盧 娜， 白瑞櫻， 黃 河， 李成長， 李超

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室， 2. 河南新鄉(xiāng)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

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低氧預適應對氧糖剝奪損傷SH-SY5Y細胞的保護作用*

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室， 2. 河南新鄉(xiāng)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：觀察低氧預適應(HPC)對氧糖剝奪(OGD)損傷人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的保護作用，并探討其可能機制。方法：SH-SY5Y細胞隨機分為4組：正常對照組：常規(guī)培養(yǎng)，不進行OGD處理；HPC處理組: 將神經(jīng)元放入低氧培養(yǎng)箱內(nèi)(2% O2)，30 min后立即取出，再恢復常氧培養(yǎng)，反復5次；OGD組：無糖培養(yǎng)基、低氧培養(yǎng)箱內(nèi)(1% O2)處理細胞10 h，然后復氧復糖培養(yǎng)24 h；HPC + OGD處理組：細胞HPC后，行OGD處理。通過形態(tài)學觀察，MTT比色法檢測細胞存活率，乳酸脫氫酶(LDH) 漏出量判斷細胞損傷的程度，原位末端標記(TUNEL)法檢測凋亡水平，Western blot檢測Caspase 3、低氧誘導因子1α(HIF-1α)的蛋白表達。結(jié)果：HPC可減輕 OGD 引起的SH-SY5Y細胞凋亡，降低LDH 漏出量，明顯增加 OGD 組SH-SY5Y細胞的活力(P<0.05)。Western blot 顯示HPC+OGD 組Caspase 3蛋白的表達明顯低于OGD 組(P<0.05)；HIF-1α蛋白的表達明顯高于 OGD 組(P<0.05)。結(jié)論：HPC對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞OGD 損傷具有保護作用，其機制可能與上調(diào)HIF-1α蛋白有關。

低氧預適應；人神經(jīng)母細胞瘤細胞；氧糖剝奪；HIF-1α

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.008

低氧預適應 (hypoxic preconditioning，HPC) 即預先短時間非致死性重復性暴露于低氧，可使機體的組織細胞獲得在特殊時間窗對隨后更嚴重甚至致死性缺氧損傷的高度耐受性，是機體一種內(nèi)源性保護機制，有可能為缺氧的防治提供一種有別于傳統(tǒng)吸氧療法的新策略。已有動物實驗從生化、生理等多個側(cè)面證明HPC通過增加腦內(nèi)糖原、減少能量消耗及抗凋亡、激活自噬等途徑減輕缺氧缺血性腦損傷[1-3]。目前，腦低氧預適應的機制尚不十分清楚，許多研究表明其與低氧誘導因子-1α( hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 有密切關系[4,5]。HIF-1 普遍存在于人和哺乳動物細胞內(nèi)，是目前發(fā)現(xiàn)的一種能感受細胞氧分壓的調(diào)控蛋白。21% O2的常氧下，HIF-1表達后即被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解；只有在低氧條件下α和β亞基形成有活性的HIF-1，轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的HIF-1直接作用的靶基因有100多個，涉及多種功能[7]。實驗表明HIF-1 調(diào)節(jié)了神經(jīng)細胞的損傷過程[8]。但低氧預適應是否可以減輕氧糖剝奪對人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的損傷，HIF-1α扮演什么角色，檢索國內(nèi)外文獻罕見相關報道。

本實驗采用SH-SY5Y細胞,應用體外氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)建立神經(jīng)細胞缺氧缺血損傷模型, 模擬體內(nèi)腦缺血過程, 對進一步探討HPC對缺血缺氧過程中神經(jīng)元的保護機制, 為探索腦缺血缺氧新的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞株由上海中科院典型細胞培養(yǎng)庫提供；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Hyclone公司；乳酸鹽脫氫酶( lactate dehydrogenase，LDH) 檢測試劑盒和MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗HIF-1α多克隆抗體均購自美國ImmunoWay公司；兔抗Caspase 3(激活型)單克隆抗體購自Abgent公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購自Laboratories公司。Thermo Scientific 三氣培養(yǎng)箱、OLYMPUS IX71熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)及分組 細胞置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco' s modified eagle medium，DMEM)中，在37℃、含體積分數(shù)為5% CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換培養(yǎng)液，當單層細胞融合后，行傳代處理。傳代后隨機分為4組：對照組(Control)常規(guī)培養(yǎng)，不進行OGD處理；低氧預適應模型組(HPC)；氧糖剝奪組(OGD)和低氧預適應后氧糖剝奪組(HPC+OGD)，細胞HPC處理后進行OGD處理。每次每組設6 個平行復孔，實驗重復3次。

1.2.2 SH-SY5Y細胞低氧預適應的方法 將SH-SY5Y細胞移至37℃恒溫密閉低氧培養(yǎng)箱內(nèi)(2%O2，5%CO2)，30 min后立即取出，再恢復常氧培養(yǎng)，重復5次，建立細胞低氧預適應模型。

1.2.3 SH-SY5Y細胞OGD模型的建立 選用生長良好的SH-SY5Y細胞，置換成無糖培養(yǎng)基孵育，放入37℃低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h(1% O2，5% CO2)，然后復氧復糖培養(yǎng)24 h。

1.2.4 形態(tài)學觀察 SH-SY5Y細胞分別進行不同處理后，置于Olympus CKX41倒置相差顯微鏡上觀察各組細胞形態(tài)特征，隨機選擇視野拍照。

1.2.5 MTT比色法檢測細胞存活率 將細胞以5×104cells/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，100 μl/well，24 h后處理細胞。作用完畢后加入MTT(5.0 g/L)10 μl/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h后，每孔再加入100 μl Formanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育4 h。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm測定各孔光密度值(optical density，OD)，評價細胞存活率。SH-SY5Y存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。本實驗對照組的細胞存活率定為100.00%。

1.2.6 乳酸脫氫酶漏出率檢測 根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中，細胞密度約70%～80%。處理完畢后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 r/min離心5 min。盡量吸除上清，加入150 μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑)，適當搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。隨后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400 r/min離心5 min，取上清100 μl，加入新的96孔板相應孔中，各孔再加入50 μl LDH檢測工作液?；靹?，室溫(約25℃) 避光孵育30 min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490 nm處測定吸光度。選用600 nm作為參考波長進行雙波長測定。LDH (U/L) =(ΔA樣品-ΔA空白)×F。F=反應總體積×1 000/樣品體積×消光系數(shù)[9]。

1.2.7 SH-SY5Y細胞凋亡的檢測 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，以2×105cells/ml的細胞密度、每孔細胞懸液500 μl接種于24孔板內(nèi)的載玻片上。培養(yǎng)24 h后，分組處理細胞；棄培養(yǎng)液、PBS洗滌1次、4%多聚甲醛固定1 h、0.1% Triton X-100冰浴孵育5 min、在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在100倍鏡下，隨機取5個視野，計數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細胞，取平均值，計算細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/視野下細胞總數(shù)。重復3次。

1.2.8 Caspase 3、HIF-1α的蛋白水平的檢測 收獲細胞，4℃PBS清洗1次，加入60 μl細胞裂解液，用細胞刮刮下細胞，低溫離心機12 000 ×g 、4℃離心10 min，取上清，棄沉淀。用BCA法測定各組蛋白含量、配平，每孔上樣25 μl，經(jīng)15%SDS-PAGE 70V電泳2 h后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，5% 脫脂牛奶常溫下封閉1 h后，在 4℃ 孵育 I 抗過夜(兔抗大鼠HIF-1α滴度為1∶1 000、兔抗大鼠Caspase 3(激活型)抗體滴度為1∶1 000、小鼠抗大鼠β-actin滴度均為1∶3 000)；5%脫脂牛奶常溫下封閉 II 抗(羊抗兔辣根過氧化物酶IgG和羊抗小鼠辣根過氧化物酶IgG滴度均為1∶5 000，5% 脫脂牛奶配制)，ECL 顯影顯示目的條帶和內(nèi)參。用Image J軟件分析光密度值，分析蛋白表達的相對水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同處理組SH-SY5Y細胞形態(tài)學觀察

倒置相差光學顯微鏡下觀察SH-SY5Y細胞形態(tài)的變化，正常SH-SY5Y 細胞大部分呈梭形、三角形，少數(shù)呈多邊形，胞漿飽滿、內(nèi)有大量顆粒，多數(shù)可見細胞突起，折光性好，伸展性良，貼壁能力強；OGD處理后，細胞貼壁數(shù)量明顯減少，細胞形態(tài)不規(guī)則，體積明顯皺縮[10]，突起減少或消失，折光性減弱，伸展性差，脫壁的細胞增加；HPC+OGD組細胞的缺氧缺糖損傷明顯減輕。提示HPC對OGD引起的細胞損傷有保護作用(圖1)。

Fig. 1 Effect of HPC and OGD on the morphology of SH-SY5Y cells(×100)

A: Control; B: HPC; C: OGD; D: HPC+OGD; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

2.2 不同處理因素對SH-SY5Y細胞存活率的影響

MTT法檢測結(jié)果以對照組細胞存活率為100.0%，則HPC、OGD、HPC+OGD組存活率分別為97.3%、63.9%、77.6%。OGD、HPC+OGD組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OGD組與HPC+OGD組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 不同處理因素對 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)上清液中LDH 漏出量的影響

LDH釋放是細胞膜完整性的重要指標，因此LDH漏出量與細胞損傷程度成正比，廣泛用于實驗研究。LDH活性檢測結(jié)果顯示OGD組、HPC+OGD組培養(yǎng)上清液中LDH漏出量明顯高于正常對照組(P<0.05)；HPC+OGD組LDH漏出量明顯低于OGD組(P<0.05，表1)。

GroupSurvivalrate(%)LDH(U/L) Control100．0±0．069．5±6．6HPC97．3±2．570．5±6．4OGD63．9±2．1?207．7±6．3?HPC+OGD77．6±1．9?#185．9±6．0?#

HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation; LDH: Lactatede hydrogenase

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOGD group

2.4 TUNEL法熒光染色檢測細胞凋亡率

TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，OGD組、HPC+OGD組凋亡率明顯增加(P<0.05), HPC+OGD組明顯低于OGD組(P<0.05，圖2，表2)。

Fig. 2 TUNEL staining in each group of SH-SY5Y cells(×200)

A： Control； B： HPC； C： OGD； D： HPC+OGD; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

GroupApoptoticrate(%) Control4．3±0．8HPC4．9±0．9OGD29．2±2．1?HPC+OGD17．6±1．9?#

HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOGD group

2.5 Caspase 3、HIF-1α蛋白表達的變化

蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，HPC+OGD組、OGD組cleaved Caspase 3蛋白表達量均增加(P<0.05)；且HPC+OGD組明顯低于OGD組(P<0.05)。HPC+OGD組HIF-1α蛋白表達明顯高于OGD組(P<0.05，圖3，表3)。

Fig. 3 Protein expression of cleaved-Caspase-3、HIF-1α in SH-SY5Y cells

HIF-1α： Hypoxia inducible factor-1α

GroupCleaved?Caspase3/β?actinHIF?1α/β?actinControl1．2±0．30．23±0．02HPC0．9±0．21．90±0．08OGD1．7±0．1?0．36±0．01?HPC+OGD2．6±0．3?#0．64±0．02?#

HIF-1α： Hypoxia inducible factor-1α; HPC: Hypoxic preconditioning; OGD: Oxygen-glucose deprivation

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD group

3 討論

由于供氧不足或用氧障礙造成組織和細胞的代謝、功能、甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程稱之缺氧，其在臨床各種疾病中極常見，腦缺血缺氧是導致機體死亡的重要原因[11]。人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)來自于神經(jīng)發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴，表現(xiàn)出與神經(jīng)元相似的生化、藥理和功能方面的特性。它提供了一個可以用來研究神經(jīng)元功能、分化及死亡的良好體外模型[12]。

HPC指適度的低氧可觸發(fā)機體的內(nèi)源性保護機制，使機體對后繼發(fā)生的嚴重缺氧或其他致死性應激產(chǎn)生防御和抵抗作用；涉及腺苷、細胞自噬、 HIF-1α、 VEGF等的變化[13]。HIF-1可激活多種靶基因的表達，如胰島素樣生長因子Ⅱ編碼基因、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)編碼基因、內(nèi)皮素-1(ET-1)、血小板源性生長因子(PDGF)等。這些基因表達后參與細胞壞死、凋亡、自噬、能量代謝等生物學效應，以維持組織、細胞在缺氧條件下內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應缺氧，從而發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用[14]。肖正霞[15]等研究發(fā)現(xiàn)HPC可促進RIRI大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、HO-1蛋白的表達，減輕視網(wǎng)膜損傷，具有視網(wǎng)膜保護作用。徐夏蓮[16]等發(fā)現(xiàn)HPC上調(diào)HIF-1α表達顯著改善缺血/再灌注對腎臟的損傷。那么在OGD損傷離體培養(yǎng)的神經(jīng)元中是否有相似的保護作用呢?本實驗以SH-SY5Y細胞為對象，通過HPC干預OGD損傷的細胞模型，觀察HPC的保護作用及可能機制。

本研究結(jié)果提示HPC明顯增加OGD導致的SH-SY5Y細胞存活率、降低LDH漏出量、明顯降低OGD導致的SH-SY5Y細胞凋亡率，具有保護作用，與前人實驗結(jié)果得到HPC對腦缺氧缺血具有保護作用基本相符[17，18]。我們進一步通過Western blot對凋亡相關蛋白Caspase 3及，HIF-1α的表達進行檢測, 發(fā)現(xiàn)HPC+OGD組、OGD組的激活型Caspase3蛋白量均增加；且HPC+OGD組明顯低于OGD組，提示HPC可減輕OGD誘導的細胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示對照組HIF-1α微量表達，而HPC組、OGD組、HPC+OGD組HIF-1α 表達均增強；HPC+OGD組顯著高于OGD組；HPC組表達最強。提示OGD本身可以促進HIF-1α 蛋白的表達，而HPC明顯上調(diào)HIF-1α蛋白的表達。在神經(jīng)細胞損傷過程中，對HIF-1α的作用頗有爭議，現(xiàn)認為HIF-1α可能具有雙向適應性調(diào)節(jié)功能：HIF-1α 輕度或中度誘導表達可促進細胞適應損傷，而過量表達則導致細胞死亡[19，20]。氧是機體能量代謝和穩(wěn)態(tài)平衡的關鍵物質(zhì)，低氧微環(huán)境下機體呈現(xiàn)強烈的應激及應急反應，并通過氧感受器和信號轉(zhuǎn)導通路特異地在mRNA、蛋白、核定位、轉(zhuǎn)錄激活及二聚化等不同層次來提高耐低氧能力[13]。通過離體細胞實驗，我們推測HPC促進SH-SY5Y細胞中HIF-1α蛋白的表達，可以減輕OGD對細胞的損傷，延緩細胞凋亡過程的發(fā)生，明顯增強細胞耐受性，對細胞的存活起一定的保護作用。

綜上所述，可以認為HIF-1可是低氧效應的主要執(zhí)行者，可能在細胞、組織和器官的低氧損傷和適應過程中有關鍵的調(diào)控作用。研究低氧預適應如何啟動和調(diào)控HIF-1α的激活、HIF-1α蛋白與其它相關蛋白間的相互作用、以及低氧信號轉(zhuǎn)錄的精確過程或許能夠為應對神經(jīng)元損傷提供新策略，為腦缺血的防治開辟新的途徑，既有理論意義，又有潛在的臨床應用前景。

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Protective effect of hypoxic preconditioning on SH-SY5Y cells injured by oxygen-glucose deprivation

LU Na1△， BAI Rui-ying1， HUANG He2， LI Cheng-zhang1， LI Chao-kun1

(1. Department of Physiology and Neurobiology， Xinxiang Medical University，2. Henan Xinxiang Central Hospital Respiratory Medicine， Xinxiang 453003， China)

Objective: To investigate the protection effects of hypoxic preconditioning(HPC) on the SH-SY5Y cell injured by oxygen-glucose deprivation(OGD)，and to discuss the possible mechanism. Methods: SH-SY5Y cells were randomly divided into 4 groups． In normal group，the cells were cultured without OGD treatment． In HPC group，the cultured SH-SY5Y cells were treated for 5 days by intermittently exposing to hypoxic gas mixture (2% O2，5% CO2)for 30 min in every day． In OGD group，the culture medium was replaced by glucose-free medium and the cells were transferred to a humidified incubation chamber flushed by a gas mixture of 1% O2and 5% CO2for 10 h. After that，the cells were fed with glucose-supplemented medium and cultured under normoxic condition for 24 h. In HPC + OGD group，the cultured SH-SY5Y cells were treated for 5 days by intermittently exposing to hypoxic gas mixture for 30 min in each day, then the cells were given the same treatments as those in OGD group. The cell viability was assessed by MTT assay． The degree of the cell damage was evaluated by determining lactate dehydrogenase ( LDH) leakage． TUNEL staining were used to detect the variation of cell apoptosis. The expression of Caspase 3 and hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) at protein levels was examined by Western blot． Results: Hypoxic preconditioning relieved the cells apoptosis，decreased the amount of LDH leakage and improved the viability of SH-SY5Y cells injured by OGD (P<0.05)． Western blot showed that the expression of Caspase 3 protein in HPC +OGD group was significantly lower than that in OGD group (P<0.05); HIF-1α protein expression was significantly higher than that of OGD group (P<0.05). Conclusion: Hypoxic preconditioning has protective effect oninvitrocultured SH-SY5Y cells injured by OGD. The mechanism may be related to the increase of HIF-1a protein.

hypoxic preconditioning; SH-SY5Y cells; oxygen-glucose deprivation; HIF-1α

河南省教育廳科學技術(shù)重點研究項目(14A310009)

2015-10-25

2016-03-01

R363.21

A

1000-6834(2016)04-319-05

△【通訊作者】Tel: 13462225817； E-mail: 13462225817@163.com