於建國(guó)，郝 耿，陳 童，托合塔森·皮達(dá)巴依，徐 東

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧所，烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)福海縣齊干吉迭鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福海836400）

遺傳育種

阿勒泰羊高繁性狀候選基因BMPR-IB、BMP15的研究

於建國(guó)1，郝 耿1，陳 童1，托合塔森·皮達(dá)巴依2，徐 東3

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧所，烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)福海縣齊干吉迭鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福海836400）

試驗(yàn)以BMPR-IB的FecB位點(diǎn)，BMP15基因的B1、FecXG（B2）、FecXB（B4）3個(gè)位點(diǎn)為阿勒泰羊高繁性狀候選基因，采用PCR-RFLP、SSCP技術(shù)檢測(cè)了116只阿勒泰羊上述4個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果表明：阿勒泰羊FecB、FecXG（B2）、FecXB（B4）位點(diǎn)只存在野生型，無(wú)多態(tài)性。B1位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AB、BB三種基因型，其基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22。

阿勒泰羊；FecB；BMP15；RFLP；SSCP

阿勒泰羊是新疆優(yōu)良的地方肉羊品種，在遺傳進(jìn)化分類上屬于哈薩克羊的一個(gè)分支，在生物學(xué)分類上屬于脂臀型粗毛羊。阿勒泰羊主要集中在阿勒泰地區(qū)的福?？h、富蘊(yùn)縣、青河縣等地，南北疆其他地區(qū)以及內(nèi)地部分省份近年來(lái)也先后引進(jìn)阿勒泰羊進(jìn)行養(yǎng)殖。

阿勒泰羊具有耐粗飼、抗寒性強(qiáng)、善跋涉、生長(zhǎng)速度快、屠宰率高、肉質(zhì)好等優(yōu)良性狀。但其繁殖率相對(duì)較低，經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率110%，初產(chǎn)母羊產(chǎn)羔率103%［1］。在生產(chǎn)實(shí)際中阿勒泰羊存在連續(xù)2～3胎產(chǎn)雙羔的個(gè)體，因此，如何建立具有高繁殖性能的阿勒泰羊群體，為地方肉羊良種羊建立具有高繁殖率的新類群是當(dāng)前阿勒泰羊面臨的重大問(wèn)題。本研究通過(guò)開(kāi)展與綿羊高繁殖率性能相關(guān)的候選基因BMPR-IB、BMP15的研究，分析4個(gè)突變位點(diǎn)的多態(tài)性與阿勒泰羊高繁殖率性狀的相關(guān)性，為開(kāi)展阿勒泰羊高繁殖率的新類群提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

阿勒泰羊血樣采自新疆福?？h齊干吉迭鄉(xiāng)阿勒泰雙羔羊繁育基地，用EDTA抗凝真空管進(jìn)行頸靜脈采血，每只3mL，共采集116只母羊血樣，-20℃凍存，用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，4℃保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

BMPR-IB基因序列（FecB（A746G））擴(kuò)增引物參照TheresaWilson等［2］發(fā)表的引物，BMP15基因B1、B2、B4序列擴(kuò)增引物參照Hanrahan等［3］發(fā)表的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 BMPR-IB和BMP15基因擴(kuò)增區(qū)域引物序列與擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.3 PCR擴(kuò)增及酶切、SSCP分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：20μL，其中10×緩沖液2μL，2.5mmol/L dNTP 1.5μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶1U，滅菌ddH2O 12.5μL。PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測(cè)或2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 BMPR-IB和BMP15基因擴(kuò)增區(qū)PCR反應(yīng)體系

酶切反應(yīng)：BMPR-IB FecB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用AvaII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；BMP15B2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Hinf I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；BMP15B4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Dde I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。37℃反應(yīng)4 h，酶切產(chǎn)物用12% PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

SSCP體系：7μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，7μL變性緩沖液（98甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、pH=8的10mmol/LEDTA、10%甘油），0.2mL離心管混勻，98℃變性10min，迅速插入冰水，放置5min，4℃條件下，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

圖1 BMPR-IB基因FecB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

FecB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，BMP15B1、B2、B4三個(gè)位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1～4。BMPR-IB FecB位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物為140bp，BMP15B1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為234bp、B2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為141 bp、B4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為153 bp，4個(gè)突變位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均與預(yù)期結(jié)果一致。

圖2 BMP15基因B1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 BMP15基因B2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 BMP15基因B4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PCR產(chǎn)物SSCP多態(tài)性

BMP15B1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該片段存在多態(tài)性，分別定義為：AA、AB和BB。如圖5所示，電泳結(jié)果從左至右泳道基因型分別為：AA、AA、AB、AA、BB、AA、BB、AA和BB。等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22，AA、AB和BB基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖5 BMP15基因B1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP分析結(jié)果

表3 FecB、B1、B2、B4位點(diǎn)基因頻率和基因型頻率（n=116）

2.3 PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

BMPR-IB FecB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用AvaII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物仍為1條帶，未出現(xiàn)條帶切開(kāi)現(xiàn)象，表明所有個(gè)體在該位點(diǎn)上均為野生型，無(wú)多態(tài)性。BMP15B2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Hinf I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后得到2條片段（111 bp，30 bp），無(wú)多態(tài)性。BMP15 B4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Dde I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后得到2條片段（122 bp，31 bp），無(wú)多態(tài)性。3個(gè)位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果表明，樣本羊在該3個(gè)位點(diǎn)上均為野生型，結(jié)果見(jiàn)圖6～8。

圖6 BMPR-IB基因FecB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果

圖7 BMP15基因B2位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果

圖8 BMP15基因B4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果

3 討論

BMPR-IB基因編碼區(qū)746位點(diǎn)上發(fā)生A-G突變，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上氨基酸由谷氨酰胺變成了精氨酸，該位點(diǎn)于1980年在Booroola羊上首次發(fā)現(xiàn)，并命名為FecB。FecB突變位點(diǎn)在我國(guó)的小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、多浪羊等綿羊品種中也先后被發(fā)現(xiàn)。韓穎潔等［4］通過(guò)檢測(cè)小尾寒羊BMPR-IB基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因存在BB、B+ 和++三種基因型，基因型頻率分別為0.067、0.360和0.573，平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.55、2.35和1.28只。吳麗麗等［5］在湖羊中開(kāi)展BMPR-IB基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)只存在BB、B+兩種基因型，未檢測(cè)到++基因型個(gè)體，其結(jié)果與王根林等［6］、管峰等［7］研究結(jié)果相一致，認(rèn)為BMPR-IB基因是影響湖羊高繁殖力的一個(gè)主效基因。馬海玉等［8］檢測(cè)到吐魯番黑羊BMPR-IB基因只存在1種基因型，沒(méi)有多態(tài)性。哈薩克羊和策勒黑羊群體中的BMPR-IB基因具有多態(tài)性，存在3種基因型：++、B+和BB，其中BB基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于++基因型個(gè)體（P＜ 0.05）。邵勇鋼等［9］在策勒黑羊中檢測(cè)到BMPR-IB基因存在多態(tài)性，BB、B+基因型間產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于++基因型（P＜0.01），但BB、B+基因型間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），認(rèn)為在策勒黑羊中B等位基因可用于對(duì)策勒黑羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇。本研究結(jié)果顯示，在組建的阿勒泰羊多胎群體中未檢測(cè)到BMPR-IB基因在FecB位點(diǎn)存在多態(tài)性，無(wú)突變基因B，初步認(rèn)為，BMPR-IB基因FecB突變位點(diǎn)不是引起阿勒泰羊多羔群體產(chǎn)羔數(shù)增加的主效基因。

BMP15基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，位于X染色體上，編碼序列全長(zhǎng)1 179 bp。BMP15在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究已發(fā)現(xiàn)，綿羊BMP15基因具有FecXI，F(xiàn)ecXH，F(xiàn)ecXL，B1，F(xiàn)ecXG（B2），B3，F(xiàn)ecXB（B4）共7個(gè)不同突變。Hanrahan等研究Cambridge和Belclare綿羊BMP15基因發(fā)現(xiàn)，在編碼區(qū)有4個(gè)單核苷酸多態(tài)，第28～30位的堿基CTT缺失，導(dǎo)致編碼區(qū)第10個(gè)氨基酸殘基亮氨酸缺失，形成B1突變體，但該突變并不改變BMP15的功能；第718位的堿基C突變?yōu)門，導(dǎo)致了編碼區(qū)239號(hào)氨基酸殘基谷氨酰胺被一個(gè)早熟終止密碼子代替，形成B2突變體，該突變可能導(dǎo)致了BMP15功能的徹底喪失；第1 100位的堿基G突變?yōu)門，導(dǎo)致了編碼區(qū)367號(hào)氨基酸殘基絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔纬葿4突變體，該突變改變了BMP15的功能。楊晶等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊和陶賽特羊中均檢測(cè)到B1突變位點(diǎn)，但含突變基因的個(gè)體與野生型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），BMP15基因B1突變位點(diǎn)不能作為小尾寒羊高繁殖率的主效基因。劉永斌等［11］在蒙古羊中發(fā)現(xiàn)B1突變位點(diǎn)，但含突變基因的個(gè)體與野生型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），BMP15基因B1突變位點(diǎn)不能作為蒙古羊多胎群體高繁殖率的主效基因。本研究對(duì)阿勒泰羊BMP15基因上的B1、B2和B4突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，B2和B4突變位點(diǎn)沒(méi)有多態(tài)性，只有B1突變位點(diǎn)具有多態(tài)性。B1突變位點(diǎn)等位基因A、B的頻率分別為0.78、0.22，AA、AB和BB基因型頻率分別為0.63、0.29、0.08，但含突變基因的個(gè)體與野生型個(gè)體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（P＞0.05），初步認(rèn)為B1不能作為阿勒泰羊多胎群體高繁殖率的主效基因。

［1］阿勒泰羊［S］.NY/T 1816—2009.

［2］Theresa Wilson.Highly prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor （ALK-6）that is expressed in both oocytes and granulose cells［J］.Biology of Reproduction，2001，64：1225-1235.

［3］Hanrahan J P，Gregan SM，Mulsant P，et a1.Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep（Ovisaries）［J］.Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

［4］韓穎潔，劉月琴，張英杰.小尾寒羊BMPR-IB基因多態(tài)性研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2014，34（增刊）：90-92.

［5］吳麗麗，趙曉楓，張立凡.湖羊BMPR-IB、BMP15和GDF9基因的RFLP分析［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2011，31（4）：9-12.

［6］王根林，毛鑫智，George HDavis，等.DNA分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)湖羊和小尾寒羊存在Booroola（FecB）多胎基因［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（1）：104-106．

［7］管峰，艾君濤，劉守仁，等.BMPR-IB和BMP15基因作為湖羊多胎性候選基因的研究［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，26（3）：9-12．

［8］馬海玉，王瓊，于茜，等.3個(gè)新疆綿羊品種中BMPR-IB基因的RFLP分析及比較［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（4）：19-24.

［9］邵勇鋼，米日尼薩汗·庫(kù)爾班，劉武軍.策勒黑羊BMPR-IB基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（6）：221-223.

［10］楊晶.小尾寒羊GDF9基因和BMP15基因多態(tài)性及其與高繁殖力關(guān)系的研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2006.

［11］劉永斌，何小龍，王峰.蒙古羊BMP15基因外顯子1位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)羔性能關(guān)系分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（5）：30-34.

Study on BMPR-IB，BMP15 asCandidate Genes for Prolific Traits of Altay Sheep

Yu Jianguo，Hao Geng，Chen Tong，et al
（Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi830000，China）

In this study，the single nucleotide polymorphism of four loci（FecB of BMPR-IB，B1，F(xiàn)ecXGand FecXBof BMP15）from 116 Altay sheep were detected using PRC-RFLP，SSCP technique.The results showed that there were no polymorphism in the loci of FecB，F(xiàn)ecXGand FecXB，only wild type loci；there were three genotypes（AA，AB，BB）in the loci of B1，their frequencies were 0.63，0.29，0.08 respectively，the frequencies of allele gene A and B were 0.78 and 0.22 respectively.

Altay sheep；FecB；BMP15；RFLP；SSCP

S826.2

A

2095-3887（2016）04-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.001

2016-04-22

新疆自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（KY2015010）

於建國(guó)（1977-），男，助理研究員。研究方向：動(dòng)物遺傳育種。