朱 寧， 趙旭勇， 向貽佳， 曾春來

(溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院心內科， 浙江 麗水 323000)

?

大鼠肺細小動脈平滑肌細胞培養(yǎng)新方法的建立及血小板衍生因子對其增殖遷移的影響*

朱 寧， 趙旭勇， 向貽佳， 曾春來△

(溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院心內科， 浙江 麗水 323000)

目的：建立一種操作簡單、實驗儀器要求低的大鼠肺細小動脈平滑肌細胞(PASMCs)分離和培養(yǎng)的方法，并且探索血小板衍生因子(PDGF)介導的增殖、遷移的情況。方法：向右心注射鐵及瓊脂糖，利用瓊脂糖能同時粘附血管內皮細胞、平滑肌細胞及鐵粉，再結合膠原酶I的消化，通過磁力架吸引鐵，特異性地分選出帶血管的肺組織，經過3～4周左右的培養(yǎng)及純化，得到肺細小動脈平滑肌細胞。用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，免疫細胞化學法和免疫熒光染色法進行α-平滑肌肌動蛋白鑒定。MTT實驗和劃痕實驗檢測PDGF誘導的肺動脈細小平滑肌細胞的增殖和遷移。結果：分離后第14天、第21天及傳代后進行鑒定，均表明分離培養(yǎng)的細胞為PASMCs。MTT結果表明，與不加PDGF組相比，PDGF增殖明顯增加(P<0.05)。劃痕實驗結果顯示PDGF刺激組比不刺激組遷移顯著增多。結論：本方法分離培養(yǎng)大鼠的PASMCs，操作方便，實驗儀器要求低。PDGF能夠促進肺細小動脈平滑肌細胞的增殖、遷移。

肺動脈平滑肌細胞；大鼠；分離；原代培養(yǎng)。

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.015

肺動脈高壓是一種不可逆轉，致死率很高的嚴重疾病。前列環(huán)素、內皮素拮抗劑和5型磷酸二酯酶抑制劑是目前用于肺動脈高壓治療的主要藥物，它們具有舒張血管及較弱的抗血管平滑肌細胞增殖

能力。它們能改善肺動脈高壓患者的生存質量，但是依然不能降低死亡率[1]。所以還有待進一步研究肺動脈高壓的發(fā)病機制以及開發(fā)新的治療藥物。越來越多的研究表明肺細小動脈平滑肌細(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的增殖、遷移導致的肺小動脈重構在肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展過程中起到了決定性的作用[2-4]，所以獲得原代的PASMCs對于肺動脈高壓病理生理機制以及分子機制的研究有重要的意義。同時PASMCs也能應用于肺動脈高壓治療藥物的作用機制研究。近年來有文獻報道了PASMCs的原代分離方法[5,6]，但這些分離方法均需在體視顯微鏡下剝離肺內細小動脈，然后進一步分離PASMCs。首先這些方法對實驗設備有特別的要求(需在體視顯微鏡下操作)，這在一定程度上限制了方法的推廣，增加實驗的成本。其次，且肺細小動脈相對較細，手動剝離操作難度較高。本實驗經過不斷探索和研究，找到一種操作簡單，儀器設備需求低的PASMCs分離方法。同時初步證明了血小板衍生因子(platelet-derived growth factor, PDGF)同樣刺激能分離傳代得到的大鼠肺細小動脈平滑肌細胞增殖和遷移。

1 材料與方法

1.1 主要材料

(250±20)g健康SD大鼠購自上海動物實驗中心;DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青-鏈霉素 (雙抗)、 Hank’s 液及 PBS液購自Hyclone；膠原酶 I，α肌動蛋白單克隆抗體 (α-SMA),牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，鐵粉購自Sigma公司，MTT試劑盒購自碧云天；瓊脂糖購自Denville公司；鼠二步法檢測試劑盒購自基因科技(上海)有限公司；異硫氫酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)，羊抗小鼠IgG購自Invitrogen公司，MTT試劑盒購自碧云天。

1.2 PASMCs的培養(yǎng)

1.2.1 原代PASMCs分離方法 (1)配制所需溶液：右心注射液：10 ml DMEM+50 mg瓊脂糖+50 mg鐵粉；肺灌注液：10 ml DMEM+50 mg瓊脂糖；完全培養(yǎng)基：10%FBS的 DMEM；消化溶液：膠原酶I2.1 mg加入10 ml DMEM中。(2)麻醉大鼠：健康雄性SD大鼠鼠，用10%水合氯醛0.8 ml經腹腔注射麻醉，放入75%乙醇中浸泡3～5 min。(3)處死及注射前準備：打開腹腔，剪斷腹主動脈，流水沖洗，盡量使全身血液流盡，在無菌操作臺快速剪開頸部，5 ml一次性注射器針頭插入氣管，結扎固定。迅速打開胸腔，暴露右心室。(4)液體注射：右心注入10 ml PBS，去除肺循環(huán)內血液。預先配制的右心注射液煮沸，放置冰上冷卻至37℃左右，用5 ml一次性注射器注射10 ml右心注射液，可以看到肺內細小血管變成黑色，證明注射成功。氣管內注射10 ml的肺灌注液。(5)分離含肺細小動脈的肺組織：取出肺臟置于加雙抗的Hank’s液中洗滌后穩(wěn)定5 min，再移到新的10 ml Hank’s液中，剪碎肺組織。(6)洗滌：在含肺組織的將溶液倒入50 ml離心管內，放置于磁力架上，可以看到所需要的組織被吸引到一邊，小心棄去廢液和無用組織，再加入含有雙抗的PBS漂洗3次。(7)消化：用預先配制的10 ml消化液重懸肺組織，移到10 cm培養(yǎng)皿，37℃孵育2 h。(8)再次漂洗：用上面的方法洗滌肺組織，加入5 ml完全培養(yǎng)基接種于6 cm培養(yǎng)皿，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(9)純化：分離后的第2天棄去上清，PBS重懸，移入50 ml離心管，磁力架吸引下PBS洗3次，用完全培養(yǎng)基重懸，第6天、第9天進行同樣的操作，可留下含有肺細小動脈的組織。(10)等到分離后的13 d鏡下可見一些平滑肌細胞遷出，棄去培養(yǎng)液，溫的PBS洗3次，胰酶消化，輕柔吹打，靜置5 min。加入5 ml完全培養(yǎng)基，移到50 ml離心管中，磁力架吸引殘留的鐵粉，這次吸取上清就是需要的平滑肌細胞，同時去除鐵粉。將上清移到6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，需要1～2周后可見細胞長滿培養(yǎng)皿, 即可行傳代培養(yǎng)。

1.2．2 PASMCs的傳代培養(yǎng) 當培養(yǎng)的細胞生長達培養(yǎng)瓶80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，用2 ml PBS清洗培養(yǎng)皿2～3次，加入1 ml 0.25%胰酶，輕柔吹打數次培養(yǎng)皿，靜止5 min,鏡下觀察到大量細胞懸浮在培養(yǎng)基里時加入含10%血清培養(yǎng)基終止消化，反復吹打制成細胞懸液，8 000 r/min,5 min。小心棄去上清液，注意不要吸到離心管底下細胞，加10 ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔3～5 d換液，細胞傳至3～5代可凍存用于實驗。

1.3 PASMCs的純化

PASMCs 本身相對于內皮細胞、成纖維細胞有絕對的生長優(yōu)勢，在培養(yǎng)過程中內皮細胞及成纖維細胞均會逐漸消失，平滑肌細胞的純度會逐漸上升，但可能需要多次傳代。因為相對于較少的內皮細胞而言，成纖維細胞在細胞從血管遷出開始時數目基本與平滑肌細胞相等。

1.4 PASMCs的鑒定

1.4．1 細胞形態(tài)鑒定 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)細胞的形態(tài),并攝片保存。

1.4．2 免疫組化鑒定 (1)取分離后14 d的PASMCs接種于底部放置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)1～2 d。(2)棄去培養(yǎng)液， PBS漂洗爬片的細胞，5 min×3次。 (3)4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。(4)用BSA(PBS配制)室溫封閉1 h。(5)加入小鼠源性α-肌動蛋白單克隆抗體(稀釋比1∶400，PBS配制)，4℃過夜。(6)PBS液漂洗5 min×3次，滴加免疫組化試劑盒抗小鼠二抗，室溫孵育1 h。(7)PBS漂洗5 min×3次。(8)DAB溶液顯色,在鏡下控制顯色程度，用蘇木素復染細胞核，清水漂洗。(9)在75%→95%→95%→100%→100%濃度乙醇中梯度脫水，最后中性樹膠封片。

1.4．3 免疫熒光染色法 鑒定取分離后21 d及傳代培養(yǎng)的PASMCs接種于底部放置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)1～2 d。(2)棄去培養(yǎng)液， PBS漂洗爬片的細胞，5 min×3次。(3)4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。(4)用BSA(PBS配制)室溫封閉1 h。(5)加入小鼠源性α-肌動蛋白單克隆抗體(稀釋比1∶400，PBS配制),4℃過夜。(6)PBS液漂洗5 min×3次，滴加二抗 (FITC標記兔抗小鼠)，孵育1 h。(7)PBS漂洗5 min×3次。滴加細胞核染色液DAPI(10 μg/ml)室溫孵育3～5 min,倒置熒光顯微鏡下對同一視野以不同激發(fā)波長(FITC: 450～490 nm和PI:515～560 nm) 觀察并攝片。

1.5 MTT實驗

取生長良好的對數生長期細胞，消化后接種于96孔板，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)1 d等細胞貼壁即可實驗。棄去培養(yǎng)液,PBS漂洗，加入含0.5% FBS的DMEM饑餓48 h。棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗，加入新的0.5% FBS的DMEM，一組加入PDGF，終濃度為20 ng/ml，一組則不加。根據試劑盒說明，每孔加入10 μl MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h.每孔加入100 μl Formanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內再繼續(xù)孵育。直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解。37℃孵育4 h，紫色結晶會全部溶解。最后檢測570 nm波長附近的吸光度。

1.6 劃痕實驗

細胞饑餓預處理同MTT實驗，用200 μl槍頭在培養(yǎng)皿中間劃一條線，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，加入新的0.5% FBS的DMEM。一組加入PDGF，終濃度為20 ng/ml，一組則不加。24 h后相差倒置顯微鏡下觀察細胞在劃痕處的遷移情況。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞生長情況

倒置相差顯微鏡下，剛消化后第6天前的部分細小動脈形態(tài)仍可見，同時有黑色鐵粉沉積，顯示其為需要獲得的細小動脈(圖1A)；14 d之后細胞呈不規(guī)則形狀、透亮、單個或呈細胞團分布，少量未貼壁細胞上浮(圖1B)；21 d后可見貼壁細胞數量明顯增多，多呈梭形，或呈三角形等形狀(圖1C)，細胞可鋪滿80%～90%的6 mm的培養(yǎng)皿。細胞傳代培養(yǎng)后仍能保持原來的形態(tài)特點(圖1D，圖1見彩圖頁Ⅷ)。

2.2 鑒定結果

免疫組織化學結果顯示分離后第21天的細胞能表達α-SMA，細胞胞漿呈棕黃色，胞質中有細絲狀物質，為肌動蛋白(圖2，圖2見彩圖頁Ⅷ)，說明有效地分離出了PASMCs，細胞共計901個。同時免疫熒光染色也表明在分離后第21天以及傳代培養(yǎng)后，98%的細胞都能表達α-SMA，說明分離的細胞絕大部分為PASMCs(圖3A,B),共計868個PASMCs;傳代后100%為PASMCs(圖3C,D，圖3見彩圖頁Ⅷ),共計1211個PASMCs。

2.3 MTT法檢測細胞增殖結果

用MTT法檢測時，吸光度與細胞數目相關，細胞增殖越多吸光度越強。結果顯示PDGF組吸光度明顯高于對照組(0.110±0.005vs0.035±0.003，P<0.05)，說明PDGF組細胞增殖明顯。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移結果

培養(yǎng)皿中間劃出一條沒有細胞的區(qū)域，平滑肌細胞可緩慢遷移到空白處，以此檢驗細胞的遷移情況。如圖4顯示，與對照組相比，PDGF組遷移到中間無細胞區(qū)域數量明顯增多(58±2vs19±3，P<0.01)，提示PDGF能有效刺激細胞的遷移(圖4，圖4見彩圖頁Ⅷ)。

3 討論

由于肺動脈高壓的肺循環(huán)疾病到目前是治療的難點，體外培養(yǎng)的PASMCs有重要的研究價值。深入研究肺細小動脈平滑肌細胞增殖、遷移功能及分子機制能了解肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展和藥物研究的藥理學機制。

由于肺細小動脈處于肺循環(huán)的終末段，分離得到原代的PASMCs存在很大的技術難度。之前也有一些文獻報道了PASMCs的分離方法，但大多采用體視顯微鏡下分離，操作繁瑣，并且對儀器設備要求較高，這很大程度上限制了這些方法的推廣應用。本文建立的方法在設備上僅需一般的倒置相差顯微鏡即可，主要是利用瓊脂糖同時吸附血管內皮細胞和鐵粉，而鐵粉顆粒的大小正好使得它們能沉積在肺細小動脈中，再用磁力架吸引鐵粉，這樣經過膠原酶I就能篩選出帶有肺細小動脈的肺組織，經過大約3周左右的培養(yǎng)和純化，就能得到較純的PASMCs。

同時本方法經適當改良完全可用于小鼠的PASMCs，對于基因敲除和導入小鼠的體外研究意義重大，而且操作上與大鼠相比，難度并沒有明顯增加。而之前也有文獻報道用體視顯微鏡分離小鼠的PASMCs,則操作上會更加困難，所以本方法具有廣泛應用的前景。本實驗雖然方法簡單，但與之前直接剝離PASMCs的方法相比分離的效率不是特別高，所需時間也相對較長。采用錢國清等人[5]的方法一周左右即可獲得較純的PASMCs，但是本方法大約需要3周才能獲得足量的較純的PASMCs。當然也可采用多只大鼠同時進行，可提高獲得PASMCs的效率，同時也更有利于細胞貼壁及生長。

正常情況下血管平滑肌細胞發(fā)揮維持血管可塑性的作用，而當應對如壓力、血管剪切力、炎癥等外界環(huán)境刺激，會通過減少收縮狀態(tài)的標志物而發(fā)生表型轉換。此時血管平滑肌細胞的遷移、增殖和基質合成增加[7,8]，這也是許多心血管疾病如肺動脈高壓[9]、冠狀動脈粥樣硬化[10]、血管成形術后再狹窄[11]等。雖然孟立平等人[12]采用同型半胱氨酸誘導的方法來研究黃酒活性成分對血管平滑肌細胞的增殖、遷移的影響，但是PDGF刺激平滑肌細胞的增殖、遷移，是研究平滑肌細胞功能最經典的方法，應用也最廣泛[13]。本實驗證明分離得到的PASMCs也像一般平滑肌細胞受PDGF刺激后增殖、遷移明顯增加，完全可用于PASMC過度增殖、遷移導致的肺動脈高壓機理和藥理學的研究。

實驗過程中，需要注意一下幾點：(1)開始放血一定要盡量放干凈，以免小的血栓堵在肺細小動脈，導致鐵顆粒無法進入；(2)操作應該在無菌手術臺進行，所用手術器械均應該消毒，分離組織后需放入加雙抗的Hank’s 液中清洗及其他操作，避免細胞污染；(3)所用瓊脂糖必須是低熔點的；(4)注射到大鼠體內的混合溶液需先煮沸，而后冰上降溫到37℃左右，避免燙傷細胞；(5)剪碎組織后需保持在低溫狀態(tài)，使得鐵粉瓊脂糖混合溶液處于凝固狀態(tài)，避免鐵粉進入氣管，粘連在氣管平滑肌細胞上；(6)分離得到的肺細小動脈最后一次利用磁力架清洗時贏盡量去除鐵粉，長期暴露于鐵粉可能影響細胞的氧化還原平衡。

本實驗方法獲得PASMCs操作簡單 ,實用性強，易于推廣，能為更好地防治肺動脈高壓打下堅實的基礎。

[1] Michelakis ED.Pulmonary arterial hypertension: yesterday, today, tomorrow[J].CircRes, 2014, 115(1): 109-114.

[2] Hoeper MM, Mayer E, Simonneau G,etal. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension [J].Circulation, 2006,113(16): 2011-2020.

[3] Courboulin A, Paulin R, Giguere NJ,etal. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension [J].JExpMed, 2011, 208(3): 535-548.

[4] Rabinovitch M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension [J].JClinInvest, 2012,122(12):4306-4313.

[5] 錢國清, 王良興, 陳 嬋, 等. 大鼠細小肺動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)和鑒定方法的研究[J]. 中國應用生理學雜志, 2010, 26(1): 125-128.

[6] 虞曉明, 郭 瑞, 唐江鋒, 等. 小鼠肺細小動脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)和鑒定以及低氧對其增殖與凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(9): 1724-1728.

[7] Owens GK, Kumar MS, Wamhoff BR. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease[J].PhysiolRev, 2004, 84(3): 767-801.

[8] Owens GK. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells[J].PhysiolRev, 1995, 75(3): 487-517.

[9] Savai R, Al-Tamari HM, Sedding D,etal. Pro-proliferative and inflammatory signaling converge on FoxO1 transcription factor in pulmonary hypertension[J].NatMed, 2014, 20(11): 1289-1300.

[10]Roque M, Kim WJ, Gazdoin M,etal. CCR2 deficiency decreases intimal hyperplasia after arterial injury[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2002, 22(4): 554-559.

[11]Li P, Zhu N, Yi B,etal. MicroRNA-663 Regulates human vascular smooth muscle cell phenotypic switch and vascular neointimal formation[J].CircRes, 2013, 113(10): 1117-1127.

[12]孟立平， 周昌鉆， 郭 艷， 等. 黃酒中抑制同型半胱氨酸誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖和遷移成分探討[J]. 中國應用生理學雜志, 2015, 31(5): 437-442.

[13]Tallquist M, Kazlauskas A. PDGF signaling in cells and mice[J].CytokineGrowthFactorRev, 2004, 15(4): 205-213.

A method of primary cell culture of rat pulmonary artery smooth muscle cells and effects of platelet-derived growth factor induced proliferation and migration

ZHU Ning, ZHAO Xu-yong, XIANG Yi-jia, ZENG Chun-lai△

(Cardiovascular Department, the Fifth Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Lishui 323000, China)

Objective: To establish an easy, not depending on advanced laboratory apparatus method to isolate and culture rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs), and to explore the effects of platelet-derived growth factor (PDGF) on cell proliferation and migration. Methods: The right ventricle was perfused with the mixture of iron, agarose, and the PASMCs and iron could adhere to agarose. The iron-containing tissue would move to side of the tube next to the magnet and could be digested by collagenase I. By the method, vessel-containing tissue could be attained. With 3-4 weeks' purification, the PASMCs could be obtained. The PASMCs morphology was observed by an inverted microscope, and identified by immunocytochemistry and immunofluorescence. The effects of PDGF on cell proliferation and migration was detected by MTT assay and scratch wound assay. Results: 14 days、21 days and primary culture after isolation, the PASMCs was identified, and the result showed that isolation and primary culture of the cells were PASMCs. Compared with the cells with no stimulation, the proliferation of PASMCs exposed to PDGF was increased significantly(P<0.05), and scratch wound assay demonstrated that PDGF induced the significant increase of migration of PASMCs. Conclusion: This method to isolate and culture rat PASMCs is simple, not depending on advanced laboratory. PDGF can promote the proliferation and migration of PASMCs.

pulmonary arterial smooth muscle cells; rat; isolation; primary cell culture

2015-09-28

2016-05-16

R332

A

1000-6834(2016)04-343-05

△【通訊作者】Tel: 0578-2681018; E-mail: zengchunlai@medmail.com.cn