林成成， 陸 紅， 吳蓮鳳， 梁 勇， 陳必成， 白永恒△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325000， 2. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 浙江 溫州 325000)

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巨噬細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)變?cè)诖笫竽I臟缺血/再灌注損傷中的作用*

林成成1， 陸 紅2， 吳蓮鳳2， 梁 勇1， 陳必成1， 白永恒1△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室， 浙江 溫州 325000， 2. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 浙江 溫州 325000)

目的：探討巨噬細(xì)胞在大鼠腎臟缺血/再灌注損傷過(guò)程中的亞型轉(zhuǎn)變及意義。方法：將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(Sham,n=6)和缺血/再灌組(IRI，夾閉腎動(dòng)脈45 min,n=24)。IRI組分別于術(shù)后0、6、24和72 h取腎組織，每個(gè)時(shí)相組6只大鼠。用HE染色觀察腎組織損傷程度；免疫組化染色檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)mRNA的表達(dá)；免疫組織熒光染色檢測(cè)MIF、單核巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)以及活化巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)，流式細(xì)胞分析檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1和M2亞型的分布特征。結(jié)果：病理結(jié)果顯示大鼠腎局部損傷情況和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度在24 h時(shí)最為嚴(yán)重，之后逐漸恢復(fù)。PCNA在再灌后表達(dá)明顯增加，6 h達(dá)峰值，72 h表達(dá)下降。相比于正常組，再灌組大鼠腎組織中MIF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高；MCP-1表達(dá)則在6 h達(dá)峰值，隨后下降；而CD68陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，24 h達(dá)峰值，72 h表達(dá)下降。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注6 h時(shí)，M1亞型分布達(dá)最高值；之后隨著缺血/再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，M1亞群相對(duì)含量開(kāi)始下調(diào)，M2隨之升高。結(jié)論：在腎臟缺血/再灌注早期，M1巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷發(fā)揮主要作用，隨后M2型表達(dá)逐漸上調(diào)，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖修復(fù)腎組織損傷。

腎臟；缺血/再灌注；巨噬細(xì)胞；損傷修復(fù)

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.014

缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)是指缺血組織或器官重獲血液灌注或氧供后，對(duì)組織和器官所產(chǎn)生的損傷作用，是急性缺血性腎功能衰竭、腎實(shí)質(zhì)切開(kāi)取石、腎移植術(shù)等發(fā)生及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中的主要腎損害方式之一[1-2]。腎IRI是急性腎功能衰竭的主要原因之一，也是移植排斥反應(yīng)，尤其是慢性排斥反應(yīng)的重要原因。另一方面，腎臟組織具有自我修復(fù)功能，研究發(fā)現(xiàn)，腎臟缺血/再灌注早期腎小管上皮細(xì)胞即可進(jìn)行分裂及分化，修補(bǔ)損傷時(shí)缺失的細(xì)胞[3,4]。因此，腎臟缺血/再灌注時(shí)，損傷與修復(fù)并存，對(duì)疾病的預(yù)后起著決定性作用。但目前IRI時(shí)的修復(fù)機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示，巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，在組織穩(wěn)態(tài)、炎性反應(yīng)以及損傷修復(fù)中發(fā)揮著不同的功能，這主要與局部微環(huán)境炎性狀態(tài)所控制的巨噬細(xì)胞表型密切相關(guān)[5,6]。但是巨噬細(xì)胞在腎組織IRI損傷修復(fù)中所起的作用及機(jī)制尚不完全明確。本研究通過(guò)建立大鼠腎IRI模型，觀察IRI不同時(shí)相大鼠腎組織中巨噬細(xì)胞亞型的動(dòng)態(tài)變化及功能，以探討其在腎IRI損傷修復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

30只雄性SD大鼠(體重220～240 g)購(gòu)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境。飼養(yǎng)于(22±2) ℃室溫，12 h/12 h光暗環(huán)境，自由飲水及進(jìn)食(標(biāo)準(zhǔn)飼料)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)程序均嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例執(zhí)行。

蘇木精-伊紅染色液(HE染色，碧云天生物公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Toyobo公司)；細(xì)胞增殖核抗原單克隆抗體(proliferating cell nuclear antigen，PCNA，美國(guó)Santa Curz公司)；MIF、MCP-1及CD68單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD FACSCalibur)。

1.2 動(dòng)物模型及分組

腎缺血/再灌注造模前大鼠均禁食1 d，10%水合氯醛(100 g/0.3 ml)腹腔內(nèi)注射麻醉。缺血/再灌組(IRI，n=24)：腹部正中行2 cm切口，鈍性分離右腎動(dòng)脈，靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈，右腎靜脈及輸尿管不夾閉，腎臟顏色逐漸由鮮紅色變?yōu)榘导t色，表明缺血成功。將腸管重新放回腹腔，用血管鉗鉗夾腹壁夾閉腹腔。45 min后打開(kāi)腹腔，松開(kāi)動(dòng)脈夾，恢復(fù)灌流，肉眼可見(jiàn)腎動(dòng)脈充盈，腎臟逐漸由暗紅色變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功，縫合腹壁。IRI組分別于術(shù)后0、6、24和72 h后取腎組織，每個(gè)時(shí)相組6只大鼠。假手術(shù)組(Sham，n=6)大鼠打開(kāi)腹腔，分離右腎動(dòng)脈，但不夾閉右腎動(dòng)靜脈及輸尿管。

1.3 HE染色

缺血/再灌注腎取出后，橫截面切開(kāi)于4%多聚甲醛溶液中固定，按常規(guī)方法進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成約4 μm厚的組織切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇和HE染色，最后中性樹(shù)膠封片。通過(guò)顯微鏡觀察腎臟病理改變。

1.4 腎臟總RNA提取及real-time RT-PCR檢測(cè)MIF的mRNA表達(dá)

采用Trizol試劑提取新鮮大鼠腎臟組織中的RNA，于260/280 nm測(cè)定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，采用相對(duì)定量法計(jì)算獲得結(jié)果。MIF的正向引物序列為5’-GTG CCA CCA CCA AAG ATA-3’，反向引物序列為5’-GGC TGA GAC AAC CCT AAT-3’；β-actin的正向引物序列為5’- CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3’，反向引物序列為5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’，由上海生工公司合成。相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=[Ct目的基因(待測(cè)樣品)-Ct內(nèi)參(待測(cè)樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct內(nèi)參(校正樣品)]。采用溶解曲線分析以評(píng)價(jià)PCR結(jié)果的可靠性。

1.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PCNA的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化酶法。所有標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚4 μm。檸檬酸鹽微波輻射進(jìn)行抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染。以Ⅰ抗稀釋液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照，PCNA陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。光鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)算PCNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比重。

1.6 免疫組織熒光染色檢測(cè)MIF、MCP-1及CD68的表達(dá)

腎組織用10%多聚甲醛于4℃冰箱中固定12 h后制成石蠟切片，常規(guī)脫水、浸蠟，連續(xù)切片，厚4 μm。MIF及CD68 I 抗稀釋度為1∶500；MCP-1 I 抗稀釋度均為1∶200。脫蠟至水，檸檬酸鹽高溫修復(fù)，以 II 抗相同來(lái)源的血清封閉。以I 抗稀釋液代替I 抗作為陰性對(duì)照，細(xì)胞內(nèi)或胞膜出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性表達(dá)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組石蠟切片的平均吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞分析檢測(cè)M1及M2的比例

腎組織研磨后加入細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。采用Percoll原液密度梯度離心的方法分離出浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞。取5支流式專用試管，試管1為空白對(duì)照，試管2加小鼠抗大鼠CD68—FITC，試管3加小鼠抗大鼠CD86—PE，試管4加小鼠抗大鼠CD163-Alexa Fluor 647行細(xì)胞表面染色。試管5同時(shí)加入以上3種抗體行細(xì)胞表面染色。試管2～5加入待檢的細(xì)胞懸液30 μl和相應(yīng)的抗體，充分混勻，室溫置暗處20 min；染色完成后加1 000 μl 的 1×PBS 震蕩搖勻后，以1 500 r/min，離心5 min，洗滌2次；最后加2% PFA 400 μl，震蕩搖勻，上級(jí)檢測(cè)。采用Calibur儀器 CellQuest軟件進(jìn)行3色分析，將收集到的所有細(xì)胞通過(guò)CD68-FITC和SSC作點(diǎn)陣圖，以FITC陽(yáng)性區(qū)為門R1；隨后將門R1中的細(xì)胞，以CD68-FITC和CD163-Alexa Fluor 647作點(diǎn)陣圖，以PE單陽(yáng)性區(qū)為M1型巨噬細(xì)胞，Alexa Fluor 647單陽(yáng)性區(qū)為M2型巨噬細(xì)胞，分析2種細(xì)胞的比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩數(shù)據(jù)比較前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，其中方差齊性者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s T3 法檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IRI大鼠腎組織損傷程度

如圖1所示，大鼠腎組織石蠟切片經(jīng)HE染色，鏡下觀察顯示Sham組腎臟皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)正常，小管管腔完整，腔面可見(jiàn)刷狀緣，間質(zhì)無(wú)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IRI 0 h時(shí)呈現(xiàn)典型缺血改變：細(xì)胞腫脹，部分小管刷狀緣受損，少數(shù)小管上皮細(xì)胞壞死。之后，隨著再灌時(shí)間延長(zhǎng)，小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)不同程度的腫脹、凝固性壞死、刷狀緣脫落，呈空泡樣、顆粒樣變性，腎間質(zhì)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中組織損傷程度以24 h最為嚴(yán)重；IRI 72 h，小管間質(zhì)損傷又明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯緩解(圖1，圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅶ)。

2.2 PCNA在IRI大鼠腎組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)

與Sham組(6.3±2.0%)相比，IRI組大鼠腎組織中PCNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比重明顯增加，IRI模型組0 h時(shí)為25.1%±5.2%(P<0.05)，6 h達(dá)到高峰，為37.4%±5.0%(P<0.05)。隨后IRI組大鼠PCNA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比重逐漸下降，與6 h表達(dá)比較，24 h為24.7%±8.5%，72 h時(shí)為9.7%±1.51%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

2.3 MIF、MCP-1及CD68在IRI腎組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)

如圖2所示，與Sham組相比，各時(shí)間點(diǎn)缺血/再灌組腎組織中MIF和CD68表達(dá)均升高。缺血/再灌注后，MIF表達(dá)持續(xù)升高，到24 h達(dá)最高值，而72 h表達(dá)較前下降。這些因子的表達(dá)改變反映腎局部組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移和活化的動(dòng)態(tài)改變。而MCP-1表達(dá)在IRI后迅速升高，在6 h 便達(dá)到頂峰，隨后表達(dá)下降(圖2，圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅶ)。如圖3所示，免疫組織熒光定量分析顯示，CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞表達(dá)在IRI后也迅速升高，24 h達(dá)到最高值(P<0.05)，72 h則表達(dá)下降(圖3，圖3見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅶ)。

如圖4所示，RT-PCR檢測(cè)MIF mRNA發(fā)現(xiàn)，相比于正常組，再灌組大鼠腎組織中MIF的mRNA相對(duì)水平明顯升高，并且于24 h達(dá)峰值(P<0.05)，72 h表達(dá)明顯下降。

*P<0.05vssham;#P<0.05vsIRI 24 h group

2.4 M1和M2亞群的巨噬細(xì)胞數(shù)目在IRI模型中的分布

表1給出了M1和M2亞群的巨噬細(xì)胞數(shù)目在IRI模型中的分布情況，結(jié)果顯示，假手術(shù)組模型基本為M2亞型。缺血起始階段，IRI模型組M1相對(duì)含量開(kāi)始升高，而M2亞型則明顯下降(P<0.05)；到缺血/再灌6 h時(shí)，M1亞型分布達(dá)最高值(P<0.05)，而M2亞型相對(duì)含量則最低(P<0.05)；之后，隨著缺血/再灌時(shí)間延長(zhǎng)，IRI模型組M1亞群相對(duì)含量又逐漸下調(diào)，M2隨之升高。

GroupM1macrophages/totalmacrophagesM2macrophages/totalmacrophagesSham0．002±0．0010．998±0．092IRI0h0．014±0．004?#0．981±0．103#IRI6h0．131±0．012?0．866±0．099?IRI24h0．032±0．003?#0．966±0．114#IRI72h0．025±0．001?#0．973±0．087#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsIRI 6 h group

3 討論

腎缺血/再灌注損傷(IRI)是臨床上引起急性腎損傷最主要的病因[7]，也是腎臟移植術(shù)后影響移植物早期功能恢復(fù)及長(zhǎng)期存活的主要因素之一[8]。因此，積極尋找IRI的防治手段顯得尤為迫切。而作為活化巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，CD68陽(yáng)性細(xì)胞水平在IRI后迅速上升并于24 h達(dá)峰；這證明了巨噬細(xì)胞是參與腎臟IRI過(guò)程中十分重要的白細(xì)胞種類，在不同階段發(fā)揮著不同作用。更進(jìn)一步，巨噬細(xì)胞不僅造成腎臟損傷，同時(shí)與腎臟修復(fù)也密切相關(guān)。然而，巨噬細(xì)胞亞型在腎臟IRI過(guò)程中轉(zhuǎn)化及相關(guān)機(jī)制尚不完全明確。

巨噬細(xì)胞具有功能可塑性，在不同的微環(huán)境中，呈現(xiàn)誘導(dǎo)組織損傷或促進(jìn)損傷修復(fù)的不同功能狀態(tài)，這主要與其不同亞型差異表達(dá)密切相關(guān)[5, 6, 9]。巨噬細(xì)胞可極化為兩種亞型，經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞(HLA-DR/CD68)導(dǎo)致炎性和免疫損傷，選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞(CD163/CD68)降低炎癥反應(yīng)，發(fā)揮組織修復(fù)功能。在腎缺血/再灌注損傷過(guò)程中，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為早期以M1促進(jìn)炎性反應(yīng)為主，通過(guò)分泌炎性介質(zhì)如TNF-α，IL-1，IL-6等加重腎損傷[10]；隨著病程進(jìn)展，M1型巨噬細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為促進(jìn)修復(fù)的M2型為主。我們的研究證實(shí)在正常腎組織中，M2型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在缺血/再灌注開(kāi)始時(shí)，M1相對(duì)含量便迅速增多，于6 h達(dá)到高峰，而此時(shí)M2相對(duì)含量最低。隨后，M1相對(duì)含量下降，M2相對(duì)含量上升。然而實(shí)驗(yàn)中缺血/再灌注腎組織病理?yè)p傷最為嚴(yán)重出現(xiàn)在24 h。這一結(jié)果提示M1巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的損傷過(guò)程可能在超早期迅速啟動(dòng)并在6 h達(dá)到高峰，此后雖然M2巨噬細(xì)胞相對(duì)含量逐漸增多，但在這個(gè)過(guò)程中IRI損傷仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)并持續(xù)到24 h。隨后，M2介導(dǎo)的修復(fù)過(guò)程逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)， IRI后72 h時(shí)腎組織損傷已明顯修復(fù)。

MIF是一種廣泛存在于免疫、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)的促炎性因子，在多種炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。MIF在腎臟內(nèi)主要由巨噬細(xì)胞表達(dá)，并直接作用于巨噬細(xì)胞，抑制其游走，促進(jìn)其在炎癥部位的聚集、增生、活化及分泌一些細(xì)胞因子如IL-1和TNF-α[11]；與腎組織損害及功能衰退有密切關(guān)系。有研究顯示給大白兔注射腎毒血清和抗MIF中和抗體，能有效地防止腎組織損害的發(fā)生與發(fā)展[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟IRI早期，MIF表達(dá)持續(xù)升高，24 h達(dá)最高值，促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的聚集、增生、活化及分泌炎性介質(zhì)而加重腎損傷。這與實(shí)驗(yàn)中缺血/再灌注24 h時(shí)巨噬細(xì)胞表達(dá)達(dá)峰并導(dǎo)致組織損傷最嚴(yán)重保持一致。不同的是，MCP-1在6 h表達(dá)即達(dá)峰，與其他研究結(jié)果基本一致[13]。MCP-1作為重要的趨化因子之一，對(duì)單核巨噬細(xì)胞具有趨化和激活作用，可以調(diào)節(jié)其向腎組織浸潤(rùn)，促進(jìn)溶酶體的釋放和氧自由基大量產(chǎn)生，造成組織損傷[13]。這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞在IRI 24 h內(nèi)主要表現(xiàn)為損傷作用，提示M1亞型此時(shí)占主導(dǎo)作用。

另一方面，眾多組織及功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M2巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的組織損傷修復(fù)功能。在腎臟IRI等引起的腎臟組織損傷后，M2巨噬細(xì)胞可以刺激包括腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的眾多細(xì)胞類型的增殖再生。一方面，這可能與抑制經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞，減少促炎因子和iNOS的產(chǎn)生有關(guān)[14]。M2巨噬細(xì)胞還可以吞噬受損細(xì)胞和細(xì)胞廢墟。另外，M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)淋巴細(xì)胞的功能和增殖。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，IRI損傷修復(fù)過(guò)程中巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用可能與IL-10有關(guān)。兩者之間可形成正反饋。因此，巨噬細(xì)胞是腎損傷與修復(fù)的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。眾多研究表明，干預(yù)巨噬細(xì)胞或其功能的治療對(duì)包括腎缺血/再灌注在內(nèi)的不同類型腎臟疾病均具有改善作用，可以成為治療腎臟疾病的潛在手段。

PCNA(DNA聚合酶δ輔助蛋白)與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在啟動(dòng)細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)，作為反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)，PCNA在腎臟缺血/再灌注后6～24 h達(dá)到高峰，而在修復(fù)最顯著的72 h反而呈下降趨勢(shì)。這一結(jié)果更進(jìn)一步提示雖然M2巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)過(guò)程可能在超早期即已開(kāi)始，細(xì)胞增殖在6～24 h迅速達(dá)到高峰，但此時(shí)IRI損傷仍占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且增殖細(xì)胞尚未成熟，導(dǎo)致24 h腎臟組織損傷仍最為嚴(yán)重。24 h后修復(fù)細(xì)胞增殖速率較前下降，但增殖細(xì)胞逐漸成熟，修復(fù)逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)， IRI后72 h時(shí)腎組織損傷已明顯修復(fù)。另外，最近研究發(fā)現(xiàn)，在IRI早期采用氯磷酸鹽脂質(zhì)敲除小鼠全身單核巨噬細(xì)胞，細(xì)胞增殖顯著減少，腎臟組織病理?yè)p傷明顯加重[15]。據(jù)此，我們推斷，M2巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)作用在IRI整個(gè)過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)位置，但在0～6 h時(shí)M1巨噬細(xì)胞比例迅速上升并達(dá)峰，導(dǎo)致0～24 h時(shí)損傷占優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，在腎臟缺血/再灌注早期，雖然M1巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但巨噬細(xì)胞已開(kāi)始逐漸恢復(fù)為M2型，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖對(duì)組織損傷進(jìn)行修復(fù)。本研究為超早期干預(yù)巨噬細(xì)胞及其功能，減少腎臟組織損傷并促進(jìn)恢復(fù)的研究提供了基礎(chǔ)。但其詳細(xì)的作用機(jī)制及分子通路尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

[1] Kucuk A, Kabadere S, Tosun M,etal. Protective effects of doxycycline in ischemia/reperfusion injury on kidney [J].JPhysiolBiochem, 2009, 65(2): 183-191.

[2] Liangos O, Tighiouart H, Perianayagam MC,etal. Comparative analysis of urinary biomarkers for early detection of acute kidney injury following cardiopulmonary bypass[J].Biomarkers, 2009, 14(6): 423-431.

[3] Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A,etal. Intrinsic epithelial cells repair the kindey after injury [J].CellStemCell, 2008, 2(3): 284-291.

[4] 王 玉， 李曉玫. 腎臟固有細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化特征及其病理生理意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志， 2002, 18(10): 1303-1307.

[5] Lee S, Huen S, Nishio H,etal. Distinct macrophage phenotypes contribute to kindey injury and repair [J].JAmSocNephrol, 2011, 22(2): 317-326.

[6] 趙雅妮， 李驚子， 王海燕. 巨噬細(xì)胞在腎臟損傷中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2004, 20(11): 2147-2150.

[7] Perico N, Cattaneo D, Sayegh MH,etal. Delayed graft function in kidney transplantation [J].Lancet, 2004, 364 (9447): 1814-1827.

[8] 魏日胞， 李 平， 丁 瑞， 等． 葡天膠囊對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J]． 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志， 2010, 11(4): 295-297.

[9] Nelson PJ, Rees AJ, Griffin MD,etal. The renal mononuclear phagocytic system [J].JAmSocNephrol, 2012, 23(2): 194-203.

[10]趙春玲， 張春來(lái)， 李莉華， 等． IL-1受體拮抗劑減輕離體豬腎缺血/再灌注損傷的作用及其機(jī)制[J]． 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2001, 17(3): 247-250.

[11]張翠萍， 謝印芝， 陳 鵬， 等． 低氧對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的影響及其機(jī)制[J]． 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2005, 21(3): 281-284.

[12]Foote A, Briganti EM, Kipen Y,etal. Macrophage migration inhibitory factor in systemic lupus erythematosus [J].JRheumatol, 2004, 31(2): 268-273.

[13]楊 立， 秦大山， 岳中瑾． 腎缺血再灌注中單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的相關(guān)作用[J]． 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003, 24(18): 1659-1661.

[14]Cao Q, Wang Y, Zheng D,etal. IL-10/TGF-beta-modified macrophages induce regulatory T cells and protect against adriamycin nephrosis[J].JAmSocNephrol, 2010, 21(6): 933-942.

[15]魏 盼， 黃文娟， 萬(wàn) 辛， 等． 巨噬細(xì)胞在小鼠腎臟缺血/再灌注損傷修復(fù)中的作用[J]． 中華腎臟病雜志， 2014, 30(10): 757-762.

The role of sub-transform of macrophages in renal ischemia/reperfusion injury in rats

LIN Cheng-cheng1, LU Hong2, WU Lian-feng2, LIANG Yong1, CHEN Bi-cheng1, BAI Yong-heng1△

(1. Wenzhou Key Laboratory of Surgery, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000;2. Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Meical University, Wenzhou 325000, China)

Objective: To investigate the role of sub-transform macrophage in ischemia/reperfusion renal injury in rats, as well as underlying mechanisms. Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into ischemia/reperfusion (IRI,n=24, renal artery was occluded for 45 min) group and sham-operation (Sham,n=6) group. The kidneys in IRI group were collected at 0, 6, 24 and 72 h after operation (6 rats for each time point). The injury of the kidney was detected with HE staining. Immunohistochemistry staining was performed to evaluate the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF). Moreover, the expression and location of MIF, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage marker CD68 were examined by immunofluorescence staining. Most importantly, the distribution of macrophage subtypes M1 and M2 was analyzed by flow cytometry. Results: The worst pathologic damage of the renal tissues, as well as infiltration of inflammatory cells, was observed at 24 h after operation in IRI rats, with obvious recovery afterwards. Immunohistochemistry staining showed that the expression of PCNA was significantly increased after the ischemia/reperfusion, peaking at 6 h and reducing at 72 h after operation. Compared with sham group, the levels of MIF at mRNA and protein levels were both significantly increased after the ischemia/reperfusion, while the expression of MCP-1 was peaked at 6 h and decreased afterwards. Moreover, the expression of CD68-positive macrophages were significantly increased in IRI rats, with peaking at 24 h and reducing at 72 h. Furthermore, after 6 h of reperfusion, the percentage of M1 macrophages reached the peak, and thereafter the relative expression of M1 and M2 was reduced and increased, respectively. Conclusion: In the early phase of ischemia/perfusion renal injury, M1 macrophage results in renal damage, and afterwards the M2 macrophage is increased and repairs the renal damage by improving the cell proliferation.

kidney; ischemia/reperfusion; macrophage; injury and recovery

浙江省自然科學(xué)基金(LY16H310005)；溫州市科技局項(xiàng)目(Y20130094,Y20150095)

2015-11-12

2016-04-03

R692; R363.2

A

1000-6834(2016)04-338-06

△【通訊作者】Tel： 0577-88069338； E-mail： greatsailor@163.com