于海寧，張 鵬，沈生榮，單偉光

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

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肝素提取中膜分離回收固定化胰蛋白酶的工藝研究

于海寧1，張 鵬1，沈生榮2，單偉光1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

以微濾膜分離肝素酶解液，回收固定化胰蛋白酶，研究蛋白酶重復(fù)提取肝素，具有較大的經(jīng)濟(jì)價值.通過單因素試驗和正交試驗，研究膜組件運行參數(shù)對膜分離回收固定化酶工藝的影響，通過考察肝素透過率、固定化胰蛋白酶攔截率、平均膜通量和膜通量恢復(fù)率為指標(biāo)，獲得膜分離回收固定化胰蛋白酶的最佳工藝條件和清洗陶瓷膜的最佳NaOH濃度.實驗結(jié)果表明：在最佳膜分離條件下，固定化酶和肝素能夠有效分離，平均膜通量達(dá)到656.13 L/(m2·h)，在該條件下回收的固定化胰蛋白酶仍具有良好的活性，可重復(fù)利用.采用最佳的2%NaOH溶液清洗陶瓷膜，陶瓷膜平均通量恢復(fù)至初始通量的97.9%.

肝素；固定化酶；陶瓷膜

肝素(heparin)是一種由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組合的具有不同鏈長的多糖鏈混合物[1].由于具有很強(qiáng)的抗凝血因子Xa和Ⅱa的能力，在抗凝血藥物中肝素使用量最大，占據(jù)一半以上抗凝血類藥物市場份額.肝素原料藥主要從豬的腸黏膜中提取[2].我國每年的牲畜屠宰量十分巨大，擁有極其豐富的肝素原料藥資源，年均粗品肝素出口量占世界領(lǐng)先位置.目前肝素的制備方法主要是鹽析+樹脂吸附法[3].傳統(tǒng)的鹽析法用于肝素提取不但得率低，還會產(chǎn)生大量的含鹽廢水，對環(huán)境造成較大的污染.

近年來，酶解法提取肝素的工藝研究有少量報道[4-6]，具有大幅度減少廢水排放，提取率高的優(yōu)點.單純游離酶對環(huán)境要求較高，且因無法回收而造成生產(chǎn)成本大大提高.與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高、可重復(fù)利用等顯著優(yōu)勢[7-9].膜分離技術(shù)具有節(jié)能、高效、可以在常溫下進(jìn)行、適應(yīng)性強(qiáng)、分離過程不存在相變等諸多優(yōu)勢[10-14]. 本課題組將固定化胰蛋白酶技術(shù)應(yīng)用于肝素提取，胰蛋白酶的穩(wěn)定性提高，且能夠回收重復(fù)利用，可以大大降低酶解法提取肝素的生產(chǎn)成本.將膜分離技術(shù)用于回收肝素酶解液中固定化胰蛋白酶，實現(xiàn)固定化胰蛋白酶連續(xù)提取肝素的方法尚未見報道.筆者首次研究了膜分離肝素酶解液，回收固定化胰蛋白酶的工藝條件，以期為肝素連續(xù)化、清潔化生產(chǎn)提供依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

豬胰蛋白酶和20 nm二氧化硅購自阿拉??；標(biāo)準(zhǔn)綿羊血漿購自上海卒瑞生物科技有限公司；豬小腸由浦江凱瑞生物技術(shù)有限公司提供，其余所用試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

陶瓷膜小試設(shè)備(廈門福美科技有限公司)；85-1磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)； T25DS25均質(zhì)機(jī)(德國IKA公司)；ST16R臺式高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司).

2 實驗方法

將新鮮豬小腸洗凈后刮取腸粘膜，加入一定量蒸餾水勻漿至無明顯顆粒后，加入一定量固定化酶進(jìn)行酶解.提取結(jié)束后使用無機(jī)陶瓷膜對提取液進(jìn)行微濾，收集濾過液，回收濾渣用于下一次重復(fù)提取，工藝流程如圖1所示.

圖1 肝素提取工藝流程Fig.1 Technological process of heparin extraction

2.1 材料預(yù)處理

將新鮮豬小腸洗凈，刮取得豬小腸黏膜.將50，100，200，500，800 nm的陶瓷膜用蒸餾水浸泡24 h后，循環(huán)蒸餾水至水通量穩(wěn)定，備用.

2.2 固定化酶制備

取胰蛋白酶，加入100 mL蒸餾水，攪拌均勻制得酶液.加入納米二氧化硅，m(酶)∶m(載體)=1∶25，在磁力攪拌下固定一段時間，離心，即得固定化酶.采用福林酚法測定蛋白酶活力，參照GB/T 23527—2009《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶制劑附錄B》.

2.3 肝素效價的測定

采用冷凍羊血漿法[15]檢測肝素效價.取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品(185 U/mg)適量，配置成每1 mL含肝素鈉100 U的標(biāo)準(zhǔn)液，臨用時用生理鹽水稀釋至10 U/mL.在試管中加入不同體積的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入1 mL綿羊血漿和0.8 mL 0.25%氯化鈣溶液，上下倒轉(zhuǎn)試管，使內(nèi)容物混和均勻，放入(37±1) ℃水浴中保溫，1 h后取出，當(dāng)試管內(nèi)羊血漿達(dá)到半凝固度時，記錄其所用肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，記為Vstd.同樣方法測定供試品V1/2，供試品的效價單位計算式為

式中：Vstd為血漿達(dá)到半凝固度時肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液加入的體積，μL；Cstd為肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度，U/mL；Vstm為血漿達(dá)到半凝固度時供試品肝素溶液加入的體積，μL；Wsam為供試品質(zhì)量，mg；V為供試品總體積，mL.

2.4 酶 解

將上述的小腸粘膜加入適量蒸餾水后勻漿至無明顯顆粒，用NaOH調(diào)pH=11，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.24%的固定化酶，控制料液比為1∶3.3，46 ℃下酶解5 h，紗布過濾除去殘渣，得肝素酶解液.

2.5 陶瓷膜分離單因素實驗

2.5.1 膜孔徑的選擇

將預(yù)處理的50，100，200，500，800 nm孔徑的陶瓷膜，在壓力0.2 MPa，溫度30 ℃，流速2 m/s過濾肝素酶解液，測定90 min內(nèi)的平均膜通量，檢測濾過液的效價.

2.5.2 操作壓力的選擇

選用800 nm孔徑的陶瓷膜，在0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 MPa的操作壓力下過濾肝素酶解液，測定90 min內(nèi)的平均膜通量.溫度30 ℃，流速2 m/s，pH=11.

2.5.3 溫度的選擇

選用800 nm微濾膜，在30，35，40，45，50 ℃下過濾肝素酶解液，測定90 min內(nèi)的平均膜通量.壓力0.3 MPa，流速2 m/s，pH=11.

2.5.4 流速的選擇

選用800 nm微濾膜，分別在流速1.25，1.5，1.75，2，2.25 m/s的條件下進(jìn)行肝素鈉微濾，測定90 min內(nèi)的平均膜通量.壓力0.3 MPa，溫度40 ℃，pH=11.

2.5.5 料液pH的選擇

將pH分別為7，8，9，10，11的肝素料液過800 nm微濾膜，測定90 min內(nèi)的平均膜通量.壓力0.3 MPa，溫度40 ℃，流速2 m/s.

2.6 正交優(yōu)化膜分離參數(shù)

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取操作壓力、溫度、流速、料液pH作為影響因素，以平均膜通量為指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平正交實驗，正交實驗因素水平設(shè)計如表1所示.

表1 正交實驗因素水平表

Table 1 Factors and levels of orthogonal test

水平A1)/MPaB2)/℃C3)/(m·s-1)D4)10.25351.75920.30402.001030.35452.2511

注：1) 操作壓力；2) 溫度；3) 流速；4) pH值.

2.7 重復(fù)利用固定化酶

將固定化酶回收后，再次酶解肝素，相同條件下重復(fù)5次，檢測每次提取液的肝素效價.

2.8 陶瓷膜的清洗再生

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%，1%，2%，3%的NaOH溶液對陶瓷膜進(jìn)行清洗，計算清洗前后陶瓷膜的水通量，比較不同濃度堿液的清洗效果.

3 結(jié)果與分析

3.1 陶瓷膜分離單因素實驗結(jié)果

由表2可知：膜的孔徑越大，肝素酶解液的平均膜通量越大.當(dāng)膜孔徑為50，100，200 nm時，固定化酶和肝素基本都沒有透過膜；孔徑為500 nm和800 nm時，肝素透過率為79%和92.5%，固定化酶基本被截留.基于分離效率考慮，選擇最佳膜孔徑為800 nm.

表2 膜孔徑對分離效果的影響

由圖2(a)可知：在壓力0.15 ～0.3 MPa之間，壓力越大，膜通量越大；而當(dāng)壓力高于0.3 MPa時，由于過高壓力使膜表面剪切力變小，導(dǎo)致濃差極化現(xiàn)象嚴(yán)重，膜通量反而降低，而且過高的壓力會導(dǎo)致系統(tǒng)運行不穩(wěn)定.因此，本實驗中選擇操作壓力為0.3 MPa.當(dāng)溫度在30～40 ℃之間時，料液溫度越高，膜通量衰減越小，平均膜通量越大.當(dāng)溫度高于40 ℃時，膜通量變化不明顯，而過高的溫度不但會影響肝素的效價，也會導(dǎo)致部分固定化酶失活.因此，本實驗選擇操作料液溫度為40 ℃.

由圖2(b)可知：在一定壓力下，增加膜表面流速，能夠增大膜表面剪切力，降低膜污染的風(fēng)險，增大膜通量.當(dāng)流速在1～2 m/s時，流速越大，膜通量衰減越小，平均膜通量越大.但當(dāng)流速超過2 m/s時，由于流速過大，料液回流時產(chǎn)生大量氣泡，導(dǎo)致肝素酶解液通過膜組件時產(chǎn)生過大的壓力降，影響分離效率，平均膜通量反而下降.因此，本實驗選擇2 m/s作為最佳流速.料液pH值對微濾時的膜通量幾乎沒有影響.由于肝素在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，因此本實驗選擇肝素提取液的pH條件，即pH=11.

圖2 不同因素對平均膜通量的影響Fig.2 Effects of different factors on average volume flow of solution through membrane

3.2 正交實驗結(jié)果

由表3可知：RB>RA>RC>RD，即溫度對肝素酶解液膜分離通量影響最大，操作壓力次之，pH影響最小.在操作壓力的影響中，K2影響最大；在溫度的影響中，K3影響最大，考慮K2與K3接近，溫度過高對肝素效價和固定化酶的活性有較大影響，故選擇K2為最優(yōu)；在流速的影響中，K2影響最大；在pH的影響中，K1，K2，K3幾乎沒有差別，考慮到工藝簡便，選擇K3為最優(yōu).綜上，正交實驗的最優(yōu)組合為A2B2C2D3.

表3 正交實驗結(jié)果

3.3 驗證實驗

用800 nm陶瓷膜在操作壓力0.3 MPa，溫度40 ℃，流速2 m/s，pH 11條件下過濾肝素酶解液，平行進(jìn)行3組實驗，測得平均膜通量分別為656.40，661.82，650.16 L/(m2·h),平均值為656.13 L/(m2·h)，明顯大于正交實驗中的平均膜通量，證明該結(jié)果合理可靠.

3.4 固定化酶重復(fù)利用次數(shù)

固定化酶酶解肝素后回收再次進(jìn)行酶解，重復(fù)5次.重復(fù)提取3次后，肝素提取率下降17.3%，再重復(fù)提取2次，肝素提取率趨于平穩(wěn)，僅下降6.5%，并且由于固定化酶初次回收時會有小部分損失，從而對肝素提取率有一定影響，所以固定化酶重復(fù)酶解肝素的提取效果良好.

3.5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)堿液清洗陶瓷膜效果

由表4可知：被污染的陶瓷膜經(jīng)一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaOH溶液清洗后通量恢復(fù)到一定程度.相比較而言，0.5%NaOH清洗效果最差，通量回復(fù)率達(dá)不到理想的85%的理想值，而2%和3%的NaOH清洗效果都取得了理想效果，而兩者效果差別不大，因此選用2%NaOH溶液可以作為最佳陶瓷膜清洗液.

表4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù) NaOH溶液洗膜效果

4 結(jié) 論

利用膜的選擇透過性，有效地將肝素與固定化酶分離，固定化酶攔截率達(dá)到100%，肝素透過率達(dá)到92.5%；以平均膜通量為指標(biāo)，獲得肝素固定化酶解液最佳分離工藝：使用孔徑為800 nm的陶瓷膜過濾肝素固定化酶解液，在操作壓力0.3 MPa，溫度40 ℃，流速2 m/s，pH=11條件下，平均膜通量達(dá)到656.40 L/(m2·h).使用2%NaOH溶液清洗被污染的陶瓷膜，其通量能恢復(fù)到初始通量的97.9%.本研究對于酶膜耦合技術(shù)在肝素生產(chǎn)上的應(yīng)用，實現(xiàn)肝素連續(xù)化、清潔化生產(chǎn)，降低能耗，解決現(xiàn)階段國內(nèi)肝素生產(chǎn)污染問題有重要意義.

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(責(zé)任編輯：劉 巖)

Research on preparation of heparin with immobilized enzyme combined with membrane technology

YU Haining1, ZHANG Peng1, SHEN Shengrong2, SHAN Weiguang1

(1.College of Pharmaceutical Science， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014， China；2.School of Biosystems Engineering and Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China)

Using microfiltration membrane to separate heparin enzymolysis liquid and retrieve immobilized trypsin has a great economic value. Through single factor experiments and orthogonal experiments, heparin transmittance, trypsin interception rate, average volume flow of solution through membrane and membrane flux recovery rate were used as indicators to investigate the optimal concentration of NaOH and the optimal conditions of membrane separation. The result showed that under the optimal conditions, heparin and trypsin can be separated effectively. The average volume flow of solution through membrane was 656.13 L/(m2·h). Using 2%NaOH, the membrane could recover about 97.9% of the initial flux.

heparin; immobilized enzyme; ceramic membrane

2016-01-13

浙江省科技廳重大科技專項資助項目( 2014C03015)

于海寧(1977—)，女，山東濰坊人，副教授，研究方向為天然藥物，E-mail:yuhaining@zjut.edu.cn.

R931.6

A

1006-4303(2016)05-0515-04