萬(wàn)古霉素手性膜拆分D，L?苯甘氨酸及手性拆分機(jī)理

以萬(wàn)古霉素和1，6?己二異腈酸酯為單體，通過界面聚合法在聚砜基膜上制備了萬(wàn)古霉素手性高分子膜.利用紅外光譜及掃描電子顯微鏡對(duì)該膜進(jìn)行了表征.將其用于青霉素及頭孢菌素類藥物的重要中間體苯甘氨酸的手性拆分，通過優(yōu)化單體摩爾比、界面聚合時(shí)間及外消旋體溶液濃度等分離參數(shù)，可達(dá)到超過70% 的D?苯甘氨酸對(duì)映體過剩值的手性分離.通過比較研究手性膜吸附、固相萃取、膜色譜、膜滲析和膜超濾過程，發(fā)現(xiàn)手性膜上優(yōu)先吸附的對(duì)映體L?苯甘氨酸并不是各種模式下優(yōu)先透過的對(duì)映體，結(jié)合外消旋體的締合特性，提出了“吸附?締合?擴(kuò)散”的手性膜分離機(jī)理.

萬(wàn)古霉素；D，L?苯甘氨酸；手性膜；分離機(jī)理

在約2000種常規(guī)藥物中，還有近500種是以外消旋體混合物的形式存在.這些外消旋體藥物通常一種對(duì)映體有藥效，或者具有相反的藥效，甚至具有毒副作用.將這些外消旋體藥物拆分或者轉(zhuǎn)化成為單一的手性藥物，是目前藥物研究的前沿課題之一.此外，手性分離在生命、化學(xué)、農(nóng)業(yè)及材料等領(lǐng)域也具有非常廣泛的用途［1～4］.

在眾多的手性分離方法中，膜的手性分離具有節(jié)能、環(huán)保、成本低以及容易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn).但自1986年第一篇有關(guān)手性固膜的研究被報(bào)道以來［5］，至今仍無(wú)商品化的手性膜出售，其工業(yè)化應(yīng)用也尚未實(shí)現(xiàn)［6］.近年來，關(guān)于手性膜不斷有新的研究報(bào)道出現(xiàn)［7～16］，在新材料方面主要包括手性金屬?有機(jī)骨架材料和手性籠等，在膜制備方法上也出現(xiàn)了手性無(wú)機(jī)膜和無(wú)機(jī)有機(jī)混合膜等［17～23］.

大環(huán)抗菌素是優(yōu)良的手性識(shí)別材料，已被用于手性識(shí)別的多個(gè)領(lǐng)域［6］.青霉素及頭孢菌素類是非常重要的抗菌類藥物，D?苯甘氨酸是生產(chǎn)氨芐西林、依匹西林、匹氨西林、頭孢氨芐、頭孢拉定和頭孢克洛等必不可少的原料.但苯甘氨酸是非天然氨基酸，一般通過合成得到其外消旋體，然后經(jīng)過手性拆分獲得D?苯甘氨酸.本文將萬(wàn)古霉素制備成手性復(fù)合膜用于苯甘氨酸的手性拆分，得到了良好的D?苯甘氨酸的分離效果.迄今，尚未見將大環(huán)抗菌素手性選擇劑用作手性膜或用手性膜拆分苯甘氨酸的報(bào)道.意外的是，在該手性拆分過程中，我們觀察到在手性膜上優(yōu)先吸附的L?苯甘氨酸對(duì)映體并不是各種膜分離模式下優(yōu)先透過的對(duì)映體D?苯甘氨酸，并結(jié)合苯甘氨酸外消旋體的締合特性，提出了“吸附?締合?擴(kuò)散”的手性膜拆分機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

D，L?苯甘氨酸（比利時(shí)Acros公司）；1，6?己二異腈酸酯［Alfa Aesar（中國(guó)）化學(xué)有限公司］；萬(wàn)古霉素（蘇州法姆醫(yī)藥科技有限公司）；聚砜超濾膜（貴陽(yáng)時(shí)代沃頓科技有限公司）；其余試劑均為分析純；原料液由純水配制.

高效液相色譜儀（HPLC，配有Waters 515恒流泵和Waters 2489紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；

N2000型色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）；CROWNPAK CR（－）手性色譜柱（150 mm× 4.6 mm i.d.，日本Daicel公司）；膜滲析裝置（自制，有效膜面積3.3 cm2）；BRUKER TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀（德國(guó)Bruker公司）；S?3000N型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；Bruker Smart CCD X射線單晶衍射儀（德國(guó)Bruker公司）

1.2 萬(wàn)古霉素膜的制備

將聚砜膜用純水浸泡24 h后，置于萬(wàn)古霉素溶液中浸泡24 h，取出聚砜膜瀝干，然后于20℃下與異腈酸酯的正庚烷溶液進(jìn)行界面聚合30 s，聚合時(shí)加入催化劑三乙胺.聚合反應(yīng)完畢，用正庚烷洗滌膜上剩余的單體原料，再于100℃加熱20 min，最后用純水洗凈萬(wàn)古霉素復(fù)合膜，放入4℃的純水中保存?zhèn)溆?

1.3 苯甘氨酸的滲析實(shí)驗(yàn)

將制備的復(fù)合膜固定在自制的膜滲析裝置中，該裝置以濃度差為驅(qū)動(dòng)力.膜正面一側(cè)為10 mL 0.1 mg／mL的D，L?苯甘氨酸溶液，另一側(cè)為10mL純水.滲析實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，滲析一定時(shí)間后，取出純水一側(cè)的溶液，用HPLC檢測(cè)透過情況.所有膜均只使用1次.

1.4 色譜分析

采用高效液相色譜和CROWNPAK CR（－）手性色譜柱測(cè)定D，L?苯甘氨酸原料液和透過相中的D?和L?對(duì)映體的含量.色譜條件：流動(dòng)相為pH＝1的HClO4溶液，流速0.4mL／min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，每次進(jìn)樣量為20μL.

D，L?苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值［e．e．（%）］根據(jù)下式計(jì)算：

式中：Ar和As分別為透過液中D?和L?對(duì)映體的峰面積.

2 結(jié)果與討論

2.1 萬(wàn)古霉素的紅外光譜測(cè)定

圖1為萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素手性膜的FTIR光譜圖.

Fig.1 FTIR spectra of vancom ycin（a）and vancomycin membrane（b）

由圖1譜線b可以看出，其在3337.48 cm－1處的吸收峰減弱，在2942.97，2856.07和1690.99 cm－1處的吸收峰增強(qiáng)，說明萬(wàn)古霉素中的—NHY基團(tuán)主要與1，6?己二異腈酸酯中的基團(tuán)發(fā)生了反應(yīng)，反應(yīng)方程式如下：

2.2 膜的SEM分析

圖2為聚砜基膜與萬(wàn)古霉素復(fù)合膜的SEM照片，可見復(fù)合膜表面平整光滑，但從膜的截面照片可見，其表面附著了一層薄膜，表明高分子聚合物已聚合在聚砜基膜表面上.

Fig.2 SEM images of top surface（A，C）and cross?section（B，D）of polysulfonemembrane（A，B）and enantioselective compositemembrane（C，D）

2.3 1，6?己二異腈酸酯與萬(wàn)古霉素的摩爾比對(duì)手性分離性能的影響

以不同的單體摩爾比制備的萬(wàn)古霉素復(fù)合膜對(duì)苯甘氨酸的手性分離性能不同.由圖3可見，當(dāng)1，6?己二異腈酸酯與萬(wàn)古霉素的摩爾比從0.93增加到6.3時(shí)，苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值先增大然后減小，二者摩爾比為2.2時(shí)達(dá)最大值.這是因?yàn)椴煌膯误w比例將會(huì)影響復(fù)合膜皮層的化學(xué)結(jié)構(gòu).另外，通過手性高效液相色譜分析得知，在整個(gè)分離過程中，D?苯甘氨酸總是優(yōu)先透過.

Fig.3 Enantiomeric excess［e．e．（%）］at different molar ratios of 1，6?diisocyanatohexane to vancomycin

Fig.4 Enantiomeric excess［e．e．（%）］at different time of interfacial polymerization

2.4 界面聚合時(shí)間對(duì)手性分離性能的影響

膜的界面聚合時(shí)間也將直接影響復(fù)合膜的表面皮層結(jié)構(gòu).圖4示出了界面聚合時(shí)間對(duì)手性分離性能的影響，可見，苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值隨界面聚合時(shí)間的變化次序?yàn)?0 s＞40 s＞50 s＞20 s.當(dāng)聚合時(shí)間為30 s時(shí)，可以得到超過70%的苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值.小于或者大于該界面聚合時(shí)間，都將直接影響其手性分離效果.

2.5 苯甘氨酸濃度對(duì)膜分離性能的影響

圖5示出了苯甘氨酸濃度對(duì)萬(wàn)古霉素復(fù)合膜手性分離性能的影響.由圖5可見，當(dāng)外消旋體濃度從0.1 mg／mL增加到0.4 mg／mL時(shí)，膜的手性選擇性明顯降低.這是因?yàn)楫?dāng)外消旋體的濃度較高時(shí)，

越來越多的手性活性位點(diǎn)將被另一個(gè)對(duì)映體掩蓋，同時(shí)一個(gè)對(duì)映體也將影響另一個(gè)對(duì)映體的選擇性擴(kuò)散.

Fig.5 Enantiom eric excess［e．e．（%）］at different feed concentrations

Fig.6 Membrane chrom atogram of D，L?phenylglycine

2.6 萬(wàn)古霉素復(fù)合膜的手性分離機(jī)理

為了研究萬(wàn)古霉素復(fù)合膜的手性分離機(jī)理，將完成苯甘氨酸外消旋體滲析后的膜取出瀝干，用純水沖洗該復(fù)合膜的正表面，沖洗液濃縮后用手性高效液相色譜測(cè)定.結(jié)果表明，該膜表面優(yōu)先吸附L?苯甘氨酸，且L?苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值為53%.由于優(yōu)先吸附的對(duì)映體不是優(yōu)先滲析過去的對(duì)映體D?苯甘氨酸，該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象引起了我們的興趣.我們按照萬(wàn)古霉素膜的制備方法，將該膜界面聚合于直徑為5μm的色譜硅膠表面，然后用于苯甘氨酸外消旋體溶液的固相萃取.手性分析結(jié)果表明，仍然是L?苯甘氨酸被優(yōu)先吸附，且L?苯甘氨酸的對(duì)映體過剩值為29%.為了證明在該界面聚合條件下，能夠生成萬(wàn)古霉素?異腈酸酯復(fù)合膜，分別對(duì)聚合反應(yīng)前后的硅膠進(jìn)行了元素分析，分析結(jié)果為硅膠中N，C和H含量分別為＜0.1%，＜0.1%和0.44%，萬(wàn)古霉素?異腈酸酯固相萃取劑中N，C和H含量分別為3.00%，18.73%和2.90%，證實(shí)了萬(wàn)古霉素?異腈酸酯復(fù)合膜的生成.

將該萬(wàn)古霉素復(fù)合膜固定在自制的膜色譜裝置上（有效膜面積為3.3 cm2），取代高效液相色譜中的手性分離柱，以純水為流動(dòng)相，設(shè)定流速為0.2 mL／min，溫度控制在25℃，對(duì)苯甘氨酸的外消旋體進(jìn)行拆分，圖6示出了該膜色譜對(duì)苯甘氨酸的手性分離結(jié)果.在該膜色譜中，D?苯甘氨酸優(yōu)先流出色譜膜，而L?苯甘氨酸后流出.實(shí)驗(yàn)中還利用0.5 MPa的壓力為推動(dòng)力［11，12］，在超濾模式下進(jìn)行了該萬(wàn)古霉素膜對(duì)苯甘氨酸的手性拆分.結(jié)果表明，在0.1 mg／mL的D，L?苯甘氨酸原料液濃度下，優(yōu)先透過的仍是D?苯甘氨酸，且其對(duì)映體過剩值為23%.

Fig.7 Single crystal structure of D，L?phenylglycine

由上面的實(shí)驗(yàn)可知，不管是以聚砜或者是以硅膠為支撐體，制得的萬(wàn)古霉素膜優(yōu)先吸附的均為L(zhǎng)?苯甘氨酸；但是不管是膜色譜、膜滲析或者膜超濾，為什么優(yōu)先透過的是D?苯甘氨酸呢？眾所周知，外消旋體在晶體狀態(tài)下可產(chǎn)生3種情況：一種是外消旋混合物，另一種是外消旋化合物，第三種是外消旋固體溶液.前者是2個(gè)純對(duì)映體晶體的物理狀混合物，約占整個(gè)外消旋體的8%；第二種是2種對(duì)映異構(gòu)體等量和有序地排列在同一晶體中；第三種是第二種的一種特殊情況，2種對(duì)映異構(gòu)體以非等量無(wú)序地存在于晶體中.我們將苯甘氨酸外消旋體以水為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，對(duì)所得單晶進(jìn)行單晶X射線衍射分析，其晶胞結(jié)構(gòu)如圖7所示.由圖7可見，在D，L?苯甘氨酸的晶胞結(jié)構(gòu)中，D?苯甘氨酸和L?苯甘氨酸存在1∶1的嚴(yán)格比例，并且D?苯甘氨酸和L?苯甘氨酸之間有規(guī)律的相間排列.

萬(wàn)古霉素分子結(jié)構(gòu)中有7個(gè)肽和5個(gè)芳環(huán)構(gòu)成了三環(huán)糖肽.萬(wàn)古霉素包含19個(gè)立體中心、9個(gè)羥基、2個(gè)氨基、7個(gè)酰胺基團(tuán)和2個(gè)氯原子.整個(gè)分子呈現(xiàn)出一個(gè)“半固定籃”結(jié)構(gòu)，其在手性識(shí)別中起到重要作用.因此，在萬(wàn)古霉素手性高分子膜的拆

分機(jī)理中，該膜表面對(duì)L?苯甘氨酸具有較強(qiáng)的選擇性吸附作用，在萬(wàn)古霉素膜的表面首先形成了一層較穩(wěn)定的L?苯甘氨酸吸附層；然后，由于苯甘氨酸傾向于形成外消旋化合物的固有特性，使D?苯甘氨酸選擇性地締合在L?苯甘氨酸吸附層的表面；而由于D?苯甘氨酸締合層與L?苯甘氨酸吸附層作用力較弱，且存在濃度梯度的原因，致使D?苯甘氨酸優(yōu)先透過了萬(wàn)古霉素復(fù)合膜.該手性膜分離可能的機(jī)理可以簡(jiǎn)述為“吸附?締合?擴(kuò)散”機(jī)理，如Scheme 1所示.

Scheme 1 Chiral separation mechanism of the“adsorption?association?diffusion”in optical resolution ofmembrane

3 結(jié) 論

所制備的萬(wàn)古霉素手性復(fù)合膜可用于苯甘氨酸外消旋體的拆分，手性選擇性可受界面聚合單體摩爾比、聚合反應(yīng)時(shí)間以及原料液濃度等的影響.在制膜過程中，當(dāng)選擇1，6?己二異腈酸酯與萬(wàn)古霉素的摩爾比為2.2，界面聚合反應(yīng)時(shí)間為30 s，滲析過程中對(duì)羥基苯甘氨酸外消旋體原料液的濃度為0.1 mg／mL時(shí)，可以獲得超過70%的對(duì)映體過剩值.該手性拆分過程的機(jī)理可簡(jiǎn)述為“吸附?締合?擴(kuò)散”原理.

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袁黎明，蘇瑩秋，段愛紅，鄭 瑩，艾 萍，諶學(xué)先

（云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，昆明650500）

Optical Resolution of D，L?Phenylglycine and Chiral Separation Mechanism Using an Enantioselective Membrane of Vancom ycin?

YUAN Liming?，SU Yingqiu，DUAN Aihong，ZHENG Ying，AIPing，CHEN Xuexian
（Faculty ofChemisty and Chemical Engineering，Yunnan Normal University，Kunming 650500，China）

Using vancomycin and 1，6?diisocyanatohexane as the monomers，an enantioselective composite membrane was prepared by interfacial polymerization on a polysulfone support and was analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy and scanning electronmicroscopy.The compositemembranewas used for enan?tioseparation of D，L?phenylglycine which is an indispensable reagent in the syntheses of penicillins and cepha?losporins.By optimizing themolar ratio of vancomycin and 1，6?diisocyanatohexane，the time of polymerization and the feed concentration of the racemate，an enantiomeric excess［e．e．（%）］of over 70%D?phenylglycine could be obtained.Comparing themembrane adsorption，solid extraction，membrane chromatography，dialysis and ultrafiltration of vancomycin optical resolutionmembrane，the L?phenylglycinewas prior adsorbed，while，the D?phenylglycine was first permeated themembrane.Based on the association characteristic of racemate of D，L?phenylglycine，we suggested，in the first time，that the enantioseparation mechanism ofmembrane was “adsorption?association?diffusion”.

Vancomycin；D，L?Phenylglycine；Optical resolution membrane；Enantioseparation mechanism

O652.6

A

10.7503／cjcu20160460

（Ed.：N，K）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21365025，21265026，21165022）.

2016?06?30；

日期：2016?10?19.

國(guó)家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：21365025，21265026，21165022）資助.

聯(lián)系人簡(jiǎn)介：袁黎明，男，博士，教授，主要從事手性分離方面的研究.E?mail：yuan_limingpd@126.com