黃愛華，張萍萍，張 斌，馬步青，關(guān)云謙，周逸丹

1浙江省杭州市第三人民醫(yī)院急診科，杭州 3100002首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京 100053

?

·論 著·

人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和單個核細(xì)胞靜脈移植治療大鼠腦梗死療效的比較

黃愛華1，張萍萍1，張 斌1，馬步青1，關(guān)云謙2，周逸丹1

1浙江省杭州市第三人民醫(yī)院急診科，杭州 3100002首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京 100053

目的 比較人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和單個核細(xì)胞(MNC)經(jīng)靜脈移植后對腦梗死的療效。方法 采用大腦中動脈遠(yuǎn)端凝斷法制造大鼠腦梗死模型。將大鼠分為假手術(shù)組、缺血對照組(造模后經(jīng)尾靜脈給予生理鹽水)、MSC組(造模后經(jīng)尾靜脈給予MSC)和MNC組(造模后經(jīng)尾靜脈給予MNC)。移植后2 d，取腦進(jìn)行梗死體積測定；移植后1、3、5、7 d，采用肢體放置測驗和平衡木實驗進(jìn)行行為學(xué)評價；移植后7 d，采用免疫熒光法測量梗死周邊紋狀體區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞Iba- 1的染色豐度；移植后3、7 d，采用ELISA檢測移植后梗死灶周邊紋狀體區(qū)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的蛋白水平。結(jié)果 缺血對照組、MSC組和MNC組的相對梗死體積分別為(37.85±4.40)%、(33.41±3.82)%和(30.23±3.63)%，其中，MSC組(t=2.100，P=0.034)和MNC組(t=2.109，P=0.0009)顯著低于缺血對照組，MNC組顯著低于MSC組(t=1.743，P=0.043)。移植后1 d，缺血對照組的肢體放置成功率為(4.32±0.71)%，明顯低于假手術(shù)組的(9.73±0.36)%(t=2.178，P=8.61×10-11)；MSC組和MNC組分別為(5.09±0.62)%(t=2.1009，P=0.024)和(5.90±0.68)%(t=2.1008，P=0.0001)，明顯高于缺血對照組；MNC組又明顯高于MSC組(t=2.1009，P=0.0165)。MSC組和MNC組損傷對側(cè)前肢錯步數(shù)占總步數(shù)的百分比分別為(5.56±0.86)%(t=2.120，P=0.020)和(5.13±0.95)%(t=2.131，P=0.003)，明顯低于缺血對照組的(6.47±0.61)%。移植后3 d，MNC組的肢體放置成功率為(6.91±1.10)%，明顯高于缺血對照組的(5.80±0.82)%(t=2.110，P=0.027)；MSC組為(6.30±0.77)%，與缺血對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.101，P=0.199)。MNC組損傷對側(cè)前肢錯步數(shù)占總步數(shù)的百分比為(4.34±0.58)%，明顯低于缺血對照組的(5.31±0.65)%(t=2.100，P=0.006)和MSC組的(4.92±0.53)%(t=2.100，P=0.041)，MSC組與缺血對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.109，P=0.139)。假手術(shù)組、缺血對照組、MSC組和MNC組的Iba- 1相對豐度分別為1.00+0.00、1.72±0.21、1.23±0.08和1.48±0.06，其中，缺血對照組顯著升高，為假手術(shù)組的(1.72±0.21)倍(t=2.262，P=2.9×10-6)，MSC組則降低至假手術(shù)組的(1.23±0.08)倍，比缺血對照組顯著降低(t=2.178，P=3.91×10-5)，MNC組降低至假手術(shù)組的(1.48±0.06)倍，比缺血對照組顯著降低(t=2.200，P=0.007)，MSC組和MNC組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.120，P=7.09×10-6)。移植后3 d，MSC組的BDNF和GDNF分別為(531.127±73.176)pg/mg蛋白(t=2.109，P=0.003)和(127.780±16.733)pg/mg蛋白(t=2.100，P=2.76×10-5)，均明顯高于缺血對照組的(401.988±89.006)pg/mg蛋白和(86.278±14.832) pg/mg；MNC組分別為(627.429±65.646)pg/mg蛋白(t=2.144，P=0.017)和(153.117±20.443)pg/mg蛋白(t=2.144，P=0.017)，均明顯高于MSC組。移植后7 d，MSC組的BDNF和GDNF分別為(504.776±83.282)pg/mg蛋白(t=2.101，P=0.005)和(81.641±11.019)pg/mg蛋白(t=2.100，P=0.002)，均明顯高于缺血對照組的(389.257±70.440)pg/mg蛋白和(64.322±9.855) pg/mg；MNC組分別為(589.068±63.323)pg/mg蛋白(t=2.100，P=0.027)和(102.161±19.932)pg/mg蛋白(t=2.144，P=0.017)，也均明顯高于MSC組。結(jié)論 腦梗死后1 h靜脈移植人骨髓MSC和MNC都能夠減小梗死體積、改善動物行為。二者的療效產(chǎn)生機制可能均與抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生有關(guān)。MNC減小梗死體積和改善動物行為比MSC更有效，推測可能與MNC誘導(dǎo)腦內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子GDNF和BDNF的量比MSC更高有關(guān)。

腦梗死；間充質(zhì)干細(xì)胞；單個核細(xì)胞；炎癥；小膠質(zhì)細(xì)胞；移植

ActaAcadMedSin，2016,38(5)：497-506

細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有可能取得突破的新方法，人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)和單個核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)是常用的兩種細(xì)胞類型。MSC是體內(nèi)廣泛存在的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，因其自身的低免疫原性和高效免疫調(diào)節(jié)作用而受到重視。MSC只表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子，不表達(dá)MHCⅡ類分子，同種異體移植后不會引起顯著的免疫排斥反應(yīng)，所以MSC可以實現(xiàn)異體移植。雖然出于避免免疫排斥和倫理學(xué)的考慮，自體細(xì)胞移植是臨床試驗的理想方式，但對于年老或患有嚴(yán)重疾病的個體來說，同種異體移植相比自體移植更具有可行性。MSC可產(chǎn)生多種營養(yǎng)性的細(xì)胞因子，達(dá)到保護受損神經(jīng)細(xì)胞的作用[1]。近年來，MSC的抗炎作用受到越來越多的關(guān)注。MSC細(xì)胞體外共培養(yǎng)可有效抑制淋巴細(xì)胞增殖和促炎性因子釋放，在體內(nèi)可有效減弱移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，減輕體內(nèi)非特異的炎癥反應(yīng)，例如減少腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活等。這些特性使MSC具有參與臨床治療免疫相關(guān)疾病的可能[2]。近年來，MSCs在疾病動物模型和臨床研究中被嘗試應(yīng)用于治療慢性炎癥和免疫紊亂相關(guān)疾病[3]。

由于自體骨髓MSC在采集后需要經(jīng)過較長時間才能夠生長到一定數(shù)量，因此可能錯過最佳治療時機。相對而言，MNC則不需要體外培養(yǎng)，可在任何需要的時間移植。骨髓MNC中含有成熟細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等)，還有多種干、祖細(xì)胞(如CD34+造血干細(xì)胞的含量約2%～3%)，這些干、祖細(xì)胞具有分化成為心肌、血管內(nèi)皮等細(xì)胞類型的能力，甚至具有一定程度分化成為神經(jīng)元的能力。此外，MNC還具有很強的旁分泌能力，可為損傷或新生的組織細(xì)胞提供多種重要的營養(yǎng)物質(zhì)和保護因子，促進(jìn)缺血區(qū)組織的修復(fù)[4]；而且有報道MNC也具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力[5]。目前尚未見關(guān)于MSC和MNC經(jīng)靜脈移植后療效和療效產(chǎn)生機制的比較，本研究采用來自相同標(biāo)本的MSC和MNC，比較了其移植后的療效和抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，以及促使大鼠產(chǎn)生營養(yǎng)因子兩方面的差別，以期為今后的臨床應(yīng)用提供參考。

材料和方法

標(biāo)本來源 人骨髓來自產(chǎn)科外傷致流產(chǎn)的胎兒，周齡18～20周，本研究經(jīng)杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得產(chǎn)婦知情同意書。

實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠160只，體質(zhì)量280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SYXK(京)2014- 0014，大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食。動物實驗分4部分，每部分40只大鼠，再隨機分為4組，具體為：(1)假手術(shù)組；(2)缺血對照組：在缺血后經(jīng)尾靜脈給予生理鹽水；(3)MSC組：缺血后經(jīng)尾靜脈給予MSC；(4)MNC組：缺血后經(jīng)尾靜脈給予MNC；每組10只。第1部分實驗對比移植后2 d的梗死體積，第2部分實驗采用免疫組織化學(xué)染色鑒定移植后7 d小膠質(zhì)細(xì)胞激活；第3、4部分實驗檢測移植后3、7 d各組動物腦內(nèi)營養(yǎng)性細(xì)胞因子的含量。 動物行為學(xué)評價在第3、4部分實驗進(jìn)行。

主要試劑及儀器 DMEM低糖、DMEM Alpha、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺、0.05%胰酶、DPBS購自美國Life Technology公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天根公司；人MSC流式鑒定抗體試劑盒，MNC 流式鑒定抗體CD3、CD19和CD56抗體均購自美國BD公司；大鼠膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的ELISA檢測試劑盒購自美國BD公司；抗小膠質(zhì)細(xì)胞Iba- 1抗體購自美國Cell signaling公司；刀豆蛋白A、2，3，5一氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-tetrazolium chloride，TTC)購自美國Sigma公司；腦組織勻漿液購自美國Invitrogen公司。超凈工作臺、培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，TS100型相差顯微鏡購自日本Nikon公司，白洋離心機購自白楊公司，3500全波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，小動物麻醉機購自美國Surgivet公司，手術(shù)顯微鏡、4000B熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

胎兒骨髓MSC的提取 無菌條件下分離自然流產(chǎn)胎兒的肱骨、股骨和脛骨，用DMEM低糖沖洗到培養(yǎng)皿中，過200目篩網(wǎng)，去除殘渣和組織塊并且細(xì)胞計數(shù)，1200 r/min(r=14.5 cm)離心3 min；完全培養(yǎng)基(DMEM 低糖+10%FBS)重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度大約為1×106/ml培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，輕輕晃動培養(yǎng)皿，去掉未貼壁細(xì)胞，DPBS清洗2次，加入完全培養(yǎng)基；以后每天半換液，待細(xì)胞長到90% 融合度時，用0.05%胰酶傳代。取生長狀態(tài)良好，第3～5代生長狀態(tài)穩(wěn)定的MSC進(jìn)行表面抗原流式細(xì)胞儀鑒定，按照流式抗體操作說明進(jìn)行。

人骨髓MSC的流式鑒定 取生長狀態(tài)良好，第3～5代生長狀態(tài)穩(wěn)定的MSC。用胰酶消化成單細(xì)胞并計數(shù)，接種1×104細(xì)胞到12孔板，正常生長培養(yǎng)基(αMEM+10%FBS)培養(yǎng)2～3 d，按照MSC表面標(biāo)志抗體檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測。

人骨髓MNC分離和鑒定 取流產(chǎn)胚胎的四肢骨，用6 ml DPBS沖出骨髓血，緩慢疊加在淋巴細(xì)胞分離液上面，使兩者之間形成清晰的界面，2000 r/min(r=14.5 cm)離心20 min。離心完畢后，離心管中會出現(xiàn)數(shù)個液體層，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞沉積于管底，中間是淋巴細(xì)胞分離液層，最上層是血漿層，MNC密集在血漿層和分離液的交界處，為白色云霧狀。用吸管將這些云霧狀細(xì)胞吸取到15 ml離心管中，加入15 ml PBS，1500 r/min(r=14.5 cm)離心10 min后去掉上清，用完全培養(yǎng)基(DMEM 1640+10%FBS+刀豆蛋白A)重懸培養(yǎng)。本實驗計數(shù)后不經(jīng)過培養(yǎng)直接移植。為對MNC進(jìn)行鑒定，培養(yǎng)1周內(nèi)的MNC用流式細(xì)胞儀檢測其中表達(dá)CD3、CD19和CD56的細(xì)胞比例。為進(jìn)一步確定流式細(xì)胞儀鑒定的有效性，我們選擇抗CD3流式抗體對MNC進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。培養(yǎng)1周內(nèi)的MNC接種于0.01%多聚鳥氨酸鋪底的24孔板，次日多聚甲醛固定，免疫熒光染色方法與Iba- 1抗體染色相同。

動物模型的制備 采用遠(yuǎn)端大腦中動脈梗阻(distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)模型[6]，具體為：開顱電凝大腦中動脈遠(yuǎn)端使其閉合，并夾閉雙側(cè)頸總動脈30 min。假手術(shù)組不對大腦中動脈遠(yuǎn)端進(jìn)行凝斷操作，也不夾閉雙側(cè)頸總動脈，其余步驟與模型組相同。缺血對照組在梗死后1 h經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水，細(xì)胞治療組于腦缺血后1 h經(jīng)尾靜脈注入106個人類骨髓MSC或MNC。

梗死體積測定 于腦梗死后48 h將大鼠麻醉后直接取腦，去除小腦和嗅球，將大腦放在冰預(yù)冷的平皿上從前向后每隔2 mm切1片，通常切成6～7片。將切片置于2% TTC中染色，37 ℃ 20 min后拍照。染色完成后采用Image J圖像分析軟件計算大鼠腦梗死體積，具體為：首先計算出每個腦片的梗死面積，為避免因腦水腫產(chǎn)生數(shù)據(jù)誤差，采用如下公式：梗死體積=(對側(cè)半球面積-患側(cè)正常腦組織面積)×腦片厚度，然后計算相對梗死體積，相對梗死體積=梗死總體積/對側(cè)半球總體積。

行為學(xué)測試

肢體放置實驗：采用觸覺誘發(fā)肢體放置以評測實驗動物的運動感覺完整性，具體方法為：實驗者握住大鼠軀干，使其前爪懸空。此時動物位于桌子側(cè)方，自桌面上方10 cm處向桌面下方10 cm緩慢垂直移動，經(jīng)過桌面時大鼠胡須觸及桌面，大鼠正常反應(yīng)為前肢即刻搭向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應(yīng)延遲甚至無反應(yīng)[7-8]。各組動物損傷對側(cè)前肢測試10次，正常反應(yīng)次數(shù)所占比例作為統(tǒng)計依據(jù)。

平衡木實驗：平衡木為1根，截面為2 cm寬的正方形，長1.2 m，離地面30 cm高度。平衡木一端放置強光源，另一端放置鼠籠，大鼠由光源端向?qū)?cè)行走。正式實驗前需對大鼠進(jìn)行2～4 d的行為學(xué)訓(xùn)練，使每只大鼠均可在20 s內(nèi)順利通過平衡木。各組間的差異對比根據(jù)為損傷對側(cè)前肢的滑落步數(shù)/四肢總步數(shù)[9]。

大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Iba- 1染色和定量分析 大鼠腦梗死模型細(xì)胞移植后7 d，深麻醉后4%多聚甲醛灌注固定，40 μm厚度連續(xù)冰凍切片；切片用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗2次，使用含有0.3% Triton X- 100的PBS孵育30 min，封閉液(含有1.5%山羊血清和1% BSA的0.01 mol/L PBS緩沖液)室溫孵育1 h，含有Anti-Iba-1抗體的封閉液4 ℃孵育過夜；次日，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，含有Cy3熒光標(biāo)記二抗(1∶200)的封閉液室溫孵育1 h，0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，100 ng/ml DAPI的PBS溶液做細(xì)胞核染色15 min，0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，含10%甘油的0.01 mol/L PBS溶液封片。

本研究采用的dMCAO模型梗死灶在頂葉皮層，選擇皮層下方的紋狀體區(qū)用以檢測梗死灶周邊小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。用Image J 軟件標(biāo)記損傷側(cè)側(cè)腦室外側(cè)200 μm范圍，并計算檢測范圍內(nèi)Iba- 1染色的豐度。梗死后輸注鹽水的對照組、梗死后移植組分別和假手術(shù)組的豐度值比較所得的比值為相對豐度[10- 11]。

大鼠腦梗死周邊區(qū)GDNF、BDNF的ELISA檢測 大鼠腦梗死模型細(xì)胞移植后7 d，深麻醉后立即取腦，再取梗死區(qū)皮層下方紋狀體區(qū)腦組織，4 ℃預(yù)冷的PBS洗掉血漬，用濾紙吸掉PBS，加入組織勻漿液充分勻漿，4 ℃ 15 000 r/min(r=14.5 cm)離心1 h，取上清。按照ELISA試劑盒的要求檢測腦組織中GDNF、BDNF的含量。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

體外原代培養(yǎng)人骨髓MSC生長狀況 分離的原代人骨髓MSC培養(yǎng)3～5 d，可見有梭形、多角形細(xì)胞貼壁。去除非貼壁細(xì)胞后，進(jìn)一步增殖成為形態(tài)相對均一的梭形細(xì)胞。原代培養(yǎng)第10～12天，細(xì)胞達(dá)80%融合，此時即可進(jìn)行0.05%胰酶消化并按1∶3傳代，之后每3～5 d需要傳代1次(圖1A)。一般傳至4～6代后細(xì)胞總量可達(dá)3×107個，能滿足成批移植實驗需要。

人骨髓MNC的狀況 從骨髓中分離得到MNC，存活率均大于90%。分離出的MNC的形態(tài)和淋巴細(xì)胞類似，為圓形或者近似紡錘形，透光度較好(圖1G)。 本實驗所用的MNC不經(jīng)過培養(yǎng)，分離完畢后直接輸注給大鼠。

人骨髓MSC和MNC細(xì)胞表面標(biāo)志抗原檢測結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測第3代人骨髓MSC結(jié)果顯示，培養(yǎng)出的骨髓MSC細(xì)胞表面可表達(dá)CD90、CD73、CD44、CD105(圖1 B～E)，檢測細(xì)胞的陽性率都高于95%；不表達(dá)CD34、CD19、CD45、CD11b和主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅱ類分子—人類白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen-antigen D related，HLA-DR)(圖1F)。MNC中含有約70% CD3陽性淋巴細(xì)胞，15% CD19陽性B細(xì)胞和15% CD56陽性NK細(xì)胞(圖1 H～J)。CD3 抗體染色結(jié)果顯示，貼壁的MNC中部分為CD3陽性細(xì)胞 (圖1 K)，與光鏡圖合并后計數(shù)可見CD3陽性細(xì)胞比例接近70%(圖1 L)。

各組大鼠腦梗死體積的變化情況 術(shù)后48 h，處死大鼠取腦并立即進(jìn)行TTC染色，結(jié)果顯示，假手術(shù)組沒有明顯腦梗死(圖2A)，缺血對照組、MSC組和MNC組均出現(xiàn)頂顳葉白色梗死灶(圖2B～D)，其相對梗死體積分別為(37.85±4.40)%、(33.41±3.82)%和(30.23±3.63)%，其中，MSC組(t=2.100，P=0.034)和MNC組(t=2.109，P=0.0009)顯著低于缺血對照組，MNC組顯著低于MSC組(t=1.743，P=0.043)。

各組大鼠早期運動功能的恢復(fù)情況

肢體放置實驗檢測結(jié)果：移植后1 d，缺血對照組的肢體放置成功率為(4.32±0.71)%，明顯低于假手術(shù)組的(9.73±0.36)%(t=2.178，P=8.61×10-11)；MSC組和MNC組分別為(5.09±0.62)%(t=2.1009，P=0.024)和(5.90±0.68)%(t=2.1008，P=0.0001)，明顯高于缺血對照組；MNC組又明顯高于MSC組(t=2.1009，P=0.0165)。移植后3 d，MNC組的肢體放置成功率為(6.91±1.10)%，明顯高于缺血對照組的(5.80±0.82)%(t=2.110，P=0.027)；MSC組為(6.30±0.77)%，與缺血對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.101，P=0.199)(表1)。

MSC：間充質(zhì)干細(xì)胞；MNC：單個核細(xì)胞

MSC：mesenchymal stem cell；MNC： mononuclear cell

A. 培養(yǎng)第3～5代的人骨髓MSC呈現(xiàn)紡錘形；B～F.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)的第3～5代人骨髓MSC為CD90、CD73、CD44、CD105陽性，而CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR陰性；G.分離后的MNC光鏡下形態(tài)；H～J.MNC中CD3陽性淋巴細(xì)胞、CD19陽性B細(xì)胞、CD56陽性NK細(xì)胞的百分率分別為70%、14%、15%；K.貼壁培養(yǎng)的MNC的CD3抗體染色；L.光鏡和CD3 抗體免疫熒光染色的合并圖

A.the spindle morphology of MSC at passages 3- 5；B-F. the cytometry test shows that human MSC are positive for CD90，CD73，CD44，and CD105 and negative for CD34，CD19，CD45，CD11b，and HLA-DR； G. the MNC culture after isolation；H-J.in the population of MNC，the percentages of CD3+lymphocyte，CD19+B cell，and CD56+NK cell are 70%，14%，and 15%；K. CD3 staining(green) of cultured MNC；L. merged image of phase contrast and CD3 staining

圖 1 人骨髓MSC、MNC培養(yǎng)及鑒定

Fig 1 Culture and identification of human bone marrow MSC and MNC

A.假手術(shù)組；B.缺血對照組；C.MSC組；D.MNC組A.Sham group； B.ischemia control group； C. MSC group； D.MNC group

圖 2 各組大鼠腦梗死體積的變化情況

Fig 2 Change of the volume of cerebral ischemia in each groups

平衡木實驗檢測結(jié)果：假手術(shù)組手術(shù)前后都能正確無誤地走完平衡木。移植后1 d，MSC組和MNC組損傷對側(cè)前肢錯步數(shù)占總步數(shù)的百分比分別為(5.56±0.86)%(t=2.120，P=0.020)和(5.13±0.95)%(t=2.131，P=0.003)，明顯低于缺血對照組的(6.47±0.61)%；MSC組和MNC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.101，P=0.320)。移植后3 d，MNC組損傷對側(cè)前肢錯步數(shù)占總步數(shù)的百分比為(4.34±0.58)%，明顯低于缺血對照組的(5.31±0.65)%(t=2.100，P=0.006)和MSC組的(4.92±0.53)%(t=2.100，P=0.041)，MSC組與缺血對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.109，P=0.139)(表1)。

Iba- 1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞檢測結(jié)果 Iba- 1染色結(jié)果顯示，紋狀體區(qū)Iba- 1抗體識別的小膠質(zhì)細(xì)胞，除偶有散在的阿米巴樣細(xì)胞外，更大量的是枝杈狀染色陽性細(xì)胞，假手術(shù)組紋狀體區(qū)有散在Iba- 1染色(圖3A)，缺血對照組則顯著增強(圖3B)，給予細(xì)胞移植的治療組的Iba- 1染色都明顯減弱(圖3C、D)。

假手術(shù)組、缺血對照組、MSC組和MNC組的Iba- 1相對豐度分別為1.00±0.00、1.72±0.21、1.23±0.08和1.48±0.06，其中，缺血對照組顯著升高，為假手術(shù)組的(1.72±0.21)倍(t=2.262，P=2.9×10-6)，MSC組則降低至假手術(shù)組的(1.23±0.08)倍，比缺血對照組顯著降低(t=2.178，P=3.91×10-5)，MNC組降低至假手術(shù)組的(1.48±0.06)倍，比缺血對照組顯著降低(t=2.200，P=0.007)，MSC組和MNC組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.120，P=7.09×10-6)。

表 1 大鼠行為學(xué)測試檢測結(jié)果(n=10，x-±s，%)

MSC:間充質(zhì)干細(xì)胞；MNC:單個核細(xì)胞；與缺血對照組比較，at=2.1009，P=0.024；bt=2.1008，P=0.0001；dt=2.110，P=0.027；et=2.120，P=0.020；ft=2.131，P=0.003；gt=2.100，P=0.006；與MSC移植組比較，ct=2.1009，P=0.0165；ht=2.100，P=0.041

MSC:mesenchymal stem cell；MNC:mononuclear cell;at=2.1009，P=0.024；bt=2.1008，P=0.0001；dt=2.110，P=0.027；et=2.120，P=0.020；ft=2.131，P=0.003；gt=2.100，P=0.006 compared with ischemia vehicle group；ct=2.1009，P=0.0165；ht=2.100，P=0.041 compared with MSC group

Lv： 側(cè)腦室；移植后第7天，紋狀體Lv周邊紅色為大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Iba- 1染色，藍(lán)色為細(xì)胞核DAPI染色

Lv： lateral ventricle；the red staining around lateral ventricle was Iba- 1 and blue was DAPI

A.假手術(shù)組；B.缺血對照組；C.MSC組；D.MNC組

A.sham group； B.ischemia control group； C.MSC group； D.MNC group

圖 3 小膠質(zhì)細(xì)胞Iba- 1染色結(jié)果

Fig 3 Staining of microglia specific Iba- 1

各組GDNF和BDNF的檢測結(jié)果 移植后3 d，MSC組的BDNF和GDNF分別為(531.127±73.176)pg/mg蛋白(t=2.109，P=0.003)和(127.780±16.733)pg/mg蛋白(t=2.100，P=2.76×10-5)，均明顯高于缺血對照組的(401.988±89.006)pg/mg蛋白和(86.278±14.832)pg/mg；MNC組分別為(627.429±65.646)pg/mg蛋白(t=2.109，P=0.010)和(153.117±20.443)pg/mg蛋白(t=2.144，P=0.017)，均明顯高于MSC組。移植后7 d，MSC組的BDNF和GDNF分別為(504.776±83.282)pg/mg蛋白(t=2.101，P=0.005)和(81.641±11.019)pg/mg蛋白(t=2.100，P=0. 002)，均明顯高于缺血對照組的(389.257±70.440)pg/mg蛋白和(64.322±9.854) pg/mg；MNC組分別為(589.068±63.323)pg/mg蛋白(t=2.100，P=0.027)和(102.161±19.932)pg/mg蛋白(t=2.144，P=0.017)，也均明顯高于MSC組(表2)。

表 2 各組BDNF和GDNF檢測結(jié)果的比較(n=10，x-±s，pg/mg蛋白)

BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；GDNF：膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；與缺血對照組比較，at=2.109，P=0.003；ct=2.100，P=2.76×10-5；et=2.101，P=0.005；gt=2.100，P=0.002；與MSC組比較，bt=2.109，P=0.010；dt=2.144，P=0.017；ft=2.100，P=0.027；ht=2.144，P=0.017

BDNF：brain derived neurotrophic factor；GDNF：glia derived neurotrophic factor；at=2.109，P=0.003；ct=2.100，P=2.76×10-5；et=2.101，P=0.005；gt=2.100，P=0.002 compared with ischemia vehicle group；bt=2.109，P=0.010；dt=2.144，P=0.017；ft=2.100，P=0.027；ht=2.144，P=0.017 compared with MSC group

討 論

腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是腦梗死后腦內(nèi)組織損傷的重要機制之一，化合物抗炎藥物的作用不能受到反饋調(diào)節(jié)，而且會有心血管意外發(fā)生率升高等不良反應(yīng)。向梗死區(qū)域補充細(xì)胞因子則能有效保護受到缺血缺氧損傷的神經(jīng)細(xì)胞，但通過靜脈向患者腦內(nèi)補充細(xì)胞因子面臨血腦屏障的阻礙，而且無法實現(xiàn)持續(xù)不斷的供應(yīng)。

現(xiàn)已經(jīng)明確MSC具有抗炎作用，可降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，且MSC的抗炎作用可受到體內(nèi)炎癥反應(yīng)強度的調(diào)節(jié)，因為MSC需要被體內(nèi)一定水平的炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrocis factorα，TNFα)、干擾素γ等激活才能發(fā)揮抑制淋巴細(xì)胞增殖、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生促炎癥因子的作用，當(dāng)腦內(nèi)炎癥因子濃度下降，MSC不會無限制地抑制宿主的免疫功能[12]。此外，MSC和MNC都具有持續(xù)產(chǎn)生營養(yǎng)性細(xì)胞因子的能力[13]，可以在體內(nèi)持續(xù)促進(jìn)宿主腦內(nèi)產(chǎn)生營養(yǎng)因子。MSC和MNC移植治療大鼠腦梗死都已有相關(guān)研究[14]，但兩者的直接比較還鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞都有減小dMCAO大鼠梗死體積的作用，但MNC在減小梗死體積方面效果更好。

本研究采用的dMCAO模型與線栓法模型相比動物行為學(xué)損害較輕，所以用數(shù)種常用的行為學(xué)評價方法都不能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植的療效。例如，根據(jù)Feeney等[15]的平衡木實驗方法，按照大鼠在平衡木上是否能夠保持平衡和走過平衡木來評分，損傷最重為1分：未嘗試在平衡木上平衡而直接跌落；最輕為7分：順利走過平衡木，癱瘓側(cè)肢體完全起作用。本研究觀察到的大鼠評分在6～7分 (能走過平衡木，癱瘓側(cè)肢體起作用大于50%)，經(jīng)過統(tǒng)計檢驗不能發(fā)現(xiàn)各組間的差異，所以我們采用了更加敏感的行為學(xué)測試方法，包括肢體放置實驗[7]和改良的平衡木實驗[9]。結(jié)果顯示，移植后1 d，MNC組和MSC組均顯示出明顯的行為改善，MNC組的改善效果顯著優(yōu)于MSC組；移植后3 d，僅MNC組顯示出明顯的行為改善；移植后5、7 d，MNC組和MSC組均未顯示出明顯的行為改善；提示雖然MSC 和MNC對腦梗死大鼠的行為改善能力僅僅局限在梗死后1～3 d，但MNC對行為的改善強于MSC。

腦內(nèi)炎癥是腦梗死后腦內(nèi)組織損傷的重要機制之一，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度在一定程度上可代表腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的強弱程度。小膠質(zhì)細(xì)胞通常在腦缺血后幾分鐘激活，同時增多促炎癥因子，如白細(xì)胞介素- 1β與TNFα等，可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步活化[16]。在腦缺血再灌注期，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，可減少腦梗死體積，對腦組織起保護作用[17]。本研究采用小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光評估了腦內(nèi)炎癥反應(yīng)強弱，結(jié)果顯示，缺血對照組的Iba- 1豐度顯著升高，為假手術(shù)組的(1.72±0.21)倍；MSC組降低至假手術(shù)組的(1.23±0.08)倍，MNC組降低至假手術(shù)組的(1.48±0.06)倍，MSC組和MNC組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義；提示MSC和MNC均可顯著降低梗死周邊區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，MSC的效果優(yōu)于MNC。

研究顯示，GDNF[1]和BDNF[18]是腦卒中發(fā)生后起到神經(jīng)保護作用的重要細(xì)胞因子。植入細(xì)胞可產(chǎn)生或誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生營養(yǎng)性細(xì)胞因子。目前研究更傾向于認(rèn)為是大鼠源性的營養(yǎng)性細(xì)胞因子在發(fā)揮減輕梗死后腦組織損傷的作用。Karlupia等[11]將5×106個人類臍帶來源的MSC細(xì)胞或者M(jìn)NC經(jīng)動脈植入大鼠，結(jié)果未檢測到明顯的人類來源細(xì)胞因子。本研究移植的細(xì)胞數(shù)量更少，故直接檢測了大鼠源性細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MNC組的BDNF和GDNF水平顯著高于MSC組，提示這些因子的升高很可能是MNC療效比MSC更高的基礎(chǔ)，另外其他哪些細(xì)胞因子也參與了療效產(chǎn)生過程，還有待于進(jìn)一步的實驗說明。

MNC是一個混合體，包括MSC、造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等，其中MSC含量約占全部細(xì)胞的1%，造血干細(xì)胞比例約占有核細(xì)胞的1%～2% 。本研究顯示MNC的療效好于MSC，也有實驗發(fā)現(xiàn)相同數(shù)量MNC比造血干細(xì)胞治療腦梗死的效果更好[11]；所以MNC的療效可能并非由于其中的MSC或造血干細(xì)胞等單一細(xì)胞類型造成。MNC中究竟是什么細(xì)胞發(fā)揮了促使宿主產(chǎn)生細(xì)胞因子或者調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，還需要進(jìn)一步的實驗研究說明。

[1]Crigler L，Robey RC，Asawachaicharn A，et al. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis[J]. Exp Neurol，2006，198(1)：54- 64.

[2]Le Blanc K，F(xiàn)rassoni F，Ball L，et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant，severe，acute graft-versus-host disease： a phase ii study[J]. Lancet，2008，371(9624)：1579- 1586.

[3]Joyce N，Annett G，Wirthlin L，et al. Mesenchymal stem cells for the treatment of neurodegenerative disease[J]. Regenerat Med，2010，5(6)：933- 946.

[4]Sharma S，Yang B，Strong R，et al. Bone marrow mononuclear cells protect neurons and modulate microglia in cell culture models of ischemic stroke[J]. J Neurosci Res，2010，88(13)：2869- 2876.

[5]Hoetzenecker K，Zimmermann M，Hoetzenecker W，et al. Mononuclear cell secretome protects from experimental autoimmune myocarditis[J]. Eur Heart J，2015，36(11)：676- 685.

[6]Bernaudin M，Marti HH，Roussel S，et al. A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(6)： 643- 651.

[7]Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J]. Stroke，2002，33(10)： 2478- 2484.

[8]Geng X，Ren C，Wang T，et al. Effect of remote ischemic postconditioning on an intracerebral hemorrhage stroke model in rats[J]. Neurol Res，2012，34(2)： 143- 148.

[9]Zhao CS，Puurunen K，Schallert T，et al. Effect of cholinergic medication，before and after focal photothrombotic ischemic cortical injury，on histological and functional outcome in aged and young adult rats[J]. Behavioural Brain Res，2005，156(1)： 85- 94.

[10]Chen Z，Phillips LK，Gould E，et al. Mhc mismatch inhibits neurogenesis and neuron maturation in stem cell allografts[J]. PLoS One，2011，6：e14787.doi： 10.1371/journal. pone.0014787.

[11]Karlupia N，Manley NC，Prasad K，et al. Intraarterial transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells is more efficacious and safer compared with umbilical cord mesenchymal stromal cells in a rodent stroke model[J]. Stem Cell Res Ther，2014，5(2)：45. doi： 10.1186/scrt434.

[12]Ren G，Zhang L，Zhao X，et al. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide[J]. Cell Stem Cell，2008，2(2)： 141- 150.

[13]Boomsma RA，Geenen DL. Mesenchymal stem cells secrete multiple cytokines that promote angiogenesis and have contrasting effects on chemotaxis and apoptosis[J]. PLoS One，2012，7：e35685.doi：10.1371/journal.pone.0035685.

[14]Harting MT，Jimenez F，Xue H，et al. Intravenous mesenchymal stem cell therapy for traumatic brain injury[J]. J Neurosurg，2009，110(6)：1189- 1197.

[15]Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al. Responses to cortical injury： I. Methodology and local effects of contusions in the rat[J]. Brain Res，1981，211(1)： 67- 77.

[16]Wen YD，Zhang HL，Qin ZH. Inflammatory mechanism in ischemic neuronal injury[J]. Neurosci Bulletin，2006，22(3)： 171- 182.

[17]Ekdahl CT，Kokaia Z，Lindvall O. Brain inflammation and adult neurogenesis： The dual role of microglia[J]. Neuroscience，2009，158(3)：1021- 1029.

[18]Chen A，Xiong LJ，Tong Y，et al. The neuroprotective roles of bdnf in hypoxic ischemic brain injury[J]. Biomed Rep，2013，1(2)： 167- 176.

Comparsion between Intravenous Delivered Human Fetal Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Mononuclear Cells in the Treatment of Rat Cerebral Infarct

HUANG Ai-hua1，ZHANG Ping-ping1，ZHANG Bin1，MA Bu-qing1，GUAN Yun-qian2，ZHOU Yi-dan1

1Department of Emergency，the Third People’s Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310000，China2Department of Cell Biology，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China

ZHOU Yi-dan Tel： 0571- 87823131，E-mail： zhouyidanf@163.com

Objective To compare the effecacy of human mesenchymal stromal cell (hMSC) with human mononuclear cell (hMNC) in treating rat cerebral infarct.Methods The SD rat models of cerebral infarct were established by distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO). Rats were divided into four groups： sham，ischemia vehicle，MSC，and MNC transplantation groups. For the transplantation group，1×106hMSCs or hMNCs were intravascularly transplanted into the tail vein 1 hour after the ischemia onset. The ischemia vehicle group received dMCAO surgery and intravascular saline injection 1，3，5，and 7 days after the ischemia onset，and then behavioral tests were performed. At 48 h after the ischemia onset，the abundance of Iba- 1，the symbol of activated microglia，was evaluated in the peri-ischemia striatum area； meanwhile，the neurotrophic factors such as glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in ipsilateral peri-ischemia striatum area were also measured. Results The relative infarct volume in ischemia vehicle group，hMSC group，and hMNC transplantation group were (37.85±4.40)%，(33.41±3.82)%，and (30.23±3.63)%，respectively. The infarct volumes of MSC group (t=2.100，P=0.034) and MNC group (t=2.109，P=0.0009) were significantly smaller than that of ischemia vehicle group，and that of MNC group was significantly smaller than that of MSC group (t=1.743，P=0.043). One day after transplantation，the score of ischemia vehicle group in limb placing test was (4.32±0.71)%，which was significantly lower than that in sham group (9.73±0.36)% (t=2.178，P=8.61×10-11). The scores of MSC and MNC group，which were (5.09±0.62)% (t=2.1009，P=0.024) and (5.90±0.68)% (t=2.1008，P=0.0001)，respectively，were significantly higher than that of ischemia vehicle group； also，the score of MNC group was significantly higher than that of MSC group(t=2.1009,P=0.0165). The contralateral forelimb scores of MSC and MNC groups in beam walking test were (5.56±0.86)% (t=2.120，P=0.020) and (5.13±0.95)% (t=2.131，P=0.003)，were both significantly lower than that of ischemia vehicle group [(6.47±0.61)%]. Three days after the transplantation，the limb placing test score of MNC group [(6.91±1.10)%] was significantly higher than that of ischemia vehicle group (5.80±0.82)% (t=2.110，P=0.027). The score of MSC group [(6.30±0.77)%] showed no statistic difference with that of ischemia vehicle group(t=2.101，P=0.199).The contralateral forelimb scores of MNC group in beam walking test [(4.34±0.58)%] was significantly lower than that of ischemia vehicle group [(5.31±0.65)%] (t=2.100，P=0.006) and MSC group [(4.92±0.53)%] (t=2.100，P=0.041)； there was no statistic difference between MSC group and ischemia vehicle group (t=2.109，P=0.139). The relative abundance of Iba- 1 in sham，ischemia vehicle，MSC，and MNC groups was 1.00+0.00，1.72±0.21，1.23±0.08，and 1.48±0.06，respectively. The Iba-1 relative abundance of ischemia vehicle group was significantly higher than that of sham group (t=2.262，P=2.9×10-6). The Iba-1 relative abundances of both MSC (t=2.178，P=3.91×10-5)and MNC (t=2.200，P=0.007)groups were significantly lower than that of ischemia vehicle group. It was also significantly lower in MNC group than in MSC group also (t=2.120，P=7.09×10-6). Three days after transplantation，the BDNF and GDNF levels of MSC group，which were (531.127±73.176)pg/mg (t=2.109，P=0.003)and(127.780±16.733)pg/mg(t=2.100，P=2.76×10-5)，respectively，were significantly higher than those of ischemia vehicle group，which were (401.988±89.006)pg/mg and (86.278±14.832) pg/mg，respectively. The BDNF and GDNF levels of MNC group，which were (627.429±65.646)pg/mg (t=2.144，P=0.017) and (153.117±20.443)pg/mg (t=2.109，P=0.010)，respectively，were all significantly higher than that of MSC group. At day 7，the BDNF and GDNF levels of MSC group，which were (504.776±83.282)pg/mg (t=2.101，P=0.005) and (81.641±11.019)pg/mg (t=2.100，P=0.002)，respectively，were significantly higher than those of ischemia vehicle group，which were (389.257±70.440)pg/mg and (64.322±9.855) pg/mg，respectively. The BDNF and GDNF levels of MNC group，which were (589.068±63.323)pg/mg (t=2.100，P=0.027) and (102.161±19.932)pg/mg (t=2.144，P=0.017)，respectively，were all significantly higher than that of MSC group. Conclusions Both hMSC and hMNC are beneficial to the ischemia-damaged brain when they are intravascularly transplanted within 1 h after the onset of ischemia. The anti-inflammation ability and secretion of neurotrophic factors are the underlying mechanisms of the therapeutic effects. MNC is more effective than MSC in reducing infarct area and improving behaviors，which might be explained by the fact that MNC induces more GDNF and BDNF in brain than MSC.

cerebral infarct； mesenchymal stromal cell； mononuclear cell； inflammation； microglia； transplantation

杭州市衛(wèi)生局重點項目(2011Z007)和北京市科委健康培育項目(Z111107067311033)Supported by the Hangzhou Health Bureau of Key Projects (2011Z007) and the Beijing Municipal Science and Technology Commission Health Cultivation Project (Z111107067311033)

周逸丹 電話：0571- 87823131，電子郵件： zhouyidanf@163.com

R392.2+8

A

1000- 503X(2016)05- 0497- 10

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.05.002

2015- 08- 29)