楊利玲 雷以會(huì) 徐 平

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遵義，563000)

貴州遵義地區(qū)蝙蝠腦組織博爾納病病毒磷蛋白的檢測(cè)

楊利玲 雷以會(huì) 徐 平

(遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遵義，563000)

修回日期：2015-12-05

發(fā)表日期：2016-05-10

蝙蝠；

博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)最早發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)德國的Borna鎮(zhèn)，是一種新型的傳染病病毒。該病毒曾引起當(dāng)?shù)貞?zhàn)馬中爆發(fā)一類致死性的腦炎，主要臨床癥狀為精神行為異常(姿勢(shì)步態(tài)異常，動(dòng)作減少或多動(dòng)，震顫、四肢抽動(dòng)等)。BDV為嚴(yán)格嗜神經(jīng)性的RNA病毒，其主要自然感染宿主為馬和羊，隨著對(duì)BDV研究的深入，發(fā)現(xiàn)BDV有著更廣泛的自然感染宿主，也能感染人類發(fā)生神經(jīng)精神類疾病。BDV基因組中包含6個(gè)開放閱讀框，其中ORFⅠ、ORFⅡ包含的序列相對(duì)保守，變異性更小，成為檢測(cè)病毒感染的特異性指標(biāo)。目前發(fā)現(xiàn)在感染脊椎動(dòng)物的16個(gè)RNA病毒科中，至少有9個(gè)與蝙蝠相關(guān)[1]。最近肆虐西非的埃博拉病毒、上世紀(jì)末馬來西亞的尼帕病毒、澳大利亞的亨德拉病毒以及SARS病毒都已經(jīng)被證實(shí)其真正的自然宿主為蝙蝠[2]。蝙蝠是哺乳動(dòng)物中唯一能飛行的動(dòng)物，并且有些種類蝙蝠的壽命可以超40 a，為病毒的傳播創(chuàng)造了有利條件。隨著城市的擴(kuò)張以及部分蝙蝠在城市中定居，使人和蝙蝠之間接觸機(jī)會(huì)不斷增加。故本實(shí)驗(yàn)選取BDV ORFⅡ編碼的磷蛋白為檢測(cè)對(duì)象，應(yīng)用蛋白免疫印跡法(western blotting，WB)檢測(cè)貴州省遵義地區(qū)蝙蝠腦組織BDV磷蛋白(Borna disease virus phosphoprotein，BDV-P)，旨在了解蝙蝠是否為BDV的自然感染宿主，結(jié)合前期工作分析BDV的分子流行病學(xué)特征，為了解和預(yù)測(cè)潛在的博爾納病爆發(fā)和流行的可能性奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2014年5～9月之間，收集貴州省遵義市綏陽地區(qū)野生蝙蝠82只，取蝙蝠額顳葉腦組織放入去酶的1.5 mL EP管，依次編號(hào)。并立即放于-80℃的超低溫冰箱保存。采集過程中嚴(yán)格按照無菌操作收集標(biāo)本，避免樣品間交叉污染。

1.2 主要儀器和試劑

兔源BDV-P24多克隆抗體，堿性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase，AP)標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取蛋白

每份腦組織標(biāo)本稱取100 mg于EP管中，按每100 mg腦組織加入500 mL蛋白提取液，每1 mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制劑、10 μL磷酸酶抑制劑、10 μL苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，充分振蕩混勻后冰上保存、分裝。待標(biāo)本與蛋白裂解液充分接觸后在超聲細(xì)胞裂解儀上充分裂解，此步驟在冰上操作，直至為均勻的混合液為止。高速低溫離心機(jī)140 000 bpm 15 min，上清液即為所得的蛋白質(zhì)。

1.3.2 二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)蛋白濃度及蛋白定性

抽取5份蛋白質(zhì)樣品，按BCA法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。每份樣品取50 μL，按1∶3的比例加入1×Loading Buffer，充分振蕩混勻后放在恒溫器上變性，100℃ 10 min，變性后-20℃冰箱保存。

1.3.3 確定最佳抗體稀釋濃度

將OL/BDV細(xì)胞裂解抗原分別與不同稀釋濃度的BDV-P24兔多克隆抗體(一抗)(1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000)和AP標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)(1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000)交叉反應(yīng)，根據(jù)發(fā)光結(jié)果，確定最佳稀釋濃度。

1.3.4 WB檢測(cè)BDV磷蛋白

將提取的樣品蛋白經(jīng)12% SAS-PAGE電泳，同時(shí)加入陽性蛋白標(biāo)本(由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))作為陽性參照物。采用“三明治”形式進(jìn)行半干轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)移至固相載體(PVDF膜)上，轉(zhuǎn)膜完全后將PVDF膜放入5%的脫脂牛奶中進(jìn)行封閉。與BDV-P24兔多克隆抗體按最佳稀釋濃度進(jìn)行一抗孵育，4℃過夜(孵育時(shí)間大于15 h)。PBST快速洗滌3次，每次15 min，將AP標(biāo)記羊抗兔IgG按最佳稀釋濃度行二抗孵育，室溫下孵育2 h。PBST充分洗滌3次，每次15 min。最后按從弱到強(qiáng)滴加發(fā)光劑，反應(yīng)5 min。曝光，掃描保存。

2 結(jié)果

2.1 按BCA法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品蛋白濃度，其相關(guān)系數(shù)為0.999，樣品蛋白的濃度約為1 μg/μL。

2.2 將BDV感染的OL裂解細(xì)胞抗原與不同濃度BDV-P24兔多克隆抗體(一抗)和AP標(biāo)記羊抗兔IgG(二抗)進(jìn)行交叉反應(yīng)的WB方法確定最佳稀釋濃度，一抗和二抗的最佳稀釋濃度分別為1∶1 000和1∶5 000。

2.3 82只野生蝙蝠腦組織中BDV磷蛋白陽性9例(陽性率為11%)，發(fā)光結(jié)果見圖1。

圖1 蝙蝠腦組織BDV磷蛋白WB曝光結(jié)果(+為陽性對(duì)照，-為陰性對(duì)照，1～9實(shí)驗(yàn)標(biāo)本)Fig 1.The results of western blot BDV phosphoprotein in bat brain tissue.(+ was positive control，-was negative control，1-9 were test specmens)

3 討論

博爾納病病毒(borna diseaase virus，BDV)為含有包膜未分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，是目前博爾納病毒屬、博爾納病毒科中唯一的成員，其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，目前結(jié)合博爾納病毒的系統(tǒng)樹分析以及生物學(xué)特征表面博爾納病毒屬至少有5個(gè)種類：Ⅰ、哺乳動(dòng)物類BDV-1，包括傳統(tǒng)的博爾納病毒和流行株NO/98；Ⅱ、鸚鵡類BDV-1，包括鳥以及鸚鵡類BDV-1、2、3、4、7；Ⅲ、雀形類BDV-1：包括鳥以及亞尼沙愛金絲雀BDV-L1、L2、L3、LS；Ⅳ、雀形類BDV-2：梅花雀BDV EF；Ⅴ、水禽BDV-：鳥BDV 062CG[3]。BDV地理分布較廣泛，遍及日本、澳大利亞、伊朗、意大利、瑞士、德國、土耳其等均有關(guān)于BDV感染動(dòng)物或人的相關(guān)報(bào)道[4]。2010年研究者Horie和Belyi[5-6]在人和其他脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了EBL(endogenization borna like，EBL)基因序列，在部分微型蝙蝠中也發(fā)現(xiàn)了EBL-N、EBL-L、EBL-M基因序列。EBL基因序列與BDV已知的標(biāo)準(zhǔn)株基因序列相似性達(dá)40%以上，而且Kinnunen[7]認(rèn)為EBL基因序列特別是EBL-N基因序列可以使一類物種更有機(jī)會(huì)成為BDV攜帶者?？赡茯鹪贐DV流行病學(xué)中也扮演重要的角色。

本實(shí)驗(yàn)采用WB方法檢測(cè)貴州省遵義市綏陽地區(qū)野生蝙蝠腦組織中是否表達(dá)BDV-P，發(fā)現(xiàn)9例(9/82)標(biāo)本陽性，陽性率11%，表明遵義綏陽地區(qū)的蝙蝠可能為BDV自然感染攜帶者，與學(xué)者Horie的研究結(jié)果相吻合。結(jié)合前期本課題組成員王長(zhǎng)明[8]采用FQ-nRT-PCR方法對(duì)遵義地區(qū)山羊PMBC中的BDV-P24基因片段、劉海軍[9-10]用FQ-nRT-PCR對(duì)遵義及周邊地區(qū)牛群中PMBC中的BDV-P24基因片段的檢測(cè)以及用ELISA檢測(cè)貴州部分地區(qū)病毒性腦炎、吉蘭-巴雷綜合癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中血清中BDV抗原、特異性抗體以及抗原-抗體免疫復(fù)合物，說明遵義地區(qū)可能為BDV流行地區(qū)之一。本實(shí)驗(yàn)以蝙蝠腦組織BDV-P為檢測(cè)對(duì)象，其陽性率明顯高于前期成員檢測(cè)PBMC中BDV-RNA研究結(jié)果，一方面可能由于腦組織中BDV相關(guān)蛋白過量表達(dá)，另一方面可能由于在PBMC中病毒RNA復(fù)制低或者已降解的RNA[11]。

近年來文獻(xiàn)報(bào)道BDV出現(xiàn)許多新的自然感染宿主，如蝙蝠、嚙齒動(dòng)物以及食蟲類[12]。但感染BDV動(dòng)物的耐受機(jī)制以及感染途徑仍不清楚，但研究者通過實(shí)驗(yàn)證明BDV極有可能是通過嗅神經(jīng)、三叉神經(jīng)或者是舌咽神經(jīng)進(jìn)行傳播，也能通過被感染動(dòng)物的分泌物進(jìn)行傳播。Okamoto等[13]研究者實(shí)驗(yàn)性的感染小鼠發(fā)現(xiàn)BDV即可以水平傳播，也能垂直傳播。有研究報(bào)道認(rèn)為BDV感染可能為動(dòng)物源性，BDV可以從感染BDV的動(dòng)物向人類傳播，人類與蝙蝠同屬于哺乳動(dòng)物，古老的病毒可能在人和蝙蝠的細(xì)胞膜上都有相應(yīng)的病毒受體[14-15]，這樣人類和蝙蝠都有可能成為BDV感染的攜帶者。遵義綏陽地區(qū)林業(yè)較為發(fā)達(dá)，蝙蝠活動(dòng)范圍較大，蝙蝠分泌物可能會(huì)污染當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物間接傳播給人類，走訪當(dāng)?shù)厝松盍?xí)慣，發(fā)現(xiàn)他們主要是自給自足，并且有一部分人曾食蝙蝠，使當(dāng)?shù)鼐用窀腥綛DV的概率大大增加。

總而言之，貴州遵義綏陽地區(qū)蝙蝠可能為BDV的自然感染宿主，因此，本研究結(jié)果豐富了貴州省BDV分子流行學(xué)資料，有助于對(duì)潛在的BDV感染爆發(fā)流行做好防范工作。但由于收集標(biāo)本的局限性以及樣本數(shù)量較少，后續(xù)研究還需擴(kuò)大樣本量以及多地區(qū)的收集標(biāo)本，以及了解其他可能攜帶BDV的物種。

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Bats；BDV；Phosphoprotein；Western blot

DectionofBornaDiseaseVirusPhosphoproteininBrainTissueofBatsinZunyiRegion，GuizhouProvince

YangLilingLeiYihuiXuPing

(TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi，563000，China)

To investigate the status of Borna disease virus(BDV)natural infection in wild bats，we use the western blotting method to detect the phosphoprotein expression of BDV in 82 wild bat brain tissue specimens collected from the Zunyi region of Guizhou Province.Result showed that 9 of 82 specimens were phosphoprotein positive，which indicated that BDV natural infection exists in the bats in Zunyi region of Guizhou Province.

稿件運(yùn)行過程

2015-10-29

BDV；

磷蛋白；

蛋白免疫印跡；

S858.9

A

2310-1490(2016)02-126-03

研究貴州省遵義地區(qū)野生蝙蝠腦組織中BDV自然感染情況。方法：采用蛋白免疫印跡檢測(cè)貴州省遵義地區(qū)82只野生蝙蝠腦組織中BDV磷蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：82只蝙蝠腦組織中BDV磷蛋白陽性9例(11%)。結(jié)論：貴州省遵義地區(qū)蝙蝠存在BDV自然感染。

國家自然科學(xué)基金，神經(jīng)疾病與Borna病癥毒感染的相關(guān)性研究

楊利玲，女，25歲，碩士研究生；主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染研究。E-mial：18798680327@163.com