李連坤　張蕾　王甜甜　王雪　張?chǎng)┠取〔虖V知　貢濟(jì)宇

[摘要] 目的 建立阿尼西坦緩釋片體內(nèi)代謝產(chǎn)物N-對(duì)甲氧基苯甲酰氨基丁酸（ABA）含量的測(cè)定方法。 方法 采用反相高效液相色譜法（HPLC法）測(cè)定ABA含量，Phenomenex ΜP-ODS C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈∶0.1%醋酸=25∶75，檢測(cè)波長：250 nm，柱溫：35 ℃。 結(jié)果 以氯仿∶甲醇為2∶8，渦旋振蕩30 s，離心10 min，于40℃下氮?dú)獯蹈商幚硌獦印Ｔ?7.5～2150 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為86.67%～93.58%，均在85%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：阿尼西坦緩釋片的AΜC0-t為（342.13±110.23）μg/（min·ml），Cmax為（7.41±2.05）μg/ml，Tmax為（116.53±1.17）h；阿尼西坦普通片的AΜC0-t為（434.53±102.69）μg/（min·ml），Cmax為（7.46±1.87）μg/ml，Tmax為（28.29±1.11）h。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法，可以準(zhǔn)確測(cè)定阿尼西坦體內(nèi)代謝產(chǎn)物ABA的含量，適用于阿尼西坦緩釋片在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 阿尼西坦；N-對(duì)甲氧基苯甲酰氨基丁酸；反相高效液相色譜法；血藥濃度；藥代動(dòng)力學(xué)

[中圖分類號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）02（c）-0008-04

[Abstract] Objective To establish the determination method of N-anisoyl-GABA （ABA） content of metabolites in vivo for aniracetam sustained release tablet. Methods The content of ABA was determined by reversed-phase high performance liquid chromatography （RP-HPLC method）.Phenomenex ΜP-ODS C18 chromatographic column （250×4.6 mm，5 μm） was used and the mobile phase was set as acetonitrile∶0.1% acetic acid =25∶75，detection wavelength was set at 250 nm，and column temperature was 35℃. Results The blood sample were blow-dried by nitrogen at 40℃ （chloroform∶methyl alcohol=2∶8，vortex oscillation for 30 s and centrifugation for 10 min）.The result showed favorable linear relation in range of 67.5～2150 μg/L.The recovery rate was 86.67%-93.58%，meeting the experiment requirements of above 85%.The main pharmacokinetic parameters was as follows：the aniracetam sustained release tablet，AΜC0-t=（342.13±110.23） μg/（min·ml），Cmax=（7.41±2.05） μg/ml，and Tmax=（116.53±1.17） h；the aniracetam conventional tablet，AΜC0-t=（434.53±102.69） μg/（min·ml），Cmax=（7.46±1.87） μg/ml，and Tmax=（28.29±1.11） h. Conclusion HPLC method established in this study can accurately determine the ABA content of metabolites in vivo for aniracetam，which is applicable to pharmacokinetic study of aniracetam sustained release tablet in rabbits in vivo.

[Key words] Aniracetam；N-anisoyl-GABA；Reversed-phase high performance liquid chromatography；Blood concentration；Pharmacokinetics

阿尼西坦是1-（4-甲氧基苯甲?；?-吡咯烷酮，可用于神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)記憶。有研究證明，阿尼西坦可改善中老年人記憶力，降低阿爾茨海默病的發(fā)病率，因此備受臨床關(guān)注[1]。阿尼西坦口服吸收后，血中達(dá)峰時(shí)間為20～40 min，生物半衰期為22 min，4 h后血藥濃度已很難測(cè)出，其代謝產(chǎn)物以N-對(duì)甲氧基苯甲酰氨基丁酸（ABA）為主（約占70%），故采用反相HPLC法[2]，測(cè)定血液中ABA的濃度。本文旨在建立血漿中ABA血藥濃度的反相HPLC法，并應(yīng)用于家兔的阿尼西坦緩釋片的藥動(dòng)學(xué)研究，為阿尼西坦緩釋片的臨床研究及開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器，美國安捷倫公司）；AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒一托利多公司）； DCY-12S型氮吹儀（青島?？苾x器有限責(zé)任公司）；XH-C渦旋振蕩器（金壇市精達(dá)儀器制造有限公司）；TGL-16B高速離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

阿尼西坦緩釋片、ABA對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制[3]、阿尼西坦片（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；批號(hào)：20130517；規(guī)格：100 mg/片）；氫氯噻嗪對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所；批號(hào)：100309-201103；含量：99.4%）；甲醇、乙腈、氯仿均為江蘇漢邦公司色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純[4]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康家兔20只，雌雄兼用，體重為（2.0±0.2）kg，由遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物資源中心提供[5]，許可證號(hào)：SCXK（遼）2014-0002。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ΜP-ODSC18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%醋酸=25∶75（v/v）；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl[6]；柱溫：35℃；檢測(cè)波長250 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 ABA儲(chǔ)備溶液的配制 精密稱取ABA對(duì)照品10 mg，置于50 ml容量瓶中，用乙腈定容，得到濃度為200 μg/ml的ABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為儲(chǔ)備液[7]。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)液的配制 精密稱取氫氯噻嗪對(duì)照品約2 mg于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到濃度為200 μg/ml的氫氯噻嗪儲(chǔ)備液[8]，用乙腈稀釋，最后配得濃度為20 μg/ml的氫氯噻嗪溶液，作為內(nèi)標(biāo)液，置于4℃冰箱保存，備用。

2.2.3 空白血漿的制備 于家兔耳緣靜脈采血1 ml，置于含0.1 ml肝素鈉的離心管中，4000 r/min，離心10 min，將血漿取出，于-20℃冷凍層保存待測(cè)[9]。

2.3 血漿樣品的處理方法

取200 μl的空白血漿于1.5 ml的EP管中，依次加入200 μl的氫氯噻嗪內(nèi)標(biāo)液（20 μg/ml）以及200 μl ABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋30 s后，再依次加入 200 μl氯仿[10]，800 μl甲醇后，渦旋振蕩2 min，13 000 r/min，離心20 min，吸取1.0 ml的上清液于另一干凈EP管中，40℃氮?dú)鈨x下吹干，殘?jiān)?00 μl流動(dòng)相溶解，精密進(jìn)樣10 μl后分析，記錄色譜圖。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性考察 空白血漿，空白血漿添加ABA，空白血漿添加ABA、氫氯噻嗪，經(jīng)處理后，進(jìn)樣分析；ABA、氫氯噻嗪的保留時(shí)間分別為10.463、5.510 min，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)ABA、氫氯噻嗪無干擾，結(jié)果見圖1。

2.4.2 線性范圍 用空白血漿稀釋ABA儲(chǔ)備液，得到67.5、134.5、269、537.5、1075、2150 μg/L ABA系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品200 μl，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行操作[11]，取10 μl進(jìn)行反相HPLC分析，記錄色譜圖，ABA在67.5～2150 μg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。回歸方程為Y=222.09X+85.664，r2=0.999。

2.4.3 回收率與精密度 配制低、中、高濃度分別為67.5、134.5、269、537.5、1075、2150 μg/L的ABA質(zhì)控樣品各5份，按照2.3項(xiàng)方法進(jìn)行操作，得低、中、高濃度的日內(nèi)RSD為3.01%～6.93%；日間RSD為3.27%～10.08%；相對(duì)回收率為86.67%～93.58%。

2.4.4 樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿，加入ABA對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法處理，將血樣于4℃放置0、1、2、4、24 h，然后按反相HPLC條件測(cè)定，得到該濃度下ABA含量的RSD值為3.09%～10.75%。結(jié)果表明，兔子的血漿樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 凍融穩(wěn)定性考察 根據(jù)采集樣品以及分析過程，同時(shí)考察低、中、高濃度（ABA血漿濃度分別為67.5、537.5、2150 μg/L的樣品，各制備5份。按2.3項(xiàng)下方法處理后，反復(fù)凍融3次，然后按反相HPLC條件測(cè)定[12]，得到該濃度下ABA含量的RSD值為3.14%～11.62%。結(jié)果表明在各種條件下樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只家兔（吉大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），雌雄兼用，體重為（2.5±0.5）kg。將家兔置于清潔實(shí)驗(yàn)室中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，且控制室內(nèi)溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度為40%～50%。

2.5.2 給藥方案與血樣采集 將20只家兔分為兩組，一組給予阿尼西坦普通片，一組給予阿尼西坦緩釋片，禁食10 h后灌服2片阿尼西坦片[13]（約相當(dāng)于阿尼西坦主藥200 mg），適量水沖服。4 h后統(tǒng)一進(jìn)行喂食、飲水，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)2個(gè)周期，每個(gè)周期中間間隔1周。普通片于及緩釋片均于服藥后10、20、30、40、120、160、240、360、540、720 min取血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別耳緣靜脈取血1.5 ml，放于含0.1 ml肝素的離心管中，3000 r/min，離心10 min，將血漿取出放于-20℃冷凍層保存待測(cè)。

2.5.3 平均血藥濃度-時(shí)間曲線 將凍存后的樣品取出，按照2.3項(xiàng)下進(jìn)行操作。分別測(cè)得普通片和緩釋片的血藥濃度，繪制兩者的藥-時(shí)曲線，結(jié)果見圖2。

2.5.4 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 分別記錄20只健康家兔單劑量口服阿尼西坦緩釋片200 mg及普通片200 mg后ABA血藥濃度值，采用3P97軟件處理，其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。

3 討論

阿尼西坦口服進(jìn)入人體后，很快代謝為主要代謝產(chǎn)物ABA，因此，阿尼西坦的血藥濃度很低，難以準(zhǔn)確測(cè)定[14]，而ABA的血藥濃度較高，穩(wěn)定性好，便于測(cè)定。目前國外已有文獻(xiàn)報(bào)道[15]，采用反相HPLC法測(cè)定阿尼西坦及其代謝產(chǎn)物ABA含量，但樣品預(yù)處理過程較復(fù)雜。本研究在此基礎(chǔ)上，采用反相HPLC法對(duì)阿尼西坦緩釋片活性代謝產(chǎn)物ABA的血藥濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及方法進(jìn)行了改進(jìn)和創(chuàng)新，直接采用甲醇∶氯仿（2∶8）兩項(xiàng)配比的方法對(duì)血樣進(jìn)行一次性液液萃取，結(jié)果表明此種萃取方法的效果明顯高于常規(guī)的單溶劑萃取法，大大提高了提取率，優(yōu)化了提取方法。此外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同內(nèi)標(biāo)物的選擇進(jìn)行了考察比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以氫氯噻嗪作為內(nèi)標(biāo)，保留時(shí)間為5.510 min，與非那西丁、對(duì)羥甲基苯甲酸甲酯（JNB）等（保留時(shí)間均為9 min左右）比較，可有效縮短進(jìn)樣分析時(shí)間，利于大樣本量待測(cè)物的分析，且可保證血中內(nèi)源性雜質(zhì)與ABA均可達(dá)到基線分離，互不影響[16]。

綜上所述，本文建立的反相HPLC法操作簡單，精密度高、重現(xiàn)性好，符合人體生物利用度實(shí)驗(yàn)要求，已成功應(yīng)用于阿尼西坦的生物等效性研究，為進(jìn)一步研究阿尼西坦在人體內(nèi)的藥代動(dòng)學(xué)過程奠定了基礎(chǔ)，具有可行性和可推廣性。

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（收稿日期：2015-09-07 本文編輯：許俊琴）