金麗

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

水飛薊賓增強TRAIL對MDA-MB-231細胞的凋亡誘導活性研究

金麗

（浙江省立同德醫(yī)院，浙江杭州310012）

目的探討中藥活性成分水飛薊賓對增強TRAIL對三陰乳腺癌細胞的凋亡誘導的能力并研究其機制。方法將三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231分為對照組、水飛薊賓組、TRAIL組及水飛薊賓聯(lián)合TRAIL組，MTT法檢測MDA-MB-231細胞的細胞活力，Annexin V/PI染色檢測MDA-MB-231細胞的凋亡，免疫共沉淀聯(lián)合Western blot法檢測MDA-MB-231細胞FADD-caspase-8死亡受體復合物的形成，Western blot法檢測MDA-MB-231細胞caspase-8的活化和FADD的表達水平。結果MTT實驗結果表明TRAIL體外單獨治療僅能輕微抑制MDA-MB-231的細胞活力，聯(lián)合水飛薊賓后TRAIL對MDA-MB-231細胞活力的抑制率顯著提升。流式細胞實驗結果表明TRAIL體外單獨治療對MDA-MB-231的凋亡誘導活性較低，聯(lián)合水飛薊賓后TRAIL對MDA-MB-231的凋亡誘導活性顯著提高。免疫共沉淀聯(lián)合western blot實驗結果表明水飛薊賓在體外能顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞中FADD蛋白的表達水平而TRAIL不能影響其表達，同時水飛薊賓還能顯著促進TRAIL依賴的FADD-caspase-8復合物的形成和caspase-8的活化。轉染FADD siRNA后，水飛薊賓對TRAIL的協(xié)同作用喪失。結論水飛薊賓通過上調(diào)去泛素化酶FADD的表達水平促進TRAIL依賴的RIP1蛋白的去泛素化進而誘導三陰乳腺癌細胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。

水飛薊賓；TRAIL；三陰乳腺癌；FADD；caspase-8；凋亡

三陰乳腺癌是乳腺癌的一種亞型，其癌細胞表面不表達雌激素受體、孕激素受體和Her2受體，因此缺乏靶向治療的生物靶點，只能采取化療或生物治療的方法［1］。然而在臨床治療中往往會發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對藥物治療的敏感性很低，因此尋找輔助治療藥物提高化療或生物治療的敏感性有十分重要的意義［2］。本研究的目的在于研究中藥活性成分水飛薊賓是否能發(fā)揮對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配 體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的協(xié)同作用，報道如下。

1　材料與方法

1.1材料噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），水飛薊賓，TRAIL購于美國R&D Systems，Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。細胞提取液、Fas相關死亡域蛋白（Fas-associating protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD）抗體、前caspase-8（p ro-caspase-8）抗體、活化型 caspase-8（cleaved caspase-8）抗體和 β-actin抗體購于美國 Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。FADD siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。ECL（增強型化學發(fā)光底物）試劑盒購于美國Pierce。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)本研究從2014年2月～2015年12月完成于本院實驗室。人三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。將細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。細胞每2～3天傳代1次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.2.2細胞實驗將MDA-MB-231細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、水飛薊賓組、TRAIL組和水飛薊賓+TRAIL組，分組培養(yǎng)方法詳見表1，藥物處理時間為48小時。（1）細胞活力檢測：藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4小時，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。（2）細胞凋亡實驗：藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20分鐘，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。（3）免疫共沉淀：藥物處理完畢后對MDA-MB-231細胞進行計數(shù)，取2×106的各組細胞用免疫沉淀緩沖液進行裂解，緩沖液的成分如下：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），1%NP-40細胞裂解液，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich）。MDA-MB-231細胞在裂解液下處理15分鐘后，將其在12000g下離心10分鐘，收取上清液并在其中加入FADD抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2小時。孵育完成后將其在1200g速度下離心5分鐘，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清液小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5分鐘后備用，用于檢測與RIP1結合的泛素蛋白。（4）Western blot實驗：藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌2遍并提取總蛋白質。將蛋白提取液或免疫共沉淀處理樣品用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用FADD抗體、procaspase-8抗體、cleaved caspase-8抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2小時，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

表1　MDA-MB-231細胞實驗分組方法

2　結果

2.1水飛薊賓顯著提高TRAIL對MDA-MB-231的凋亡誘導效應細胞活力檢測結果顯示水飛薊賓或TRAIL單用對MDA-MB-231細胞的殺傷活性較弱，但兩者聯(lián)合后，其對乳腺癌腫瘤細胞的殺傷活性顯著增強。流式細胞實驗結果顯示，水飛薊賓能顯著提高TRAIL對MDA-MB-231細胞的凋亡誘導活性，表明水飛薊賓和TRAIL存在協(xié)同抗乳腺癌效應，能顯著誘導腫瘤細胞的凋亡通路。詳見表2。

表2　各組對MDA-MB-231的抗腫瘤活性（±s）

表2　各組對MDA-MB-231的抗腫瘤活性（±s）

與水飛薊賓+TRAIL組比較**P＜0.05

組別　n/孔　細胞活力抑制率（%）凋亡誘導率（%）對照組　3　0　1.8±0.3水飛薊賓組　3　8.8±0.6**　4.3±0.3**TRAIL組　3　13.4±0.8**　9.5±0.4**水飛薊賓+TRAIL組　3　60.4±3.7　31.6±2.5

2.2水飛薊賓促進TRAIL依賴的死亡受體復合物的形成和 caspase-8的活化Western blot實驗結果水飛薊賓能顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞中FADD的表達水平，而TRAIL對FADD的表達無影響（圖1）。進一步的免疫共沉淀的實驗結果表明水飛薊賓能顯著促進TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復合物的形成（圖2），進而誘導MDA-MB-231細胞內(nèi)的caspase-8的活化（圖3）。

圖1　水飛薊賓上調(diào)MDA-MB-231細胞中FADD的表達水平

圖2　水飛薊賓促進TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復合物的形成

圖3　水飛薊賓促進TRAIL依賴的caspase-8的活化

2.3水飛薊賓通過上調(diào)FADD的表達水平增強MDA-MB-231細胞對TRAIL的敏感性為了明確水飛薊賓顯著提高TRAIL對MDA-MB-231細胞的殺傷活性的機制是通過上調(diào)FADD的表達，作者先將MDA-MB-231細胞用FADD siRNA進行轉染后再用TRAIL聯(lián)合水飛薊賓進行治療，結果發(fā)現(xiàn)FADD siRNA能顯著抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDA-MB-231細胞caspase-8的活化作用 （圖4），同時抑制兩者聯(lián)合對MDA-MB-231的殺傷活性和凋亡誘導效應（表3）。

圖4　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231細胞caspase-8的活化

表3　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231的殺傷活性和凋亡誘導效應（±s）

表3　FADD siRNA抑制水飛薊賓聯(lián)合TRAIL對MDAMB-231的殺傷活性和凋亡誘導效應（±s）

與水飛薊賓+TRAIL+FADD siRNA組比較*P＜0.05

組別　細胞活力抑制率（%）凋亡誘導率（%）對照組　0　1.7±0.3水飛薊賓+TRAIL組　61.5±3.8*　31.9±2.4*水飛薊賓+TRAIL+FADD siRNA組　20.6±1.2　11.8±1.0

3　討論

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體 （TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是TNF家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL能選擇性誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，卻不影響正常組織細胞的功能，因此TRAIL被認為是一種有很好前景的低毒抗腫瘤藥物［3］。盡管如此，研究也發(fā)現(xiàn)很多腫瘤細胞對TRAIL的抗腫瘤作用不敏感，并能抵抗TRAIL依賴的凋亡效應［4-5］。因此如何提高腫瘤細胞對TRAIL的敏感性是目前研究工作的重點。在TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的通路中，TRAIL首先與死亡受體4（DR4）或死亡受體5（DR5）結合，結合后的受體復合物能募集細胞中的FADD蛋白，而募集的FADD蛋白則又從細胞質中募集caspase-8前體，形成FADD-caspase-8死亡受體復合物，從而激活caspase-8并誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，因此細胞中FADD蛋白的表達水平?jīng)Q定了腫瘤細胞對TRAIL的敏感性［6-7］。

水飛薊賓是從水飛薊屬植物奶薊種子中提取的一種黃酮類化合物，臨床上主要用來保護肝細胞，對黃疸，肝炎，膽囊疾病有良好的療效［8］。近年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腫瘤活性，對于多種腫瘤均具有抑制作用［9-10］，然而將其作為輔助藥物提高腫瘤細胞的治療敏感性的研究卻少見報道。在本研究中，通過體外實驗發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可以顯著提高三陰乳腺癌細胞系MDA-MB-231對TRAIL的敏感性，誘導腫瘤細胞發(fā)生顯著的凋亡。

為了探究水飛薊賓發(fā)揮對TRAIL協(xié)同作用的分子機制，通過Western blot實驗證明了水飛薊賓能顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞中FADD的表達水平，而TRAIL對FADD的表達無影響，提示FADD可能是水飛薊賓發(fā)揮協(xié)同作用的靶蛋白。由于TRAIL通過激活caspase-8蛋白誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，因此進一步通過免疫共沉淀方法證明了水飛薊賓能促進TRAIL依賴的FADD-caspase-8死亡受體復合物的形成和caspase-8的活化。同時，當在MDA-MB-231細胞中轉染FADD siRNA抑制FADD的表達后，發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對 TRAIL的協(xié)同抗腫瘤作用喪失。這些結果證明了水飛薊賓增強TRAIL對三陰乳腺癌細胞凋亡誘導活性的機制是通過FADD/ caspase-8途徑。

綜上所述，水飛薊賓能顯著提高三陰乳腺癌細胞對TRAIL的敏感性，并發(fā)現(xiàn)水飛薊賓通過上調(diào)FADD的表達水平促進TRAIL依賴的死亡受體復合物的形成進而誘導三陰乳腺癌細胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生，為水飛薊賓輔助治療提高TRAIL的抗腫瘤活性提供了理論依據(jù)。

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