崔艷領(lǐng)， 劉 甜， 孫 晗， 張 月， 馮 甜， 王慧平

(西北大學西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室， 陜西 西安 710069)

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川芎嗪對模擬失重大鼠頸動脈平滑肌Ca2+敏感性的影響*

崔艷領(lǐng)+， 劉 甜+， 孫 晗， 張 月， 馮 甜， 王慧平△

(西北大學西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室， 陜西 西安 710069)

目的：探討川芎嗪對模擬失重大鼠頸動脈平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性的影響及機制。方法：21只雌性SD大鼠分為對照組(CON)、模擬失重組(TS)、模擬失重+川芎嗪灌飼組(LTZ)(n=7)。4周后測定大鼠頸動脈收縮性、收縮蛋白Ca2+敏感性及肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑ML-7對以上指標的影響。結(jié)果：TS組苯腎上腺素(PHE)收縮力比CON組高25.14%(P<0.01)，LTZ組較TS組低13.46%(P<0.01)，較CON組高8.30%；ML-7可使CON、TS、LTZ組PHE收縮力分別降低8.84%、16.24%(P<0.01)和3.40%；TS組KCl收縮力比CON組高40.46%(P<0.01)，LTZ組較TS組低18.80%，較CON組高14.05%；ML-7可使CON、TS、LTZ組KCl收縮力分別降低21.97%(P<0.05)、21.88%(P<0.01)和10.84%；TS組pD2[Ca2+]比CON組高10.03%(P<0.01)，LTZ組較TS組低7.01%(P<0.01)，較CON組高2.32%；ML-7可使CON、TS、LTZ組pD2[Ca2+]分別降低2.42%、7.43%(P<0.01)和2.51%。結(jié)論：模擬失重大鼠頸動脈收縮增強可能是由動脈平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性增強所導致的。川芎嗪可改善模擬失重大鼠頸動脈的收縮功能，其機制可能與抑制血管平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶繼而降低Ca2+敏感性有關(guān)。

模擬失重；頸動脈；川芎嗪；Ca2+敏感性；肌球蛋白輕鏈激酶；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.019

(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Northwest University, Ministry of Education, Xi'an 710069, China)

航天觀察及地面實驗均顯示，失重/模擬失重可導致人或大鼠上/下(前/后)半身動脈血管收縮反應分別出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)這樣相反的適應性變化，對這一變化發(fā)生機制及防治措施的探究一直是航天醫(yī)學的熱點研究內(nèi)容之一?，F(xiàn)已證實血管結(jié)構(gòu)的重塑、血管平滑肌細胞的增殖與凋亡、平滑肌細胞膜表面激動劑受體數(shù)量、胞內(nèi)收縮蛋白的表達等均參與了上述血管收縮功能的變化[1-6]。近年來研究進一步指出由平滑肌細胞膜上L-型鈣通道和胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上蘭尼丁受體(ryanodine receptors,RyRs)介導的胞內(nèi)Ca2+水平的變化亦是失重時動脈血管收縮反應性改變的重要原因[7, 8]。在胞內(nèi)Ca2+誘發(fā)平滑肌細胞收縮時，其收縮強度與胞內(nèi)收縮蛋白對Ca2+離子的敏感性有關(guān)。收縮蛋白Ca2+敏感性于上世紀80年代末提出，是指心肌/平滑肌收縮蛋白在收縮過程中對胞內(nèi)游離Ca2+離子的敏感程度。多項研究已證實，在很多心血管疾病中出現(xiàn)的心肌/平滑肌收縮功能的改變均與收縮蛋白Ca2+敏感性的變化有關(guān)[9-12]。失重條件下動脈血管收縮反應性的上調(diào)下調(diào)變化是否也與平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性的變化相關(guān)，目前尚無此方面的報道。本研究擬對模擬失重后大鼠頸動脈平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性的變化進行探討。

川芎嗪作為一種活血類中藥，可通過抑制血小板聚集、提高紅細胞變形能力和表面電荷、降低血液粘度等機制改善失重/模擬失重下的血流動力[13]。本課題組亦曾證實川芎嗪可有效對抗模擬失重中出現(xiàn)的肌萎縮[14, 15]。為進一步拓寬川芎嗪在治療模擬失重中的應用，本實驗觀察了川芎嗪對模擬失重血管收縮功能的影響，并選用肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)特異性抑制劑ML-7研究川芎嗪改變模擬失重血管收縮功能的可能機制。通過本研究，初步明確失重條件下血管平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性發(fā)生的變化及其調(diào)控方式，揭示其在血管收縮功能改變中的地位和作用，為航天失重后心血管功能紊亂的防治提供新的基礎資料，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥在航天醫(yī)學中的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

21只健康SPF級SD雌性大鼠(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重(230±20)g，隨機分為3組(n=7)：對照組(control group, CON)，常規(guī)方式喂養(yǎng)，每日以2 ml生理鹽水灌飼；模擬失重組(tail suspension group, TS)，大鼠尾部懸吊4周模擬中長期失重狀態(tài)，吊尾方法參照文獻[16]，每日以2 ml生理鹽水灌飼；模擬失重+川芎嗪灌飼組(tail suspension plus ligustrazine group, LTZ)，大鼠同法吊尾4周，每日以2 ml川芎嗪溶液(濃度6 mg/ml)灌飼。

1.2 頸動脈血管環(huán)制備

大鼠以1.25 g/5 ml·kg烏拉坦腹腔注射麻醉，分離雙側(cè)頸動脈，去除血管周圍脂肪與結(jié)締組織后修整為長約2～3 mm的血管環(huán)，用不銹鋼絲掛鉤將其懸掛于內(nèi)盛K-H液(恒溫37℃)并通以O2的離體器官灌流浴槽中(K-H液組成mmol/L：NaCl 118, KCl 4.8, NaHCO325, CaCl22.5, MgSO41.2, KH2PO41.2, Glucose 9.8, pH 7.4)。給予初張力0.6 g，1 h后以60 mmol/L高K+液檢測血管環(huán)活性(高K+液組成mmol/L：NaCl 62.9, KCl 60, NaHCO325, CaCl22.5, MgSO41.2, KH2PO41.2, Glucose 9.8, pH 7.4)，若高K+液可使其張力增加1 g左右，即為有活性血管環(huán)，備用。

1.3 頸動脈血管環(huán)收縮功能測定

選取有活性血管環(huán)，分為兩組：一組采用離體血管環(huán)張力測定技術(shù)，在K-H液中加入苯腎上腺素(phenylephrine,PHE)或KCl，按照累積濃度法測定血管環(huán)對PHE(3×10-9～1×10-4mol/L)和KCl(1×10-8～3×10-5mol/L)的收縮反應性；另一組先向K-H液中加入1 μmol/L ML-7(MLCK抑制劑)，于避光條件下孵育30 min后更換K-H液，同上法測定血管環(huán)對PHE和KCl的收縮反應性。

1.4 頸動脈平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性測定

參照文獻[17, 18]，采用離體血管環(huán)張力測定技術(shù)，按照累積濃度法測定血管環(huán)對Ca2+的反應性，用F-[Ca2+]量效曲線以及pD2[Ca2+](達到最大張力50%時的Ca2+離子濃度)評價血管鈣敏感性。選取有活性血管環(huán)，向浴槽內(nèi)加入120 mmol/L無Ca2+高K+液(無Ca2+高K+液組成mmol/L：NaCl 2.7, KCl 120, NaHCO325, MgSO40.45, KH2PO41.03, Glucose 11.1, pH 7.4)，內(nèi)含50 μmol/L β-七葉皂苷(β-escin)和10 μmol/L A-23187。β-七葉皂苷用于透化細胞膜，以提高血管平滑肌細胞膜的通透性；A-23187可結(jié)合鈣離子并通過細胞膜，從而去除胞內(nèi)儲存的鈣。每6 min更換上述溶液一次，持續(xù)30 min后，用120 mmol/L無Ca2+高K+液檢測血管環(huán)對K+的反應性。若張力無變化，則表明胞內(nèi)Ca2+已去除殆盡。選取這樣的血管環(huán)，在120 mmol/L無Ca2+高K+液中加入累積濃度的CaCl2(1×10-4～1×10-2mol/L)，記錄血管環(huán)在CaCl2誘導下產(chǎn)生的收縮張力。

1.5 試劑與儀器

川芎嗪購自北京雙鶴藥業(yè)有限公司(許可證號No. H11021964)。PHE、ML-7、β-七葉皂苷和A-23187購自Sigma公司，其余均為國產(chǎn)分析純。收縮張力由Powerlab生理信號采集系統(tǒng)記錄。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠頸動脈的收縮反應性

PHE濃度為1×10-4mol/L時，CON組大鼠頸動脈血管環(huán)收縮張力為(1.004±0.083)g；TS組的收縮張力為(1.256±0.133)g，較CON組升高25.14%(P<0.01)；LTZ組的收縮張力為(1.087±0.070)g，較TS組降低13.46%(P<0.01)，較CON組升高8.30%。血管環(huán)經(jīng)ML-7孵育后，CON組、TS組和LTZ組的收縮張力分別為(0.915±0.173)g，(1.052±0.159)g和(1.050±0.107)g，較未加ML-7血管環(huán)分別降低8.84%、16.24%(P<0.01)和3.40% (圖1)。Fig. 1 Contraction of carotid artery induced by PHE in each group

PHE： Phenylephrine; CON: Control; TS: Simulated weightlessness

**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

KCl濃度為3×10-5mol/L時，CON組大鼠頸動脈血管環(huán)收縮張力為(0.833±0.107)g；TS組的收縮張力為(1.170±0.148)g，較CON組升高40.46%(P<0.01)；LTZ組的收縮張力為(0.950±0.139)g，較TS組降低18.80%，較CON組升高14.05%，均無顯著性差異。血管環(huán)經(jīng)ML-7孵育后，CON組、TS組和LTZ組的收縮張力分別為(0.650±0.143)g，(0.914±0.144)g和(0.847±0.107)g，較未加ML-7血管環(huán)分別降低21.97%(P<0.05)、21.88%(P<0.01)和10.84%(圖2)。

Fig. 2 Contraction of carotid artery induced by KCl in each group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

2.2 各組大鼠頸動脈平滑肌收縮蛋白的Ca2+敏感性

以各組大鼠頸動脈F-[Ca2+]量效曲線及pD2[Ca2+]代表其平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性。CON組大鼠頸動脈pD2為-2.763±0.072；TS組pD2為-3.040±0.057，較CON組升高10.03%(P<0.01)；LTZ組pD2為-2.827±0.102，較TS組降低7.01%(P<0.01)，較CON組升高2.32%。血管環(huán)經(jīng)ML-7孵育后，CON組、TS組和LTZ組的pD2分別為-2.696±0.030，-2.814±0.032和-2.756±0.071，較未加ML-7血管環(huán)分別降低2.42%、7.43%(P<0.01)和2.51%(圖3)。

Fig. 3pD2[Ca2+] value of carotid artery in each group

CON: Control group; TS: Simulated weighlessness group; LTZ: Ligustrazine administration group

**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

3 討論

本實驗選用了PHE和KCl誘發(fā)大鼠離體頸動脈發(fā)生收縮反應，其誘發(fā)的收縮分別為動脈血管典型的受體介導收縮與非受體介導收縮。實驗結(jié)果表明，模擬失重后PHE和KCl誘發(fā)的頸動脈的收縮反應均有顯著升高，這與失重條件下人或大鼠上半身

血管收縮反應性增強是一致的。動脈平滑肌對受體與非受體介導的收縮反應均升高，提示失重可能會導致收縮反應的共同通路上出現(xiàn)異常。

受體介導與非受體介導收縮均是以平滑肌收縮裝置收縮蛋白的活動為物質(zhì)基礎的，收縮蛋白的特性與收縮功能的形式和強度有著密切的關(guān)系。收縮蛋白的Ca2+敏感性是收縮蛋白的重要特性，收縮蛋白不同水平的Ca2+敏感性可導致血管平滑肌收縮強度不同[10, 12, 19]。本研究證實模擬失重后大鼠頸動脈平滑肌收縮蛋白的Ca2+敏感性顯著增強，因此我們推斷收縮蛋白Ca2+敏感性的升高可能是失重條件下頸動脈收縮功能增強的機制之一。

有關(guān)川芎嗪在對抗失重生理功能紊亂方面已有一些報道[13-15]，本研究進一步發(fā)現(xiàn)川芎嗪可糾正失重大鼠頸動脈異常的收縮反應，同時頸動脈的Ca2+敏感性也得以降低。這表明川芎嗪可能通過降低收縮蛋白的Ca2+敏感性從而改善了模擬失重大鼠頸動脈的收縮功能。

為深入探明川芎嗪對Ca2+敏感性的作用機制，本研究觀察了MLCK(肌球蛋白輕鏈激酶)特異性抑制劑ML-7對各組大鼠頸動脈收縮反應的影響。MLCK是平滑肌細胞內(nèi)提高收縮蛋白Ca2+敏感性最為重要的調(diào)控酶[20]。模擬失重大鼠頸動脈經(jīng)ML-7作用后，其Ca2+敏感性下降，受體介導與非受體介導的收縮功能均有所回落，亦證明其收縮功能的升高與Ca2+敏感性的上升有關(guān)。而ML-7對川芎嗪灌飼的失重大鼠以上指標無明顯影響，說明模擬失重+川芎嗪灌飼大鼠頸動脈內(nèi)MLCK已被川芎嗪抑制。實驗表明川芎嗪可通過抑制MLCK降低平滑肌的Ca2+敏感性。

可見川芎嗪可以降低模擬失重后頸動脈血管異常升高的收縮功能，其作用途徑可能是通過抑制平滑肌細胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈激酶，繼而降低平滑肌收縮蛋白Ca2+敏感性，進而改善平滑肌收縮功能。本文指出川芎嗪在對抗失重生理功能紊亂方面的一個新的作用機制，為拓寬川芎嗪在治療航天生理疾病中的應用奠定基礎。

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Effects of ligustrazine on the Ca2+sensitivity in carotid artery smooth muscle of simulated weightlessness rats

CUI Yan-ling+, LIU Tian+, SUN Han, ZHANG Yue, FENG Tian, WANG Hui-ping△

Objective: To study the effects of Ligustrazine on the Ca2+sensitivity in carotid artery smooth muscle of simulated weightlessness rats. Methods: Twenty-one female SD rats were divided into control group (CON), simulated weightlessness group (TS), simulated weightlessness plus Ligustrazine administration group (LTZ)(n=7). After 4 weeks, the contractile property and the Ca2+sensitivity in carotid artery were measured. Furthermore, the effects of ML-7(a myosin light chain kinase specific inhibitor) on above mentioned parameters were recorded. Results: Compared with CON group, the contractile force induced by phenylephrine (PHE) in TS group was increased by 25.14% (P<0.01). The force in LTZ group decreased by 13.46% (P<0.01) and increased by 8.30% compared with TS and CON group, respectively. After the artery rings were incubated with ML-7, the force in CON, TS and LTZ group were reduced by 8.84%, 16.24% (P<0.01) and 3.40%, respectively. Compared with CON group, the contractile force induced by KCl in TS group was increased by 40.46% (P<0.01). The force in LTZ group decreased by 18.80% and increased by 14.05% compared with TS and CON group, respectively. The force in CON, TS and LTZ group were reduced by 21.97% (P<0.05), 21.88% (P<0.01) and 10.84% by ML-7, respectively. Compared with CON group, thepD2[Ca2+] in TS group was increased by 10.03% (P<0.01). ThepD2[Ca2+] in LTZ group was decreased by 7.01% (P<0.01) and increased by 2.32% compared with TS and CON group, respectively. ThepD2[Ca2+] in CON, TS and LTZ group was reduced by 2.42%, 7.43% (P<0.01) and 2.51% by ML-7, respectively. Conclusion: The contraction of carotid artery is strengthened in simulated weightlessness rats, it maybe results from the Ca2+sensitivity of contractile proteins in smooth muscle increasing. Ligustrazine can improve the contraction of carotid artery, reducing the Ca2+sensitivity and inhibiting myosin light chain kinase may be involved in its mechanisms.

simulated weightlessness; carotid artery; Ligustrazine; Ca2+sensitivity; myosin light chain kinase； rats

陜西省自然科學基金項目(2013JM3001)；陜西省教育廳自然科學專項項目(14JK1755)；西北大學校級大學生創(chuàng)新實驗項目(2014004)

2015-04-18

2016-02-23

+: 共同第一作者

Q233

A

1000-6834(2016)04-361-05

△【通訊作者】Tel: 029-88303935; E-mail: wanghp@nwu.edu.cn.