楊 宵，佟繼銘，萬(wàn)慧杰，趙盼盼，董雅潔，張樹(shù)峰

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

大黃總蒽醌對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖及Cyt-C、Caspase3表達(dá)的影響*

楊 宵，佟繼銘，萬(wàn)慧杰，趙盼盼，董雅潔，張樹(shù)峰△

（河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000）

目的：探討大黃總蒽醌（RTA）含藥血清對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞（SC）增殖及細(xì)胞色素C（Cyt-C）、Caspase3表達(dá)的影響。方法：兩步酶消化法分離培養(yǎng)大鼠SC細(xì)胞，第三代SC細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組和3個(gè)RTA含藥血清組，分別以胎牛血清和RTA含藥血清作用48h后，MTT法觀察SC細(xì)胞的增殖活力，Western blotting法檢測(cè)SC細(xì)胞Cyt-C、Caspase3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，RTA高劑量組含藥血清（4.50g/kg）SC細(xì)胞增殖活力明顯降低（P＜0.05），Cyt-C、Caspase3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；RTA中劑量組含藥血清（2.25g/kg）可顯著抑制SC細(xì)胞增殖，上調(diào)Caspase3蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論：RTA中、高劑量組含藥血清可抑制大鼠SC細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Cyt-C和Caspase3蛋白表達(dá)有關(guān)。

大黃總蒽醌；睪丸支持細(xì)胞；細(xì)胞增殖；Cyt-C；Caspase3

大黃為常用中藥，因藥效肯定被廣泛應(yīng)用于臨床。近年來(lái)，大黃在美容養(yǎng)顏、排毒瘦身等方面的應(yīng)用，使得人們對(duì)大黃的使用趨向長(zhǎng)期化，相關(guān)不良反應(yīng)報(bào)道頻發(fā)［1］。大黃的主要活性成分為蒽醌類化合物，本課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大黃總蒽醌（RTA）可明顯降低大鼠睪丸指數(shù)和精子數(shù)量［2］。本研究擬采用RTA含藥血清體外培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞（SC），觀察RTA對(duì)SC細(xì)胞增殖及Cyt-C、Caspase3表達(dá)的影響，完善RTA影響雄性大鼠生殖的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物：8周齡SD大鼠32只，16-22日齡SD大鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001）。

1.1.2 藥材與試劑：大黃總蒽醌（南京澤朗醫(yī)藥公司，純度54.7%，批號(hào)：ZL140906582）；胰酶、膠原酶Ⅳ、DMEM/ F12培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司。Cyt-C一抗，英國(guó)Abcam公司；Caspase3一抗、羊抗鼠二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 RTA含藥血清的制備 32只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，RTA低、中、高劑量組，每組8只。RTA組大鼠分別給予不同劑量的RTA（0.45g/kg、2.25g/kg、4.50g/ kg）灌胃，空白對(duì)照組大鼠灌胃給予同等劑量的生理鹽水，各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)給藥7天。各組大鼠末次給藥1h后，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3500r/ min離心10min，分離血清，過(guò)濾除菌，56℃滅活30min，即得各RTA組含藥血清，-70℃保存。

1.3 大鼠SC細(xì)胞的培養(yǎng) 16-22天SD大鼠，脫頸椎處死，無(wú)菌環(huán)境取出睪丸，剝離被膜、血管，PBS沖洗，剪碎。0.25%胰酶37℃消化12min，至睪丸組織呈絮狀，加入培養(yǎng)液終止消化，離心去除胰酶；0.5%膠原酶Ⅳ 37℃消化15min，培養(yǎng)液終止消化，去除膠原酶。加入培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，100目鋼網(wǎng)過(guò)濾去除未消化完全的組織，濾液加入培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后更換培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)至75%以上時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.4 RTA含藥血清對(duì)大鼠SC細(xì)胞增殖的影響 第3代SC細(xì)胞以1×105/ml接種于96孔板，分為空白對(duì)照組和3個(gè)RTA含藥血清組，每組8個(gè)復(fù)孔。普通培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，棄上清，分別加入空白和低、中、高劑量RTA含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。MTT法檢測(cè)，570nm處測(cè)定吸光度A值。

1.5 Western blotting法檢測(cè)大鼠SC細(xì)胞Cyt-C、caspase3蛋白表達(dá)第3代SC細(xì)胞1×105/ml的密度接種至培養(yǎng)皿，普通培養(yǎng)48h后含藥血清處理（分組及給藥方法同1.4），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，加入細(xì)胞裂解液，細(xì)胞刮提取蛋白。采用5%濃縮膠、12%分離膠進(jìn)行凝膠電泳，蛋白上樣量30 μ g；電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉過(guò)夜；一抗孵育2h，Caspase3（1：1000）、Cyt-C（1：2000）、β-actin（1：3000）；二抗孵育1.5h；ECL超敏發(fā)光液顯影成像。膠片掃描后應(yīng)用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RTA含藥血清對(duì)SC細(xì)胞增殖的影響 RTA高劑量組SC細(xì)胞增殖活力明顯低于空白對(duì)照組和RTA低、中劑量組（P＜0.05）；RTA中劑量組SC細(xì)胞增殖活力明顯低于空白對(duì)照組和低劑量組（P＜0.05）；其余組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)附表。

2.2 RTA含藥血清對(duì)SC細(xì)胞Cyt-C、Caspase3蛋白表達(dá)的影響 RTA高劑量組SC細(xì)胞Cyt-C、Caspase3蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和低、中劑量組（P＜0.05）；RTA中劑量組SC細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組和低劑量組（P＜0.05）；其余組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)附表、附圖。

附表 SC細(xì)胞增殖和Cyt-C、Caspase3蛋白表達(dá)情況（±s，n=8）

附表 SC細(xì)胞增殖和Cyt-C、Caspase3蛋白表達(dá)情況（±s，n=8）

與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與RTA低劑量組比較：#P＜0.05；與RTA中劑量組比較：△P＜0.05

組別RTA劑量（g/kg）吸光度值（A）Cyt-CCaspase3 0.450.31±0.020.90±0.620.93±0.05 2.250.30±0.02*#0.93±0.101.04±0.10*#4.500.28±0.02*#△1.08±0.17*#△1.26±0.12*#△空白對(duì)照組---0.32±0.010.89±0.090.86±0.04低劑量組中劑量組高劑量組

附圖 大鼠SC細(xì)胞Caspase3、Cyt-C蛋白表達(dá)情況

3 討論

大黃是臨床上用來(lái)治療慢性腎功能衰竭非常常用的中藥，其中所含的蒽醌類成分，如大黃素可延緩腎功能衰竭的進(jìn)展［3］。RTA約占大黃生藥材的2%-5%，主要為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等［4］。有關(guān)蒽醌類化合物安全性的研究指出，長(zhǎng)期使用含蒽醌的植物性瀉藥會(huì)造成大腸黑變?。∕C），大鼠肝肥大，腎小管生成透明小滴，腎礦化等，機(jī)制除RTA可直接作用細(xì)胞產(chǎn)生毒性外，還涉及細(xì)胞凋亡途徑［5-6］。目前已知的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑有三條：Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑、線粒體凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［7］。Cyt-C存在于線粒體內(nèi)膜的外面，凋亡因素作用于線粒體后，線粒體釋放Cyt-C，激活胞質(zhì)中的caspase9，進(jìn)一步激活caspase3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。

睪丸是男性重要的生殖器官，SC是生精細(xì)胞的支架，為生精細(xì)胞提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，如激活素、白介素、生精生長(zhǎng)因子等［9］。SC細(xì)胞的活力直接決定生精細(xì)胞能否得到足夠的營(yíng)養(yǎng)和支持，進(jìn)而決定精子的數(shù)量與活力，反應(yīng)機(jī)體的生育能力。本研究發(fā)現(xiàn)，RTA中、高劑量組含藥血清可明顯抑制SC細(xì)胞增殖，RTA高劑量組含藥血清可明顯上調(diào)SC細(xì)胞Cyt-C和Caspase3蛋白的表達(dá)。

本研究提示，RTA中、高劑量組含藥血清可抑制大鼠SC細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Cyt-C、Caspase3蛋白的表達(dá)有關(guān)。

［1］胡曉丞，李亞洲，張樹(shù)峰，等.大黃水提物對(duì)雄性小鼠睪丸影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，29（1）：18-20.

［2］郭建恩，胡曉丞，佟繼銘，等.大黃水提物對(duì)雄性未成年大鼠生殖毒性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2013，47（12）：82-86.

［3］Kuo YC， Tsai WJ， Meng HC， et al. Immune reponses in human mesangial cells regulated by emodin from Polygonum hypoleucum Ohwi［J］. Life Sci， 2001， 68（11）: 1271-1286.

［4］匡海學(xué).中藥化學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003.94-95.

［5］Byers RJ， Marsh P， Parkinson D， et al. Melanosis coli is associated with an increase in colonic epithelial apoptosis and not with laxative use［J］. Histopathology， 1997， 30（2）: 160-164.

［6］National Toxicology Program. NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of EMODIN （CAS N0:518-82-1）Feed Studies in F344/N Rats and B6C3F1 Mice［J］. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser，2001， 493: 1-278.

［7］朱炎杰，高維娟.Cyt-C與caspase在細(xì)胞凋亡中的作用及相互關(guān)系［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011，31（15）：2990-2992.

［8］李云，劉菲.Cyt-C和Caspase3在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)［J］.眼科新進(jìn)展，2014，34（3）：228-231.

［9］張靜，張晨，黃云飛.吸煙對(duì)雄性小鼠睪丸組織中增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響［J］.毒理學(xué)雜志，2011，25（2）：163-165.

（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯：陳志宏）

EFFECTS OF RHEUM TOTAL ANTHRAQUINONE ON PROLIFERATION AND CYT-C, CASPASE3 EXPRESSION IN SERTOLI CELLS

YANG Xiao， TONG Ji-ming， WAN Hui-jie， et al
(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To explore the effects of rheum total anthraquinone （RTA）-containing serum on proliferation and Cyt-C， Caspase3 expression of Sertoli cells. Methods: Two step enzyme digestion method was used to isolate Sertoli cells of SD rats； The third generation of Sertoli cells were randomly divided into blank control group and 3 RTA-containing serum groups. MTT was used to observe the proliferation of Sertoli cells， Western blotting to detect Cyt-C and Caspase3 expression in Sertoli cells after the Sertoli cells were treated with fetal calf serum and RTA-containing serum for 48h respectively. Results: Compared with blank control group， the proliferation activity of Sertoli cells in high dose RTA-containing serum group （4.50g/kg） obviously declined， Cyt-C and Caspase3 expression in Sertoli cells obviously increased（P＜0.05）. Middle dose RTA-containing serum （2.25g/kg） could obviously inhibit proliferation of Sertoli cells and obviously increase Caspase3 expression in Sertoli cells （P＜0.05）. Conclusions: High dose and middle dose RTA-containing serum can inhibit proliferation of rats' Sertoli cells， which maybe related to regulating expression of Cyt-C and Caspase3.

Rheum total anthraquinone； Sertoli cell； Proliferation； Cyt-C； Caspase3

* 河北省教育廳資助項(xiàng)目（2009301）

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R285.5

A

1004-6879（2016）03-0189-03

（2015-11-11）