼠處死，分別取兩組瘤組織各約0.4 cm×0.4 cm，用無菌條件下生理鹽水反復(fù)清洗，液氮保存。取凍存組織，稱重30～90 mg，研磨勻漿后置于450 μl裂解液中混勻。37℃孵育1 h，10℃，40 000 r/min離心15 min，吸取上清液。

1.3.3 雙向凝膠電泳 取兩組小鼠組織樣品，按PI進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦分離，再根據(jù)分子量進(jìn)行第二向SDS-PAGE分離，獲得兩組蛋白質(zhì)圖譜。

1.3.4 圖像掃描及分析 運(yùn)用ImageMaster 5.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行分析，找出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組和荷瘤組組織的2-DE圖譜 見圖1。

圖1 荷瘤組 (左)和SBPS組(右)蛋白表達(dá)圖譜

2.2 對(duì)照組與荷瘤組差異蛋白點(diǎn)分析 見圖2,表1，表2。

圖2 荷瘤組與SBPS組的差異蛋白點(diǎn)

表1 荷瘤組與SBPS組表達(dá)量相差3倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)

“+”表示在SBPS組高表達(dá)；“-”表示在SBPS組低表達(dá)

表2 荷瘤組與SBPS組特有的蛋白質(zhì)點(diǎn)

3 討 論

半枝蓮作為一種常用的抗腫瘤中藥，已在臨床上應(yīng)用于治療肝癌、胃癌、肺癌、直腸癌、鼻咽癌等，確切療效。SBPS作為半枝蓮抗腫瘤作用的主要成分已從不同角度得到證實(shí)，基于我們前期發(fā)現(xiàn)SBPS可明顯抑制小鼠HepA瘤(抑瘤率可達(dá)34.35%)〔3〕；其抗肝癌的作用機(jī)制體現(xiàn)在可控某些癌基因、抑癌基因和蛋白的表達(dá)〔4～6〕；對(duì)化療藥物有增效減毒作用〔7～9〕；對(duì)肝癌小鼠的免疫功能有調(diào)節(jié)作用〔10〕等，本研究通過雙向凝膠電泳技術(shù)分析差異蛋白表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)3倍以上變化的點(diǎn)有14個(gè)，在SBPS組中6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)；12個(gè)蛋白點(diǎn)在SBPS組特異表達(dá)，14個(gè)表達(dá)缺失，說明SBPS的抗肝癌作用可能與這些異常表達(dá)的蛋白有關(guān)，這些蛋白為我們進(jìn)一步研究其抗癌作用靶點(diǎn)提供了重要信息和技術(shù)支持。

1 張 怡，張甘霖，王笑民.中藥多糖抗腫瘤機(jī)制研究概況及思考〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015；(10)：2321-3.

2 趙鐵華，鄧淑華，楊鶴松，等.半枝蓮總黃酮抗甲型H1N1流感病毒感染的藥效學(xué)研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014；30(1)：147-8.

3 宋高臣，于英君，王喜軍.半枝蓮多糖的抗腫瘤作用及其調(diào)節(jié)免疫的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011；13(4)：641-3.

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5 宋高臣，于水瀾，曾 奇，等.SBPS對(duì)荷瘤小鼠癌基因表達(dá)的影響〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2010；12(5)：833-4.

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7 宋高臣，王桂云，劉洪鳳，等.半枝蓮多糖對(duì)環(huán)磷酰胺增效減毒作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥信息，2010；27(4)：107-9.

8 宋高臣，徐 薇，張 杰，等.半枝蓮多糖協(xié)同環(huán)磷酰胺治療肝癌的作用機(jī)制研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010；38(4)：48-50.

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10 于英君，周 群，贠可力，等.半枝蓮多糖輔助化療藥物對(duì)小鼠血清TNF-α、VEGF表達(dá)的影響〔J〕.中醫(yī)藥信息，2010；27(1)：29-31.

〔2016-06-13修回〕

(編輯 郭 菁)

牡丹江市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(Z2014s031)；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1251G066)

1 牡丹江市第一人民醫(yī)院

宋高臣(1971-)，男，教授，博士，主要從事中藥抗腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究。

許曉義(1981-)，男，講師，碩士，主要從事中藥抗腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究。

R735

A

1005-9202(2016)19-4709-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.016